Protokoll Hielscher többmintás szonikátorokkal a biofilm és a proteomikai elemzésben

A többmintás szonikátorok, például a VialTweeter többcsöves szonikátor és a UIP400MTP Microplate Sonicator használata egyszerűsíti a laboratóriumi munkafolyamatokat a nagy áteresztőképességű alkalmazásokhoz. Mindkét eszköz lehetővé teszi a pontos és egységes ultrahangos feldolgozást több mintán, minimalizálva a variabilitást és növelve a reprodukálhatóságot. Ez különösen előnyös a következetes mintalízist, biofilm leválasztást, fehérjeextrakciót vagy proteolitikus emésztést igénylő kísérletekben, ahol a kézi vagy egymintás módszerek kevésbé hatékonyak és hajlamosak az inkonzisztenciára.

Egyszerűsítse a munkafolyamatokat többmintás szonikátorokkal

A UIP400MTP például lehetővé teszi a mikrolemezes kutak egyidejű ultrahangos kezelését, biztosítva a biofilmek vagy sejtanyagok egyenletes leválasztását. Eközben a VialTweeter több csőminta pontos lízisét és homogenizálását teszi lehetővé keresztszennyeződés nélkül. Ezek az ultrahangos készülékek jelentősen csökkentik a feldolgozási időt, javítják a kísérleti reprodukálhatóságot és fenntartják a magas mintaintegritást, így nélkülözhetetlen eszközök a mikrobiológiai, proteomikai és molekuláris biológiai kutatásokban.
Az alábbiakban egy részletes protokoll szemlélteti a Hielscher többmintás szonikátor modellek, a VialTweeter többcsöves szonikátor és a mikrolemez szonikátor UIP400MTP használatát egy tanulmányban, amely magában foglalja E. coli biofilm képződés és az azt követő proteomikai elemzés.

Protokoll: Biofilm képződés, leválás és proteomikai elemzés Hielscher többmintás szonikátorokkal

1. Baktériumkultúra előkészítése

• E. coli baktériumok tenyésztése (W3110 törzs) 30 °C-on, az E. coli biofilm képződése szempontjából kedvező hőmérsékleten, triptonleves (TB) táptalajban, amely a következőket tartalmazza:
  – 10 g/l tripton
  – 5 g/l NaCl
• Szükség szerint antibiotikumokkal kiegészítve a plazmid visszatartás biztosítása érdekében.
• Mikroszkópos és promóter aktivitási vizsgálatokhoz használja a W3110 E. coli törzset genomikus továbbfejlesztett GFP (eGFP) riporterrel az rplL promoter ellenőrzése alatt.
• Használja a GFP riporter plazmidokat különböző promóterekhez (pl. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) a projektgazda tevékenységének mérésére.

2. Biofilm termesztés és leválasztás

• Vájjunk lyukanként 1,5 ml hígított baktériumtenyészetet egy 12 lyukú lemezbe (CellStar 12 lyukú lemezek, Greiner Bio-One).
• Inkubáljuk, hogy lehetővé tegyük a biofilm képződését.
• Óvatosan távolítsa el a planktonikus (nem tapadó) kultúrát.

– Mossa ki mindegyik vájatot 500 μl PBS-sel.
– Válassza le a csatlakoztatott sejteket a 12-lyukú lemez ultrahangos kezelésével a UIP400MTP mikrolemez szonikátorban. A UIP400MTP biztosítja az egyenletes leválasztást azáltal, hogy következetes ultrahangos energiát biztosít az összes kútban.
– Sonication beállítások: 60% amplitúdó, ciklus mód: 60 mp BE / 30 mp KI.

