Ultrasonication egy megbízható technika a plazmid DNS töredékére. A pontosan szabályozható amplitúdó, a pulzációs mód és a hőmérséklet-szabályozás az ultrahangos készülék legfontosabb jellemzői a nem káros plazmid töredezettséghez. Ezenkívül bizonyos szerek használata segít megvédeni a plazmid lebomlását. A Hielscher Ultrasonics különféle megoldásokat kínál a kontrollált plazmid töredezettségére egyetlen injekciós üvegből, egyidejűleg számos minta szonikálására, valamint többkútú lemezekre. Tudjon meg többet a sikeres ultrahangos plazmid töredezettségről!

Plazmid nyírás ultrahanggal

Amikor a DNS-mintákat ultrahangos hullámoknak vetik alá, az ultrahanggal generált rezgések akusztikus kavitációt hoznak létre a folyadékban, amely mechanikai erőkkel nyírja vagy megszakítja a nagy molekulatömegű DNS-molekulákat. Az ultrahangos kezelés a legszélesebb körben használt módszer az ömlesztett DNS nyírási kísérletekhez, beleértve az olyan alkalmazásokat is, mint például a kromatin immunprecipitáció (ChIP), amelynek kis fragmensméretei elengedhetetlenek a nagy felbontás eléréséhez. (vö. Tseng et al., 2012)
A plazmid DNS (pDNS) a DNS specifikus formája, amelyet gyűrű alakja jellemez, és baktériumokban és néhány eukariótában található.
A túlhűtött pDNS a plazmid DNS kívánt formája, mivel a legjobb eredményeket mutatja a down-stream folyamatokban, például az automatizált szekvenálásban és a transzfekcióban. Ultrasonication alkalmas a pDNS, beleértve a túlhűtött pDNS-t is, sikeresen töredezett.
Thompson et al. (2008) kimutatta, hogy a plazmid szonikáció, amelyről ismert, hogy a túlhűtött DNS-t széttöredezi, hatékony módja annak, hogy javítsuk a szekvencia phred20 olvasási hosszát, olyannyira, hogy nem különböznek szignifikánsan Beckman Coulter kontrollsablonjától vagy enzimatikusan linearizált plazmidjaitól.

Plazmid vektorok használata

A plazmidokat gyakran használják eszközként a gének klónozására, átvitelére és manipulálására. Ha a plazmidokat kísérletileg használják erre a célra, azokat vektoroknak nevezik. A DNS-fragmensek vagy gének beilleszthetők egy plazmid vektorba, létrehozva egy úgynevezett rekombináns plazmidot. A plazmidvektorokat eszközként használják a rekombináns DNS gazdasejtbe történő meghajtására, és a molekuláris klónozás kulcsfontosságú összetevői.
“A nem vírusos vektorokat széles körben tanulmányozzák a génterápiában való lehetséges felhasználásuk szempontjából különböző bonyolult betegségek kezelésére. A nem vírusos vektorok megvédik a plazmid DNS-t a fizikai, kémiai és enzimatikus lebomlástól, és a DNS-molekulát a célhelyre szállítják. Például a kationos liposzómák, a kitozán és más pozitív töltésű nanorészecskék elektrosztatikus kölcsönhatások révén plazmid DNS-sel komplexeket képeznek. A könnyen képződő kationos liposzómák/plazmid DNS komplexek azonban viszonylag nagyok (azaz 300–400 nm) és heterogén jellegűek, ami megnehezíti a gyógyszerészeti alkalmazásokban való felhasználásukat. A nagy és heterogén plazmid DNS/liposzómák, plazmid DNS/aeroszolok és plazmid DNS/peptid komplexek ultrahanggal kisebb és homogén részecskékké redukálhatók.” (Sarker et al., 2019)
A plazmidvektorok használatának kiemelkedő példája a CRISPR–Cas9. A CRISPR–Cas9 rendszert általában egyetlen nagy plazmidként vagy több kisebb plazmidként juttatják el a sejtekhez, amelyek egy célszekvenciát, egy CRISPR útmutatót és Egy Cas9-et kódolnak.

