Plazmidok előkészítése ultrahangos kezeléssel

Az ultrahangos kezelés megbízható technika a plazmid-DNS fragmentálására. A pontosan szabályozható amplitúdó, az impulzusüzemmód és a hőmérséklet-szabályozás az ultrahangos készülék legfontosabb jellemzői a plazmidok károsodásmentes fragmentálásához. Emellett bizonyos anyagok használata segít megvédeni a plazmidokat a lebomlástól. A Hielscher Ultrasonics különféle megoldásokat kínál a plazmidok szabályozott fragmentálására egyetlen mintafiolától kezdve számos minta egyidejű ultrahangos kezelésén át a többlyukú lemezekig. Tudjon meg többet a plazmidok sikeres ultrahangos fragmentálásáról!

Plazmidok nyírása ultrahangos kezeléssel

Amikor a DNS-mintákat ultrahanghullámoknak teszik ki, az ultrahang által keltett rezgések akusztikus kavitációt hoznak létre a folyadékban, amely mechanikai erők révén nyírja vagy töri a nagy molekulatömegű DNS-molekulákat. Az ultrahangos kezelés a legszélesebb körben alkalmazott módszer a nagy mennyiségű DNS nyírására irányuló kísérletekben, beleértve az olyan alkalmazásokat, mint a kromatin-immunprecipitáció (ChIP), amelyeknél a kis fragmentumméret elengedhetetlen a nagy felbontás eléréséhez. (vö. Tseng et al., 2012)
A plazmid-DNS (pDNA) a DNS egy sajátos formája, amelyet gyűrűs alakja jellemez, és baktériumokban, valamint egyes eukariótákban fordul elő.
A szupertekercselt pDNA a plazmid-DNS kívánatos formája, mivel ez adja a legjobb eredményeket a későbbi feldolgozási lépésekben, például az automatizált szekvenálásban és a transzfekcióban. Az ultrahangos kezelés alkalmas a pDNA, köztük a szupertekercselt pDNA sikeres fragmentálására.
Thompson et al. (2008) kimutatták, hogy a plazmidok ultrahangos kezelése, amelyről ismert, hogy fragmentálja a szupertekercselt DNS-t, hatékony módszer a phred20 minőségű szekvencialeolvasások hosszának olyan mértékű növelésére, hogy azok már nem különböznek szignifikánsan a Beckman Coulter kontrolltemplátjával vagy az enzimatikusan linearizált plazmidokkal kapott értékektől.

Plazmidvektorok alkalmazása

A plazmidokat gyakran használják gének klónozására, átvitelére és módosítására szolgáló eszközként. Amikor a plazmidokat kísérletekben ezekre a célokra használják, vektoroknak nevezik őket. DNS-fragmentumok vagy gének illeszthetők egy plazmidvektorba, így úgynevezett rekombináns plazmid jön létre. A plazmidvektorokat a rekombináns DNS gazdasejtbe juttatására szolgáló hordozóként használják, és a molekuláris klónozás kulcsfontosságú elemei.
„A nem vírusos vektorokat széles körben vizsgálják különféle összetett betegségek kezelésére irányuló génterápiás alkalmazásuk lehetősége miatt. A nem vírusos vektorok megvédik a plazmid-DNS-t a fizikai, kémiai és enzimatikus lebomlástól, és a DNS-molekulát a célhelyre juttatják. Például a kationos liposzómák, a kitozán és más pozitív töltésű nanorészecskék elektrosztatikus kölcsönhatások révén komplexeket képeznek a plazmid-DNS-sel. A könnyen kialakuló kationos liposzóma/plazmid-DNS komplexek azonban viszonylag nagyok (azaz 300–400 nm méretűek) és heterogének, ami megnehezíti gyógyszerészeti alkalmazásukat. A nagy és heterogén plazmid-DNS/liposzóma, plazmid-DNS/aeroszol és plazmid-DNS/peptid komplexek ultrahangos kezeléssel kisebb, homogén részecskékké alakíthatók.” (Sarker et al., 2019)
A plazmidvektorok alkalmazásának egyik kiemelkedő példája a CRISPR–Cas9. A CRISPR–Cas9 rendszert általában egyetlen nagy plazmid vagy több kisebb plazmid formájában juttatják a sejtekbe, amelyek egy célszekvenciát, egy CRISPR-vezetőszekvenciát és a Cas9-et kódolják.