3. Sejtgyűjtés és lízis

• Centrifugáljuk a leválasztott biofilm sejteket 4 500 g-vel 5 percig.
• Mossuk a pelletált cellákat PBS-sel.
• Szuszpendáljuk újra a sejteket 100 μl 2%-os nátrium-lauroil-szarkozinátban (SLS), és inkubáljuk 95 °C-on 15 percig.
• Sonicate a VialTweeter Multi-Tube Sonicator segítségével biztosítja a teljes sejtlízist.
  – Sonication beállítások: 100% amplitúdó, 50 s BE / 10 s KI 10 perc teljes futási idő; Tartsa a mintákat jégen.

4. Redukció és alkilezés

• Adjunk hozzá 5 mM trisz(2-karboxietil)foszfint (TCEP) a diszulfidkötések csökkentése érdekében, és inkubáljuk 95 °C-on 15 percig.
• Alkilátfehérjék 10 mM jodoacetamiddal 30 percig 25°C-on.

5. A fehérjék mennyiségi meghatározása és emésztése

• Centrifugálja a lizátumokat a törmelék tisztításához.
• Számszerűsítse az összes fehérjetartalmat a Pierce BCA fehérjevizsgálati készlet segítségével.
• Emésztjük fel 50 μg összes fehérjét 1 μg tripszinnel 2% SLS-t és 100 mM ammónium-hidrogén-karbonátot tartalmazó oldatban.
• Inkubáljuk az emésztési reakciót egy éjszakán át 30°C-on.

6. Peptid tisztítás

• Csapjuk ki az SLS-t 1,5% trifluor-ecetsav (TFA) hozzáadásával, majd centrifugáljuk.
• Tisztítsa meg a peptideket C18 mikrospin oszlopokkal.
• Szárítsuk meg a tisztított peptideket és szuszpendáljuk újra 0,1% TFA-ban.

7. Folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (LC-MS/MS)

• Elemezzen peptideket egy Q-Exactive Plus tömegspektrométeren, Ultimate 3000 RSLC nanorendszerrel párosítva.
• Válasszuk szét a peptideket fordított fázisú HPLC-oszloppal (75 μm × 42 cm), C18 gyantával (2,4 μm) töltve.
• Vigyen fel 2–35% B oldószert (acetonitril 0,15% hangyasavval) 140 perc alatt.
• Gyűjtsön adatokat nagy felbontású MS szkenneléssel, majd tandem MS/MS szkenneléssel a 10 legintenzívebb ionról.

8. Adatelemzés

• Nyers LC-MS adatok feldolgozása a Progenesis szoftver segítségével.
• Exportálja az .mgf fájlokat, és elemezze őket a MASCOT segítségével.
• Végezzen peptidszámszerűsítést a SafeQuant használatával a minőség-ellenőrzéshez és a hamis felfedezés beállításához.
• A reprodukálhatóság biztosítása érdekében minden kísérletet duplikált vagy háromszoros formában végezzünk.

Többmintás szonikátorok nagy áteresztőképességű mintaelőkészítéshez

A VialTweeter és UIP400MTP többmintás szonikátor modellek jelentősen növelik a kísérleti munkafolyamatok pontosságát és hatékonyságát, különösen a biofilmkutatásban és a proteomikában. Több minta egységes feldolgozásának képessége nagy átviteli kapacitást biztosít az adatminőség romlása nélkül. Ezek az előnyök, kombinálva a fent vázolt egyszerűsített munkafolyamatokkal, a Hielscher többmintás szonikátorokat a modern biológiai kutatás alapvető eszközeivé teszik.

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban gyártott minőség

A Hielscher ultrahangos készülékek jól ismertek a legmagasabb minőségi és tervezési szabványokról. A robusztusság és a könnyű kezelhetőség lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A durva körülmények és az igényes környezetek könnyen kezelhetők Hielscher ultrasonicators.

Hielscher Ultrasonics egy ISO tanúsítvánnyal rendelkező cég, és különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű ultrasonicatorokra, amelyek a legmodernebb technológiát és felhasználóbarátságot mutatják. Természetesen a Hielscher ultrasonicators CE-kompatibilis és megfelel az UL, CSA és RoHs követelményeinek.