Plazmid készítmény ultrahangos kezeléssel

Az ultrahangos kezelés megbízható technika a plazmid DNS fragmentálására. Pontosan szabályozható amplitúdó, pulzálási mód és hőmérséklet-szabályozás az ultrahangos készülék legfontosabb jellemzői a nem káros plazmid töredezettséghez. Ezenkívül bizonyos szerek használata segít megvédeni a plazmid lebomlását. A Hielscher Ultrasonics különböző megoldásokat kínál az egyes injekciós üvegekből származó szabályozott plazmidtöredezettségre, egyidejűleg számos minta ultrahangos kezelésére, valamint több lyukú lemezekre. Tudjon meg többet a sikeres ultrahangos plazmid töredezettségről!

Plazmid nyírás ultrahangos kezeléssel

Amikor a DNS-mintákat ultrahangos hullámoknak vetik alá, az ultrahanggal generált rezgések akusztikus kavitációt hoznak létre a folyadékban, amely mechanikai erőkkel nyírja vagy megszakítja a nagy molekulatömegű DNS-molekulákat. A szonikálás a legszélesebb körben használt módszer az ömlesztett DNS-nyírási kísérletekhez, beleértve az olyan alkalmazásokat, mint például a kromatin immunprecipitáció (ChIP), amelyhez a kis töredékméretek feltétlenül szükségesek a nagy felbontás eléréséhez. (vö. Tseng et al., 2012)
A plazmid DNS (pDNS) a DNS specifikus formája, amelyet gyűrű alakja jellemez, és baktériumokban és néhány eukariótában található.
A szupertekercselt pDNS a plazmid DNS kívánt formája, mivel a legjobb eredményeket mutatja az olyan lefelé irányuló folyamatokban, mint az automatizált szekvenálás és transzfekció. Az ultrahangos kezelés alkalmas a pDNS fragmentálására, beleértve a szupertekercselt pDNS-t is, sikeresen.
Thompson et al. (2008) kimutatta, hogy a plazmid szonikáció, amelyről ismert, hogy a szupertekercselt DNS-t fragmentálja, hatékony módja annak, hogy javítsa a szekvencia phred20 olvasási hosszát arra a pontra, hogy azok nem különböznek szignifikánsan a Beckman Coulter kontrollsablonjától vagy enzimatikusan linearizált plazmidjaitól.

Plazmidvektorok használata

A plazmidokat gyakran használják eszközként a gének klónozására, átvitelére és manipulálására. Amikor a plazmidokat kísérleti jelleggel használják erre a célra, vektoroknak nevezik őket. A DNS-fragmensek vagy gének beilleszthetők egy plazmidvektorba, létrehozva egy úgynevezett rekombináns plazmidot. A plazmidvektorokat vivőanyagként használják a rekombináns DNS gazdasejtbe juttatására, és a molekuláris klónozás kulcsfontosságú összetevői.
“A nem vírusos vektorokat széles körben tanulmányozzák a génterápiában való potenciális felhasználásuk szempontjából különböző bonyolult betegségek kezelésére. A nem vírusvektorok védik a plazmid DNS-t a fizikai, kémiai és enzimatikus lebomlástól, és szállítják a DNS-molekulát a célhelyre. Például a kationos liposzómák, a kitozán és más pozitív töltésű nanorészecskék elektrosztatikus kölcsönhatások révén komplexeket képeznek a plazmid DNS-sel. A könnyen képződő kationos liposzómák/plazmid DNS komplexek azonban viszonylag nagyok (azaz 300–400 nm) és heterogén jellegűek, ami megnehezíti a gyógyszerészeti alkalmazásokban való felhasználásukat. A nagy és heterogén plazmid DNS / liposzómák, plazmid DNS / aeroszolok, és plazmid DNS / peptid komplexek csökkenthetők kisebb, és homogén részecskék ultrahangos kezeléssel.” (Sarker et al., 2019)
A plazmidvektorok használatának kiemelkedő példája a CRISPR–Cas9. A CRISPR–Cas9 rendszert általában egyetlen nagy plazmidként vagy több kisebb plazmidként szállítják a sejtekbe, amelyek egy célszekvenciát, egy CRISPR-útmutatót és Cas9-et kódolnak.

