Plazmid készítmény ultrahanggal

Ultrasonication egy megbízható technika a plazmid DNS töredékére. A pontosan szabályozható amplitúdó, a pulzációs mód és a hőmérséklet-szabályozás az ultrahangos készülék legfontosabb jellemzői a nem káros plazmid töredezettséghez. Ezenkívül bizonyos szerek használata segít megvédeni a plazmid lebomlását. A Hielscher Ultrasonics különféle megoldásokat kínál a kontrollált plazmid töredezettségére egyetlen injekciós üvegből, egyidejűleg számos minta szonikálására, valamint többkútú lemezekre. Tudjon meg többet a sikeres ultrahangos plazmid töredezettségről!

Információkérés




Jegyezzük fel Adatvédelmi irányelvek.


Ultrahangos DNS fragmentáció egy megbízható és hatékony technika általánosan használt Next Generation Szekvenálás (NGS)

Az UIP400MTP lehetővé teszi a többkútú lemezek precízen szabályozott ultrahangos kezelését. Az UIP400MTP egyik alkalmazása a plazmid DNS töredezettsége, hogy kifejezetten célzott hosszúságú fragmenseket kapjunk.

Plazmid nyírás ultrahanggal

Amikor a DNS-mintákat ultrahangos hullámoknak vetik alá, az ultrahanggal generált rezgések akusztikus kavitációt hoznak létre a folyadékban, amely mechanikai erőkkel nyírja vagy megszakítja a nagy molekulatömegű DNS-molekulákat. Az ultrahangos kezelés a legszélesebb körben használt módszer az ömlesztett DNS nyírási kísérletekhez, beleértve az olyan alkalmazásokat is, mint például a kromatin immunprecipitáció (ChIP), amelynek kis fragmensméretei elengedhetetlenek a nagy felbontás eléréséhez. (vö. Tseng et al., 2012)
A plazmid DNS (pDNS) a DNS specifikus formája, amelyet gyűrű alakja jellemez, és baktériumokban és néhány eukariótában található.
A túlhűtött pDNS a plazmid DNS kívánt formája, mivel a legjobb eredményeket mutatja a down-stream folyamatokban, például az automatizált szekvenálásban és a transzfekcióban. Ultrasonication alkalmas a pDNS, beleértve a túlhűtött pDNS-t is, sikeresen töredezett.
Thompson et al. (2008) kimutatta, hogy a plazmid szonikáció, amelyről ismert, hogy a túlhűtött DNS-t széttöredezi, hatékony módja annak, hogy javítsuk a szekvencia phred20 olvasási hosszát, olyannyira, hogy nem különböznek szignifikánsan Beckman Coulter kontrollsablonjától vagy enzimatikusan linearizált plazmidjaitól.

Az ultrahangos DNS töredezettség előnyei

  • Pontosan befolyásolható
  • Reprodukálható eredmények
  • Állítható a DNS-fragmens hosszának megcélzására
  • hőmérséklet-szabályozás
  • Bármilyen mintaméretre méretezhető
A videó bemutatja az ultrahangos mintaelőkészítő rendszert UIP400MTP, amely lehetővé teszi bármely szabványos többkútlemez megbízható minta előkészítését nagy intenzitású ultrahanggal. Az UIP400MTP tipikus alkalmazásai közé tartozik a sejtlízis, a DNS, az RNS és a kromatin nyírása, valamint a fehérje extrakció.

