Protokoll a Hielscher többmintás ultrahangos készülékeinek használatához biofilm- és proteomikai elemzésekben

A többmintás ultrahangos készülékek, például a VialTweeter Multi-Tube Sonicator és a UIP400MTP Microplate Sonicator használata egyszerűsíti a nagy mintaáteresztő képességet igénylő alkalmazások laboratóriumi munkafolyamatait. Mindkét készülék több minta precíz és egyenletes ultrahangos feldolgozását teszi lehetővé, minimalizálva a változékonyságot és javítva a reprodukálhatóságot. Ez különösen előnyös az olyan kísérletekben, amelyek következetes mintalízist, biofilmleválasztást, fehérjekinyerést vagy proteolitikus emésztést igényelnek, és amelyekben a kézi vagy egyetlen mintát kezelő módszerek kevésbé hatékonyak, és hajlamosak következetlen eredményeket adni.

Egyszerűsítse munkafolyamatait többmintás ultrahangos készülékekkel

A UIP400MTP például lehetővé teszi a mikrolemezek mintahelyeinek egyidejű ultrahangos kezelését, biztosítva a biofilmek vagy a sejtes anyag egyenletes leválasztását. A VialTweeter eközben több, csőben elhelyezett minta precíz lízisét és homogenizálását teszi lehetővé keresztszennyeződés nélkül. Ezek az ultrahangos készülékek jelentősen csökkentik a feldolgozási időt, javítják a kísérletek reprodukálhatóságát, és megőrzik a minták nagyfokú épségét, így nélkülözhetetlen eszközök a mikrobiológiai, proteomikai és molekuláris biológiai kutatásban.
Az alábbi részletes protokoll a Hielscher többmintás ultrahangos készülékeinek, a VialTweeter Multi-Tube Sonicator és a Microplate Sonicator UIP400MTP modelleknek a használatát szemlélteti egy E. coli-biofilm képződését és az azt követő proteomikai elemzést vizsgáló tanulmányban.

Protokoll: biofilmképződés, biofilmleválasztás és proteomikai elemzés a Hielscher többmintás ultrahangos készülékeivel

1. Baktériumtenyészet előkészítése

• Tenyésszen E. coli baktériumokat (W3110 törzs) 30°C-on, az E. coli-biofilm képződésének kedvező hőmérsékleten, az alábbiakat tartalmazó triptonleves (TB) tápközegben:
  – 10 g/L tripton
  – 5 g/L NaCl
• Szükség szerint egészítse ki antibiotikumokkal a plazmid megtartásának biztosítása érdekében.
• A mikroszkópos és promoteraktivitási vizsgálatokhoz használja a W3110 E. coli törzset, amelynek genomjában az rplL promoter szabályozása alatt álló, fokozott fluoreszcenciájú GFP (eGFP) riportergén található.
• A promoteraktivitások méréséhez használjon különböző promoterekhez tartozó GFP-riporterplazmidokat (pl. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ).

2. Biofilm tenyésztése és leválasztása

• Oltson be mintahelyenként 1,5 mL hígított baktériumtenyészetet egy 12 mintahelyes lemezbe (CellStar 12 mintahelyes lemezek, Greiner Bio-One).
• Inkubálja a biofilm kialakulásához.
• Óvatosan távolítsa el a planktonikus (nem tapadó) tenyészetet.

– Mosson át minden mintahelyet 500 µL PBS-sel.
– Válassza le a megtapadt sejteket a 12 mintahelyes lemez ultrahangos kezelésével a UIP400MTP mikrolemez-kezelő ultrahangos készülékben. A UIP400MTP egyenletes leválasztást biztosít azáltal, hogy minden mintahelyre azonos ultrahangos energiát juttat.
– Az ultrahangos kezelés beállításai: 60% amplitúdó, ciklikus üzemmód: 60 sec BE / 30 sec KI.