DNS-sel töltött PLGA Nanorészecskék ultrahangos előkészítése nanoprecipitációval

Jo et al. (2020) poli(tejsav-ko-glikolsav) (PLGA) segítségével nanorészecske-hordozót képezett a CRISPR–Cas9 plazmid modell elsődleges csontvelőből származó makrofágokba történő szállításához. A PLGA nanorészecskék nanoprecipitációjához két különböző végcsoporttal (észter- és amincsoportokkal) rendelkező PLGA-t használtunk azzal a céllal, hogy a pozitív töltésű amin végsapkák növeljék a kapszulázási hatékonyságot és a terhelést a közte és a DNS negatív töltésű gerince közötti töltés kölcsönhatások miatt. Egy 50 ml-es polipropilén kúpos centrifugacsőben 100 mg Pluronic F127-et oldottunk fel 20 ml autoklávozott DI vízben örvénykeveréssel, majd 30 perc gyengéd szonikálással ultrahangos fürdővel (lásd CupHorn). Autoklávozott mágneses keverőrudat adtunk hozzá, és az oldatot 600 ford/perc sebességgel 30 percig kevertük, miközben a többi oldatot elkészítettük. Az üvegáruk helyett mindvégig műanyag laboratóriumi eszközöket használtak a DNS nem specifikus adszorpciójának minimalizálása érdekében. A PLGA DMF-ben (44,48 mg/ml) és a THF-ben oldott TIPS pentakén (0,667 mg/ml) oldatait külön készítettük. A PLGA-t 30 percig nedvesen hagyták a DMF-ben, mielőtt 30 percig szonikálták volna (a teljes protokollért lásd Jo et al., 2020)

Plazmid DNS-védelem az ultrahangos kezelés során

A DNS, beleértve a plazmidokat és a túlhűtött plazmidokat, rendkívül érzékeny lebomlás. Minden rendelkezésre álló töredezettségi módszer ismert bizonyos hátrányok miatt. Az ultrahangos DNS-fragmentáció az egyik előnyben részesített módszer, mivel a szabályozott szonikálás védőintézkedésekkel kombinálva lehetővé teszi a DNS-szálak nyírás- és hő okozta károsodásának csökkentését.
Az ultrahangos DNS nyírás során az alacsony amplitúdó beállítások, a pulzációs mód és a hőmérséklet-szabályozás mellett bizonyos szerek használata jelentős védőhatást mutatott a DNS lebomlása ellen. Például különböző polimerek, peptidek és lipidek védik a plazmid DNS-t az ultrahangos kezelés során.

A plazmid DNS és a plazmid DNS/IL nanokomplexek ultrahangos nyírási stressz elleni stabilitását agaróz gél elektroforézis vizsgálatával vizsgáltuk. Mind a plazmid DNS, mind a plazmid DNS /IL nanokomplexeket ultrahangos nyírófeszültségnek vetették alá különböző időpontokban. A plazmid DNS-t ultrahangos nyírási stressznek volt kitéve 0, 10, 20, 30 és 40 percig. A plazmid DNS/IL nanokomplexeket azonban ultrahangos nyírási stressznek tették ki 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 és 120 percig.
(tanulmány és kép: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) kimutatta, hogy amikor a plazmid DNS / ionos folyadék (pDNS /IL) nanostruktúrákat ultrahangos nyírófeszültségnek vetették alá 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 és 120 percig, és a kereskedelemben kapható kationos génszállító szerrel, a lipofectaminnal komplexálva a fluoreszcens pozitív sejtek százalékos aránya 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65% volt, 65%, illetve 50%(lásd az alábbi ábrát). A fluoreszcens pozitív sejtek százalékos aránya nőtt, amikor a nanostruktúrákat ultrahangos nyírófeszültségnek vetették alá 10 és 20 percig, majd ezt követően lassan csökkentek.