Ultrasonicator UIP400MTP több kútlemezes ultrahangos kezeléshez

Plazmid vektorok használata

A plazmidokat gyakran használják eszközként a gének klónozására, átvitelére és manipulálására. Ha a plazmidokat kísérletileg használják erre a célra, azokat vektoroknak nevezik. A DNS-fragmensek vagy gének beilleszthetők egy plazmid vektorba, létrehozva egy úgynevezett rekombináns plazmidot. A plazmidvektorokat eszközként használják a rekombináns DNS gazdasejtbe történő meghajtására, és a molekuláris klónozás kulcsfontosságú összetevői.
“A nem vírusos vektorokat széles körben tanulmányozzák a génterápiában való lehetséges felhasználásuk szempontjából különböző bonyolult betegségek kezelésére. A nem vírusos vektorok megvédik a plazmid DNS-t a fizikai, kémiai és enzimatikus lebomlástól, és a DNS-molekulát a célhelyre szállítják. Például a kationos liposzómák, a kitozán és más pozitív töltésű nanorészecskék elektrosztatikus kölcsönhatások révén plazmid DNS-sel komplexeket képeznek. A könnyen képződő kationos liposzómák/plazmid DNS komplexek azonban viszonylag nagyok (azaz 300–400 nm) és heterogén jellegűek, ami megnehezíti a gyógyszerészeti alkalmazásokban való felhasználásukat. A nagy és heterogén plazmid DNS/liposzómák, plazmid DNS/aeroszolok és plazmid DNS/peptid komplexek ultrahanggal kisebb és homogén részecskékké redukálhatók.” (Sarker et al., 2019)
A plazmidvektorok használatának kiemelkedő példája a CRISPR–Cas9. A CRISPR–Cas9 rendszert általában egyetlen nagy plazmidként vagy több kisebb plazmidként juttatják el a sejtekhez, amelyek egy célszekvenciát, egy CRISPR útmutatót és Egy Cas9-et kódolnak.

DNS-sel töltött PLGA Nanorészecskék ultrahangos előkészítése nanoprecipitációval

Jo et al. (2020) poli(tejsav-ko-glikolsav) (PLGA) segítségével nanorészecske-hordozót képezett a CRISPR–Cas9 plazmid modell elsődleges csontvelőből származó makrofágokba történő szállításához. A PLGA nanorészecskék nanoprecipitációjához két különböző végcsoporttal (észter- és amincsoportokkal) rendelkező PLGA-t használtunk azzal a céllal, hogy a pozitív töltésű amin végsapkák növeljék a kapszulázási hatékonyságot és a terhelést a közte és a DNS negatív töltésű gerince közötti töltés kölcsönhatások miatt. Egy 50 ml-es polipropilén kúpos centrifugacsőben 100 mg Pluronic F127-et oldottunk fel 20 ml autoklávozott DI vízben örvénykeveréssel, majd 30 perc gyengéd szonikálással ultrahangos fürdővel (lásd CupHorn). Autoklávozott mágneses keverőrudat adtunk hozzá, és az oldatot 600 ford/perc sebességgel 30 percig kevertük, miközben a többi oldatot elkészítettük. Az üvegáruk helyett mindvégig műanyag laboratóriumi eszközöket használtak a DNS nem specifikus adszorpciójának minimalizálása érdekében. A PLGA DMF-ben (44,48 mg/ml) és a THF-ben oldott TIPS pentakén (0,667 mg/ml) oldatait külön készítettük. A PLGA-t 30 percig nedvesen hagyták a DMF-ben, mielőtt 30 percig szonikálták volna (a teljes protokollért lásd Jo et al., 2020)

Kapcsolódó alkalmazások:

  • A DNS kivonása
  • A DNS kapszulázása
  • Nanorészecskével bevont DNS diszperziója
  • Plazmid DNS szállítása sejtekbe
UP200St TD_CupHorn a közvetett szonikálás minták

Az UP200St CupHorn a minták közvetett szonikálására, pl. DNS-extrakcióra és fragmentációra.

Információkérés




Jegyezzük fel Adatvédelmi irányelvek.