DNS-terhelésű PLGA nanorészecskék ultrahangos előkészítése nanoprecipitációval

Jo et al. (2020) poli(tejsav-koglikolsavat) (PLGA) használt nanorészecske-hordozó kialakításához a CRISPR-Cas9 plazmid modell elsődleges csontvelőből származó makrofágokba történő szállításához. A PLGA nanorészecskék nanoprecipitációjához két különböző végcsoporttal (észter- és amincsoportokkal) rendelkező PLGA-t használtunk azzal a céllal, hogy a pozitív töltésű amin zárósapkák növeljék a kapszulázás hatékonyságát és terhelését a közte és a DNS negatív töltésű gerince közötti töltéskölcsönhatások miatt. Egy 50 ml-es polipropilén kúpos centrifugacsőben 100 mg Pluronic F127-et feloldottunk 20 ml autoklávozott DI vízben örvénykeveréssel, majd 30 perc gyengéd ultrahangos kezeléssel ultrahangos fürdővel (lásd CupHorn). Autoklávozott mágneses keverőrudat adtunk hozzá, és az oldatot 600 fordulat / perc sebességgel 30 percig kevertük, miközben a többi oldatot készítettük. Műanyag laboratóriumi eszközöket használtak az üvegedények helyett, hogy minimalizálják a DNS nem specifikus adszorpcióját. A DMF-ben oldott PLGA-oldatot (44,48 mg/ml) és a THF-ben oldott TIPS-pentacene-oldatot (0,667 mg/ml) külön készítettük. A PLGA-t 30 percig nedvesen hagyták nedvesen DMF-ben, mielőtt 30 percig ultrahanggal kezelték volna. (a teljes protokollt lásd Jo et al., 2020)

Plazmid DNS védelem szonikálás közben

A DNS, beleértve a plazmidokat és a szupertekercselt plazmidokat, nagyon érzékeny lebomlás. Minden rendelkezésre álló töredezettségi módszer ismert bizonyos hátrányokról. Az ultrahangos DNS-fragmentáció az egyik előnyös módszer, mivel az ellenőrzött szonikálás védőintézkedésekkel kombinálva lehetővé teszi a DNS-szálak nyírási és hő okozta károsodásának csökkentését.
Az alacsony amplitúdójú beállítások, pulzálási mód és hőmérséklet-szabályozás mellett az ultrahangos DNS-nyírás során bizonyos szerek használata jelentős védőhatást mutatott a DNS lebomlása ellen. Például különböző polimerek, peptidek, és lipidek védik a plazmid DNS-t az ultrahangos kezelés során.

A plazmid DNS és a plazmid DNS / IL nanokomplexek stabilitását ultrahangos nyírófeszültséggel szemben agarózgél elektroforézis vizsgálattal vizsgáltuk. Mind a plazmid DNS-t, mind a plazmid DNS / IL nanokomplexeket ultrahangos nyírófeszültségnek vetettük alá különböző időpontokban. A plazmid DNS-t ultrahangos nyírófeszültségnek tettük ki 0, 10, 20, 30 és 40 percig. A plazmid DNS / IL nanokomplexeket azonban ultrahangos nyírófeszültségnek tettük ki 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 és 120 percig.
(tanulmány és kép: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) kimutatta, hogy amikor a plazmid DNS / ionos folyadék (pDNS / IL) nanostruktúrákat ultrahangos nyírófeszültségnek vetették alá 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 és 120 percig, és komplexálták a kereskedelemben kapható kationos génszállító szerrel, lipofectaminnal, a fluoreszcens pozitív sejtek százalékos aránya 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, illetve 50% (lásd az alábbi ábrát). A fluoreszcens pozitív sejtek aránya nőtt, amikor a nanostruktúrákat ultrahangos nyírófeszültségnek tették ki 10 és 20 percig, majd lassan csökkent.