Az ionos folyadék [Bmim][PF6] hatása a plazmid DNS COS7 sejtekbe történő szállítására. A plazmid DNS/IL (ionos folyadék) nanokomplexeket ultrahangos nyírófeszültségnek vetették alá legfeljebb 120 percig, és LA-lel komplexizálták, mielőtt a COS7 sejtekbe kerültek volna. Az adatok a GFP pozitív HeLa sejtek átlagos számát (%) mutatják, amelyeket 10 különböző mikroszkopikus területen számoltak, és a kísérletet három különböző napon többször is elvégezték. (Tanulmány és ábra: ©Sarker et al., 2019)

Ultrahangos lizátum készítmény

Ultrahangos sejt lízis protokoll
Kezdjük egy dúsított sejtmintával, amelyet sejtszekciós módszerrel készítettünk (pl. immunmágneses sejtszétválasztás, fluoreszcencia-aktiválású sejtválogatás (FACS), sűrűséggradiens centrifugálás, immundenzitási sejtizoláció).
A sejtmintáknak a kísérleti célnak megfelelő lízispuffer térfogatát és a szonda típusú ultrasonicatort kell mutatniuk.
A hipotóniás pufferek előnyösek, mivel fokozzák az ultrahangos sejt lízist. Fontos, hogy az adalékanyagokat és a sókoncentrációt megfelelő módon használják.
Válassza ki ultrahangos líziseszközét: Az injekciós üvegek közvetett szonikálásához a VialTweeter vagy a CupHorn ajánlott. Multiwell lemezekhez, az UIP400MTP az ideális ultrahangos készülék. És a klasszikus szonda típusú szonikáció, ultrahangos homogenizátor, mint az UP100H vagy az UP200Ht mikrocsúcsgal a legmegfelelőbb.
Protokoll szonda típusú szonikáláshoz: Helyezze az ultrahangos szondát a minta térfogatába egy mikrocentrifuge csőben, és kb. 10 másodpercig szonikálja. A DNS-mintától függően az ultrahangos kezelés még egy-két alkalommal megismételhető. A szükséges ultrahangos energiabevitel (Ws / ml) a minta viszkozitásától és a DNS típusától függ. A jégfürdőn keresztüli hűtés és az ultrahangos készülék pulzációs módja segít megelőzni, hogy a minta termikusan lebomlik.
Ultrahangos lízis után a mintát centrifugáljuk, hogy szétválasszuk a pellethulladékot (amely nem lizett sejteket, magokat és nem lizált organellákat tartalmaz)
Ha a mintát nem dolgozzák fel azonnal tovább, akkor életképességének megőrzése érdekében megfelelő hőmérsékleten tárolható.

Ultrasonicators a DNS fragmentációhoz

Hielscher Ultrasonics kínál különböző ultrahang-alapú platformok DNS, RNS, és a kromatin fragmentáció. Ezek a különböző platformok közé tartoznak az ultrahangos szondák (szonotródok), közvetett ultrahangos megoldások több cső vagy több kútlemez egyidejű mintavételi előkészítéséhez (pl. 96-kútlemezek, mikrotiter lemezek), szonoreactors és ultrahangos cuphornok. A DNS-nyírás minden platformját frekvenciahangolt, nagy teljesítményű ultrahangos processzorok hajtják, amelyek pontosan szabályozhatók és reprodukálható eredményeket biztosítanak.

Ultrahangos processzorok bármilyen mintaszámhoz és mérethez

A Hielscher többmintás ultrasonicators VialTweeter (legfeljebb 10 kémcsőhöz) és az UIP400MTP (mikrolemezekhez / többcsatornás lemezekhez) segítségével könnyen csökkenthető a minta feldolgozási ideje az intenzív és pontosan szabályozható ultrahangos kezelés miatt, miközben megkapja a kívánt DNS-fragmens méreteloszlást és hozamot. Az ultrahangos DNS-fragmentáció a plazmid-előkészítési lépéseket hatékonnyá, megbízhatóvá és skálázhatóvá teszi. A protokollok lineárisan méretezhetők egyről számos mintára állandó ultrahang paraméterek alkalmazásával.
Az egy-öt ujjal rendelkező szondah ultrasonicatorok ideálisak kisebb mintaszámok előállításához. A Hielscher laboratóriumi ultrahangos készülékei különböző teljesítményszintekkel kaphatók, így kiválaszthatja az ideális ultrahangos diszruptort a DNS-hez kapcsolódó alkalmazásához.