Plazmid DNS-védelem az ultrahangos kezelés során

A DNS, beleértve a plazmidokat és a túlhűtött plazmidokat, rendkívül érzékeny lebomlás. Minden rendelkezésre álló töredezettségi módszer ismert bizonyos hátrányok miatt. Az ultrahangos DNS-fragmentáció az egyik előnyben részesített módszer, mivel a szabályozott szonikálás védőintézkedésekkel kombinálva lehetővé teszi a DNS-szálak nyírás- és hő okozta károsodásának csökkentését.
Az ultrahangos DNS nyírás során az alacsony amplitúdó beállítások, a pulzációs mód és a hőmérséklet-szabályozás mellett bizonyos szerek használata jelentős védőhatást mutatott a DNS lebomlása ellen. Például különböző polimerek, peptidek és lipidek védik a plazmid DNS-t az ultrahangos kezelés során.

Az ionos folyadékok megvédhetik a plazmid DNS-t a szonikálás során bekövetkező károsodásoktól.

A plazmid DNS és a plazmid DNS/IL nanokomplexek ultrahangos nyírási stressz elleni stabilitását agaróz gél elektroforézis vizsgálatával vizsgáltuk. Mind a plazmid DNS, mind a plazmid DNS /IL nanokomplexeket ultrahangos nyírófeszültségnek vetették alá különböző időpontokban. A plazmid DNS-t ultrahangos nyírási stressznek volt kitéve 0, 10, 20, 30 és 40 percig. A plazmid DNS/IL nanokomplexeket azonban ultrahangos nyírási stressznek tették ki 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 és 120 percig.
(tanulmány és kép: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) kimutatta, hogy amikor a plazmid DNS / ionos folyadék (pDNS /IL) nanostruktúrákat ultrahangos nyírófeszültségnek vetették alá 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 és 120 percig, és a kereskedelemben kapható kationos génszállító szerrel, a lipofectaminnal komplexálva a fluoreszcens pozitív sejtek százalékos aránya 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65% volt, 65%, illetve 50%(lásd az alábbi ábrát). A fluoreszcens pozitív sejtek százalékos aránya nőtt, amikor a nanostruktúrákat ultrahangos nyírófeszültségnek vetették alá 10 és 20 percig, majd ezt követően lassan csökkentek.

A plazmid DNS ultrahangos töredezettsége

Az ionos folyadék [Bmim][PF6] hatása a plazmid DNS COS7 sejtekbe történő szállítására. A plazmid DNS/IL (ionos folyadék) nanokomplexeket ultrahangos nyírófeszültségnek vetették alá legfeljebb 120 percig, és LA-lel komplexizálták, mielőtt a COS7 sejtekbe kerültek volna. Az adatok a GFP pozitív HeLa sejtek átlagos számát (%) mutatják, amelyeket 10 különböző mikroszkopikus területen számoltak, és a kísérletet három különböző napon többször is elvégezték. (Tanulmány és ábra: ©Sarker et al., 2019)

A plazmid DNS védhető, ha ultrahangos fragmentáció előtt anyagot adunk hozzá.

A plazmid DNS védhető egy szer hozzáadásával az ultrahangos fragmentáció előtt: A meztelen pDNS (A) és a pDNS szonikáció által kiváltott lebomlása 1,5 mM CaCl2-vel és 20 % (v/v) t-butanollal (B)
A mintákat 20 W-os szondával szonikáltuk 120-as évekig, ahogy az az egyes sávok tetején jeleztük. A H sáv megfelel a Hyperladder I ™️ jelölőnek. Az OC és SC plazmid sávok jelennek meg.
(tanulmány és képek: ©Wu et al., 2009)