Az ionos folyadék [Bmim][PF6] hatása a plazmid DNS COS7 sejtekbe történő szállítására. A plazmid DNS / IL (ionos folyadék) nanokomplexeket ultrahangos nyírófeszültségnek tettük ki legfeljebb 120 percig, és LA-vel komplexálták, mielőtt COS7 sejtekbe szállítanák. Az adatok a GFP pozitív HeLa sejtek átlagos számát (%) mutatják, amelyeket 10 különböző mikroszkopikus mezőben számoltak, és a kísérletet három különböző napon többször is elvégezték. (Tanulmány és ábra: ©Sarker et al., 2019)

Ultrahangos lizátum készítmény

Ultrahangos sejtlízis protokoll
Kezdje egy dúsított sejtmintával, amelyet sejtelválasztási módszerrel készítettek (pl. immunmágneses sejtszétválasztás, fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás (FACS), sűrűséggradiens centrifugálás, immunsűrűség sejtizolálás).
A sejtmintáknak olyan lízispuffer térfogatot kell mutatniuk, amely megfelel a kísérleti célnak és a szonda típusú ultrahangos készüléknek.
A hipotóniás pufferek előnyösek, mivel fokozzák az ultrahangos sejtlízist. Fontos, hogy az adalékanyagokat és a sókoncentrációt megfelelő módon használják.
Válassza ki ultrahangos lízis készülékét: Az injekciós üvegek közvetett ultrahangos kezeléséhez a VialTweeter vagy a CupHorn ajánlott. A multiwell-lemezek esetében a UIP400MTP az ideális ultrahangos készülék. És klasszikus szonda típusú szonda típusú szonikálás, ultrahangos homogenizátor, mint a UP100H vagy UP200Ht mikro-csúccsal a legmegfelelőbb.
Protokoll a szonda típusú szonikáláshoz: Helyezze az ultrahangos szondát a minta térfogatába egy mikrocentrifugacsőben és szonikálja kb. 10 másodpercig. A DNS-mintától függően az ultrahangos kezelést még egyszer vagy kétszer meg lehet ismételni. A szükséges ultrahangos energiabevitel (Ws / ml) a minta viszkozitásától és a DNS típusától függ. Az ultrahangos készülék jégfürdővel és pulzáló móddal történő hűtése segít megakadályozni, hogy a minta termikusan lebomlik.
Ultrahangos lízis után a mintát centrifugáljuk a pellet törmelék elválasztására (amely nem lizált sejteket, magokat és nem lizált organellákat tartalmaz)
Ha a mintát nem dolgozzák fel azonnal, megfelelő hőmérsékleten tárolható életképességének megőrzése érdekében.

Ultrahangos készülékek DNS-töredezettséghez

A Hielscher Ultrasonics különböző ultrahang alapú platformokat kínál a DNS, RNS és kromatin töredezettséghez. Ezek a különböző platformok közé tartoznak az ultrahangos szondák (sonotrodes), közvetett szonikációs megoldások több cső vagy több lyukú lemez egyidejű mintaelőkészítéséhez (pl. 96-lyukú lemezek, mikrotiter lemezek), szonoreaktorok, és ultrahangos cuphorns. A DNS-nyírás minden platformját frekvenciahangolt, nagy teljesítményű ultrahangos processzorok táplálják, amelyek pontosan vezérelhetők és reprodukálható eredményeket nyújtanak.

Ultrahangos processzorok bármilyen mintaszámhoz és mérethez

A Hielscher többmintás ultrahangos készülékei VialTweeter (legfeljebb 10 kémcsövekhez) és UIP400MTP (mikrolemezekhez / többlyukú lemezekhez) könnyen lehetővé válik a minta feldolgozási idejének csökkentése az intenzív és pontosan szabályozható ultrahangos kezelés miatt, miközben megkapja a kívánt DNS-fragmens méreteloszlását és hozamát. Az ultrahangos DNS-fragmentáció hatékonysá, megbízhatóvá és méretezhetővé teszi a plazmid előkészítési lépéseket. A protokollok lineárisan skálázhatók egyről számos mintára állandó ultrahang paraméterek alkalmazásával.
A szonda ultrahangos készülékei egy-öt ujjal ideálisak kisebb mintaszámok előállításához. A Hielscher laboratóriumi ultrahangos készülékei különböző teljesítményszintekkel kaphatók, így kiválaszthatja az ideális ultrahangos diszruptort a DNS-hez kapcsolódó alkalmazáshoz.