DNS-sel töltött PLGA-nanorészecskék ultrahangos előállítása nanoprecipitációval

Jo et al. (2020) poli(tejsav-ko-glikolsavat) (PLGA) használtak nanorészecske-hordozó kialakítására egy modell CRISPR–Cas9 plazmid elsődleges, csontvelőből származó makrofágokba juttatásához. A PLGA-nanorészecskék nanoprecipitációjához két különböző végcsoporttal (észter- és amincsoporttal) rendelkező PLGA-t használtak azzal a céllal, hogy a pozitív töltésű aminvégcsoportok a DNS negatív töltésű vázával kialakuló töltéskölcsönhatások révén növeljék a kapszulázási hatékonyságot és a töltési mértéket. Egy 50 mL térfogatú, kúpos polipropilén centrifugacsőben 100 mg Pluronic F127-et oldottak fel 20 mL autoklávozott ionmentes vízben vortexkeveréssel, majd 30 min időtartamú kíméletes ultrahangos kezelést végeztek ultrahangos fürdőben (lásd CupHorn). Autoklávozott mágneses keverőrudat adtak hozzá, és az oldatot 600 RPM fordulatszámon keverték 30 min időtartamig, miközben elkészítették a többi oldatot. A DNS nem specifikus adszorpciójának minimalizálására a teljes eljárás során üvegeszközök helyett műanyag laboratóriumi eszközöket használtak. A DMF-ben oldott PLGA (44,48 mg/ ml) és a THF-ben oldott TIPS pentacén (0,667 mg/ml) oldatait külön készítették el. A PLGA-t 30 min időtartamig keverés nélkül hagyták nedvesedni a DMF-ben, majd 30 min időtartamú ultrahangos kezelésnek vetették alá. (a teljes protokollt lásd Jo et al., 2020)

A plazmid-DNS védelme ultrahangos kezelés során

A DNS, beleértve a plazmidokat és a szupertekercselt plazmidokat, rendkívül érzékeny a lebomlásra. Minden rendelkezésre álló fragmentálási módszernek vannak ismert hátrányai. Az ultrahangos DNS-fragmentálás az előnyben részesített módszerek egyike, mivel a szabályozott ultrahangos kezelés védőintézkedésekkel kombinálva lehetővé teszi a DNS-szálak nyírás és hő által előidézett károsodásának csökkentését.
Az ultrahangos DNS-nyírás során alkalmazott alacsony amplitúdóbeállítások, impulzusüzemmód és hőmérséklet-szabályozás mellett bizonyos anyagok használata jelentős védőhatást mutatott a DNS lebomlásával szemben. Például különféle polimerek, peptidek és lipidek védik a plazmid-DNS-t az ultrahangos kezelés során.

A plazmid-DNS és a plazmid-DNS/IL nanokomplexek ultrahangos nyírófeszültséggel szembeni stabilitását agarózgél-elektroforézises vizsgálattal tanulmányozták. Mind a plazmid-DNS-t, mind a plazmid-DNS/IL nanokomplexeket különböző időtartamokig ultrahangos nyírófeszültségnek tették ki. A plazmid-DNS-t 0, 10, 20, 30 és 40 percig tették ki ultrahangos nyírófeszültségnek. A plazmid-DNS/IL nanokomplexeket viszont 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 és 120 percig tették ki ultrahangos nyírófeszültségnek.
(tanulmány és kép: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) kimutatták, hogy amikor a plazmid-DNS / ionos folyadék (pDNA/IL) nanoszerkezeteket 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 és 120 min időtartamig ultrahangos nyírófeszültségnek tették ki, és a kereskedelmi forgalomban kapható kationos génbeviteli anyaggal, lipofektaminnal komplexálták, a fluoreszcencia-pozitív sejtek aránya rendre 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% és 50% volt (lásd az alábbi diagramot). A fluoreszcencia-pozitív sejtek aránya nőtt, amikor a nanoszerkezeteket 10 és 20 min időtartamig ultrahangos nyírófeszültségnek tették ki, majd ezt követően lassan csökkent.