Ultrahangos lizátum készítmény

Ultrahangos sejt lízis protokoll
Ultrasonicator UP200Ht S26d2 mikrotipptel biológiai minták ultrahangos líziséhezKezdjük egy dúsított sejtmintával, amelyet sejtszekciós módszerrel készítettünk (pl. immunmágneses sejtszétválasztás, fluoreszcencia-aktiválású sejtválogatás (FACS), sűrűséggradiens centrifugálás, immundenzitási sejtizoláció).
A sejtmintáknak a kísérleti célnak megfelelő lízispuffer térfogatát és a szonda típusú ultrasonicatort kell mutatniuk.
A hipotóniás pufferek előnyösek, mivel fokozzák az ultrahangos sejt lízist. Fontos, hogy az adalékanyagokat és a sókoncentrációt megfelelő módon használják.
Válassza ki ultrahangos líziseszközét: Az injekciós üvegek közvetett szonikálásához a VialTweeter vagy a CupHorn ajánlott. Multiwell lemezekhez, az UIP400MTP az ideális ultrahangos készülék. És a klasszikus szonda típusú szonikáció, ultrahangos homogenizátor, mint az UP100H vagy az UP200Ht mikrocsúcsgal a legmegfelelőbb.
Protokoll szonda típusú szonikáláshoz: Helyezze az ultrahangos szondát a minta térfogatába egy mikrocentrifuge csőben, és kb. 10 másodpercig szonikálja. A DNS-mintától függően az ultrahangos kezelés még egy-két alkalommal megismételhető. A szükséges ultrahangos energiabevitel (Ws / ml) a minta viszkozitásától és a DNS típusától függ. A jégfürdőn keresztüli hűtés és az ultrahangos készülék pulzációs módja segít megelőzni, hogy a minta termikusan lebomlik.
Ultrahangos lízis után a mintát centrifugáljuk, hogy szétválasszuk a pellethulladékot (amely nem lizett sejteket, magokat és nem lizált organellákat tartalmaz)
Ha a mintát nem dolgozzák fel azonnal tovább, akkor életképességének megőrzése érdekében megfelelő hőmérsékleten tárolható.

Ultrasonicators a DNS fragmentációhoz

Hielscher Ultrasonics kínál különböző ultrahang-alapú platformok DNS, RNS, és a kromatin fragmentáció. Ezek a különböző platformok közé tartoznak az ultrahangos szondák (szonotródok), közvetett ultrahangos megoldások több cső vagy több kútlemez egyidejű mintavételi előkészítéséhez (pl. 96-kútlemezek, mikrotiter lemezek), szonoreactors és ultrahangos cuphornok. A DNS-nyírás minden platformját frekvenciahangolt, nagy teljesítményű ultrahangos processzorok hajtják, amelyek pontosan szabályozhatók és reprodukálható eredményeket biztosítanak.

Ultrahangos processzorok bármilyen mintaszámhoz és mérethez

A Hielscher többmintás ultrasonicators VialTweeter (legfeljebb 10 kémcsőhöz) és az UIP400MTP (mikrolemezekhez / többcsatornás lemezekhez) segítségével könnyen csökkenthető a minta feldolgozási ideje az intenzív és pontosan szabályozható ultrahangos kezelés miatt, miközben megkapja a kívánt DNS-fragmens méreteloszlást és hozamot. Az ultrahangos DNS-fragmentáció a plazmid-előkészítési lépéseket hatékonnyá, megbízhatóvá és skálázhatóvá teszi. A protokollok lineárisan méretezhetők egyről számos mintára állandó ultrahang paraméterek alkalmazásával.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Az ultrahangos többmintás előkészítő egység VialTweeter lehetővé teszi akár 10 injekciós üveg egyidejű szonikálását. A VialPress szorítóeszközzel akár 4 további cső is nyomható az elejére az intenzív szonikálás érdekében.

pontos folyamatszabályozás

A Hielscher ultrasonicators távolról vezérelhető a böngésző vezérlésén keresztül. Az ultrahangos paraméterek pontosan nyomon követhetők és beállíthatók a folyamat követelményeihez.A pontosan szabályozható ultrahangos beállítások kulcsfontosságúak, mivel a teljes szonifikáció elpusztíthatja a DNS-t, az RNS-t és a kromatint, de a nem megfelelő ultrahangos nyírás túl hosszú DNS- és kromatin-töredékeket eredményez. Hielscher digitális ultrahangos könnyen beállítható pontos ultrahangos paraméter. A speciális szonikációs beállítások programozott beállításként is elmenthetők ugyanazon eljárás gyors ismétléséhez.
Minden szonikálás automatikusan protokollal történik, és CSV fájlként tárolódik egy beépített SD-kártyán. Ez lehetővé teszi az elvégzett kísérletek pontos dokumentálását, és lehetővé teszi az ultrahangos kezelés egyszerű felülvizsgálatát.
A böngésző távirányítón keresztül az összes digitális ultrahangos eszköz bármilyen szabványos böngészőn keresztül működtethető és felügyelhető. További szoftver telepítése nem szükséges, mivel a LAN-kapcsolat nagyon egyszerű plug-n-play beállítás.