3. Sejtek begyűjtése és lízise

• Centrifugálja a leválasztott biofilmsejteket 4 500 g mellett 5 percig.
• Mossa át a leülepített sejteket PBS-sel.
• Szuszpendálja újra a sejteket 100 µL 2%-os nátrium-lauroil-szarkozinátban (SLS), és inkubálja 95°C-on 15 percig.
• Végezzen ultrahangos kezelést a VialTweeter Multi-Tube Sonicator készülékkel a teljes sejtlízis biztosítása érdekében.
  – Az ultrahangos kezelés beállításai: 100% amplitúdó, 50 s BE / 10 s KI, összesen 10 min üzemidővel; tartsa a mintákat jégen.

4. Redukció és alkilezés

• Adjon hozzá 5 mM trisz(2-karboxietil)-foszfint (TCEP) a diszulfidkötések redukálásához, és inkubálja 95°C-on 15 percig.
• Alkilezze a fehérjéket 10 mM jódacetamiddal 30 percig 25°C-on.

5. Fehérjék mennyiségi meghatározása és emésztése

• Centrifugálja a lizátumokat a törmelék eltávolításához.
• Határozza meg az összfehérje-tartalmat a Pierce BCA Protein Assay Kit segítségével.
• Emésszen 50 µg összfehérjét 1 µg tripszinnel egy 2% SLS-t és 100 mM ammónium-hidrogén-karbonátot tartalmazó oldatban.
• Inkubálja az emésztési reakcióelegyet egy éjszakán át 30°C-on.

6. Peptidek tisztítása

• Csapja ki az SLS-t 1,5% trifluor-ecetsav (TFA) hozzáadásával, majd centrifugálja.
• Tisztítsa meg a peptideket C18 mikrocentrifugás oszlopokkal.
• Szárítsa meg a megtisztított peptideket, és szuszpendálja újra őket 0,1%-os TFA-ban.

7. Folyadékkromatográfia–tömegspektrometria (LC-MS/MS)

• Elemezze a peptideket egy Ultimate 3000 RSLC nano rendszerhez kapcsolt Q-Exactive Plus tömegspektrométerrel.
• Válassza el a peptideket egy C18 gyantával (2,4 µm) töltött fordított fázisú HPLC-oszlopon (75 µm × 42 cm).
• Alkalmazzon 140 perc alatt 2%-ról 35%-ra növekvő B oldószergradienst (0,15% hangyasavat tartalmazó acetonitril).
• Gyűjtsön adatokat nagy felbontású MS pásztázásokkal, amelyeket a 10 legintenzívebb ion tandem MS/MS pásztázásai követnek.

8. Adatelemzés

• Dolgozza fel a nyers LC-MS adatokat a Progenesis szoftverrel.
• Exportáljon .mgf fájlokat, és elemezze őket a MASCOT segítségével.
• Végezze el a peptidek mennyiségi meghatározását a SafeQuant segítségével, minőség-ellenőrzéssel és a téves találatok korrekciójával.
• Végezzen el minden kísérletet két vagy három ismétlésben a reprodukálhatóság biztosítása érdekében.

Többmintás ultrahangos készülékek nagy mintaáteresztő képességű minta-előkészítéshez

A VialTweeter és UIP400MTP többmintás ultrahangos készülékmodellek jelentősen javítják a kísérleti munkafolyamatok precizitását és hatékonyságát, különösen a biofilmkutatásban és a proteomikában. Több minta egyenletes feldolgozására való képességük nagy mintaáteresztő képességet biztosít az adatok minőségének romlása nélkül. Ezek az előnyök a fent ismertetett, egyszerűsített munkafolyamatokkal együtt a Hielscher többmintás ultrahangos készülékeit a modern biológiai kutatás alapvető eszközeivé teszik.

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban készült minőség

A Hielscher ultrahangos készülékei a legmagasabb minőségi és tervezési követelményeikről ismertek. A robusztusság és az egyszerű kezelés lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását az ipari létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos készülékei könnyedén megbirkóznak a mostoha körülményekkel és a nagy igénybevételt jelentő környezetekkel.

A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, amely különös hangsúlyt fektet a legkorszerűbb technológiával és felhasználóbarát kialakítással rendelkező, nagy teljesítményű ultrahangos készülékekre. Természetesen a Hielscher ultrahangos készülékei megfelelnek a CE előírásainak, és teljesítik az UL, CSA és RoHs követelményeit.