Az ionos folyadék [Bmim][PF6] hatása a plazmid-DNS COS7 sejtekbe juttatására. A plazmid-DNS/IL (ionos folyadék) nanokomplexeket legfeljebb 120 percig ultrahangos nyírófeszültségnek tették ki, és LA-val komplexálták, mielőtt a COS7 sejtekbe juttatták őket. Az adatok a 10 különböző mikroszkópos látómezőben megszámolt GFP-pozitív HeLa-sejtek átlagos számát (%) mutatják, és a kísérletet három különböző napon többször is elvégezték. (Tanulmány és diagram: ©Sarker et al., 2019)

Lizátum előállítása ultrahanggal

Ultrahangos sejtlízis protokollja
Kezdje egy sejtdúsított mintával, amelyet valamilyen sejtszeparálási módszerrel készítettek elő (például immunmágneses sejtszeparálással, fluoreszcenciaaktivált sejtválogatással (FACS), sűrűséggradiens-centrifugálással vagy immunsűrűség-alapú sejtizolálással).
A sejtmintáknak a kísérleti célnak és a szondás ultrahangos készüléknek megfelelő térfogatú lízispuffert kell tartalmazniuk.
A hipotóniás pufferek előnyösebbek, mivel fokozzák az ultrahangos sejtlízist. Fontos az adalékanyagok megfelelő alkalmazása és a sókoncentráció megfelelő megválasztása.
Válassza ki az ultrahangos sejtlízishez használandó készüléket: a mintafiolák közvetett ultrahangos kezeléséhez a VialTweeter vagy a CupHorn ajánlott. Többlyukú lemezekhez az UIP400MTP az ideális ultrahangos készülék. A hagyományos szondás ultrahangos kezeléshez pedig egy mikroheggyel ellátott ultrahangos homogenizátor, például az UP100H vagy az UP200Ht a legalkalmasabb.
A szondás ultrahangos kezelés protokollja: Helyezze az ultrahangos készülék szondáját a mikrocentrifugacsőben lévő mintába, és végezzen ultrahangos kezelést körülbelül 10 másodpercig. A DNS-mintától függően az ultrahangos kezelés még egyszer vagy kétszer megismételhető. A szükséges ultrahangos energiabevitel (Ws/mL) a minta viszkozitásától és a DNS típusától függ. A jégfürdővel történő hűtés és az ultrahangos készülék impulzusüzemmódja segít megelőzni a minta hő okozta lebomlását.
Az ultrahangos lízis után a mintát centrifugálják, hogy elkülönítsék az üledékben lévő törmeléket (amely nem lizált sejteket, sejtmagokat és nem lizált sejtorganellumokat tartalmaz).
Ha a mintát nem dolgozzák fel azonnal tovább, életképességének megőrzése érdekében megfelelő hőmérsékleten tárolható tárolható.

Ultrahangos készülékek DNS-fragmentáláshoz

A Hielscher Ultrasonics különféle ultrahang-alapú platformokat kínál DNS, RNS és kromatin fragmentálására. Ezek a különböző platformok ultrahangos szondákat (szonotródákat), több cső vagy többlyukú lemez (például 96 lyukú lemezek, mikrotiterlemezek) egyidejű minta-előkészítésére szolgáló közvetett ultrahangos kezelési megoldásokat, ultrahangos reaktorokat és ultrahangos csészeszonotródákat foglalnak magukban. A DNS nyírására szolgáló valamennyi platformot frekvenciára hangolt, nagy teljesítményű ultrahangos processzorok működtetik, amelyek pontosan szabályozhatók és reprodukálható eredményeket biztosítanak.

Ultrahangos processzorok bármilyen mintaszámhoz és mintamérethez

A Hielscher több minta kezelésére szolgáló VialTweeter (legfeljebb 10 kémcsőhöz) és UIP400MTP (mikrolemezekhez/ többlyukú lemezekhez) ultrahangos készülékeivel az intenzív és pontosan szabályozható ultrahangos kezelés révén könnyen csökkenthető a mintafeldolgozás ideje, miközben elérhető a DNS-fragmentumok kívánt méreteloszlása és hozama. Az ultrahangos DNS-fragmentálás hatékonnyá, megbízhatóvá és skálázhatóvá teszi a plazmid-előkészítés lépéseit. Állandó ultrahangos paraméterek alkalmazásával a protokollok egyetlen mintáról számos mintára lineárisan skálázhatók.
Az egy–öt ujjal rendelkező szondás ultrahangos készülékek ideálisak kisebb számú minta előkészítésére. A Hielscher laboratóriumi ultrahangos készülékei különböző teljesítményszintekkel érhetők el, így kiválaszthatja a DNS-sel kapcsolatos alkalmazásához ideális ultrahangos feltáró készüléket.