A legmagasabb felhasználóbarátság az ultrahangos DNS-előkészítés során

Minden Hielscher ultrahangos készüléket úgy terveztek, hogy nagy teljesítményű ultrahangot biztosítson, miközben mindig nagyon felhasználóbarát és könnyen kezelhető. Minden beállítás jól strukturált egy világos menüben, amely könnyen elérhető színes érintőképernyővel vagy böngésző távirányítóval. A programozható beállításokkal és automatikus adatrögzítéssel rendelkező intelligens szoftver optimális szonikációs beállításokat biztosít a megbízható és reprodukálható eredmények érdekében. A tiszta és könnyen használható menüfelület a Hielscher ultrahangos készülékeket felhasználóbarát és hatékony eszközökké nyitja.
Az alábbi táblázat jelzi a laboratóriumi ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitását a sejtlízishez és a DNS-fragmentációhoz:

Kötegelt mennyiség Áramlási sebesség Ajánlott eszközök
többkútú lemezek N/a UIP400MTP
injekciós üvegek, kis főzőpohár N/a Ultrahangos cuphorn
legfeljebb 10 injekciós üveg N/a VialTweeter
1 - 500 ml 10-200 ml / perc UP100H
10-2000 ml 20-400 ml / perc Uf200 ः t, UP400St

Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezz minket!

Kérjen bővebb információt

Kérjük, használja az alábbi űrlapot, hogy további információkat kérjen az ultrahangos homogenizálókról a DNS kivonásához és töredezettségéhez, az alkalmazási protokollokról és az árakról. Örömmel megbeszéljük veled a folyamatot, és kínálunk Önnek egy ultrahangos rendszert, amely megfelel az Ön igényeinek!









Kérjük, vegye figyelembe Adatvédelmi irányelvek.




Irodalom / Referenciák

Tudni érdemes

Mik azok a plazmidok?
A plazmid egy kis kör alakú DNS-molekula, amely fizikailag elkülönül a kromoszóma DNS-től, és önállóan replikálódik. A plazmidokat gyakran olyan génekkel társítják, amelyek hozzájárulnak a szervezet túléléséhez, és különleges előnyöket jelentenek, pl. antibiotikum-rezisztenciát. A plazmidokat leggyakrabban kis kör alakú, kettős szálú DNS-molekulákként találják meg a baktériumokban; a plazmidok azonban néha jelen vannak az archaea és az eukarióta szervezetekben. A plazmidok fontos eszközök a molekuláris biológiában, a genetikában, a biokémiában és az élettudományban. A géntechnológiai vektorokként ismert plazmidokat bizonyos gének replikálására vagy expressziójára használják. A vektor célzott megváltoztatását vektortervezésnek nevezzük.

GFP elemzés a sejtkutatásban
A zöld fluoreszcens fehérje (GFP) egy sokoldalú biológiai marker a fiziológiai folyamatok monitorozására, a fehérje lokalizációjának megjelenítésére és a transzgenikus expresszió in vivo kimutatására. A GFP-t a 488 nm-es lézervonal gerjesztheti, és optimálisan kimutatható 510 nm-en.


Nagy teljesítményű ultrahang! A Hielscher termékskálája lefedi a teljes spektrumot a kompakt laboratóriumi ultrasonicatortól a padtetős egységeken át a teljes ipari ultrahangos rendszerekig.

Hielscher Ultrahang gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok Labor nak nek ipari méretben.