Proteomikai protokoll: Az érintésmentes ultrahangkezelés javítja a peptidminták előkészítését tömegspektrometriás elemzéshez
Az alulról felfelé építkező proteomika a modern biomarkerek felfedezésének, a szerkezeti biológiának és a klinikai diagnosztikának egyik sarokkövévé vált. A fehérjék tömegspektrometriai (MS) elemzés előtti peptidekre történő emésztésével a kutatók mélyebb szekvencia-lefedettséget és megbízhatóbb mennyiségi meghatározást érhetnek el. A nagy komplexitású biológiai minták MS-re való előkészítése azonban továbbra is technikailag igényes feladat. A legújabb módszertani fejlesztések rávilágítanak arra, hogy az ellenőrzött ultrahangos feldolgozás – különösen az érintésmentes VialTweeter Multi-Tube ultrahangos készülékkel és az UIP400MTP mikrolemez-ultrahangos készülékkel – jelentősen egyszerűsítheti ezt a munkafolyamatot, javíthatja a reprodukálhatóságot, és megelőzheti a műszereknél gyakran előforduló szűk keresztmetszeteket.
Keressen egy részletes mintakészítési eljárást, amellyel a tömegspektrometriás elemzéshez megfelelő méretű peptideket nyerhet.
Kiknek ajánlott az érintésmentes ultrahangos kezelés a peptidminták előkészítéséhez?
- Alulról felfelé építkező proteomika & Discovery Labs: Azok a kutatók, akik nagy komplexitású mintákat készítenek elő LC-MS- vagy MALDI-vizsgálati folyamatokhoz, és akiknek különböző biológiai mátrixokból egyenletes, magas hozamú peptid-kinyerésre van szükségük.
- S-Trap™ & A felfüggesztés miatt elakadt felhasználók: Azok a csapatok, amelyek mikrooszlopos tisztítási eljárást alkalmaznak, és amelyeknek szabályozott DNS-aprításra van szükségük az oszlop eltömődésének megelőzése, valamint a minta zökkenőmentes betöltésének és emésztésének biztosítása érdekében.
- klinikai & Transzlációs kutatócsoportok: Olyan laboratóriumok, amelyek szöveteket, sejteket, plazmát, szérumot vagy cerebrospinális folyadékot dolgoznak fel, és ahol a tételek közötti reprodukálhatóság és a minták integritása döntő fontosságú.
- Kvantitatív & Célzott MS Teams-csoportok: Olyan laboratóriumok, amelyek szigorú összehasonlító vizsgálatokat végeznek, ahol az újrafelhasználható szondás ultrahangos készülékek keresztfertőzés kockázatát hordozzák, ami veszélyeztetheti a ritkán előforduló peptidek mennyiségi meghatározását.
- Alapvető létesítmények & Nagy áteresztőképességű műveletek: Azok a kutatócsoportok, amelyek egyszerre több biológiai ismétlést dolgoznak fel, és számukra előnyös a VialTweeter segítségével végzett, zárt csövekből álló, többcsöves blokkos ultrahangos kezelés, amely kiküszöböli a szondák tisztítását, csökkenti a kézi munkával töltött időt, és biztosítja az aszeptikus körülményeket.
- Szülői értekezlet & A szerkezeti fehérjék kutatói: Olyan kutatók számára, akiknek a sejtlisztelés és homogenizálás során kíméletes, hőmérséklet-szabályozott feldolgozásra van szükségük a labilis módosulások megőrzése és a szekvencia-lefedettség maximalizálása érdekében.
Többmintás szonikátor “VialMagassugárzó” több lezárt fiola érintésmentes mintakészítéséhez proteomikai célokra
A protokoll áttekintése: a szövetektől és sejtektől az MS-vizsgálatra alkalmas peptidekig
A Wojtkiewicz és munkatársai által ismertetett, széles körben alkalmazott, alulról felfelé építkező proteomikai munkafolyamat megbízható, skálázható módszert kínál peptidminták előállításához különféle biológiai mátrixokból. Az eljárás 50–100 mg gyorsfagyasztott szövetből vagy 1–20 millió sejtből indul ki, és a szuszpenzió-visszatartó (S-Trap™) technológiát alkalmazza a detergensok, sók és szennyeződések hatékony eltávolítására az enzimatikus emésztés előtt.
A lízis, a fehérje-mennyiségi meghatározás, a redukció és az alkilezés után a mintát savasítják, majd egy S-Trap™ centrifugációs oszlopra töltik, ahol a tripszin/LysC emésztés zajlik. A kapott peptideket eluálják, megszárítják, majd LC-MS elemzésnek vetik alá. 50 mg emberi szívszövetre alkalmazva ez a munkafolyamat következetesen elegendő peptidet eredményez 30–40 injekcióhoz, futásonként több mint 4000 egyedi fehérje azonosításával. Míg a kémiai folyamatok és az oszlopalapú tisztítás jól meghatározottak, a folyamat sikere nagymértékben függ a kezdeti fizikai felbontástól és a DNS-kezelési lépésektől.
A protokoll a VialTweeter Multi-Tube Sonicator készülék használatát javasolja a sejtek ultrahangos líziséhez és a DNS felaprózásához. – Mindkét lépés elengedhetetlen a peptidanalízishez.
A VialTweeter lezárt 1,0, 1,5 és 2,0 ml-es Eppendorf-csöveket, valamint különféle NUNC-fiolákat kezel ultrahanggal
Ultrahangos sejt- és szövetlízis fehérje-kivonás céljából
Az alulról felfelé építkező proteomikai munkafolyamatban az ultrahangos kezelés kulcsfontosságú lépés a sejtminták lízisében, amelynek célja a fehérjék kivonása a későbbi tömegspektrometriai elemzéshez. Miután az SDS-tartalmú sejtlízis-puffert hozzáadták a sejtpellethez, a mintákat ultrahangos kezelésnek vetik alá a VialTweeter Multi-Tube Sonicator készülék segítségével. A protokoll 1,5 ml-es mikrofugacsöveket használ, és előírja, hogy az ultrahangos készüléket 30%-os teljesítményen 10 másodpercig bekapcsolva, majd 10 másodpercig kikapcsolva működtessék, ezt 3 cikluson át ismételve. 1 perc várakozás után a ciklust még kétszer megismétlik. A mintákat folyamatosan jéggel hűtik.
Ez a folyamat nemcsak a sejtek felbomlását segíti elő, hanem kifejezetten szükséges a lízis során felszabaduló genomikus DNS darabokra vágásához is. A hatékony DNS-darabolás elengedhetetlen a minta viszkozitásának csökkentéséhez és az S-Trap™ oszlopok eltömődésének megelőzéséhez, ezáltal biztosítva az optimális fehérje-visszanyerést és a megbízható későbbi peptid-emésztést.
Az ultrahangos DNS-aprítás döntő szerepe
Az S-Trap™-alapú munkafolyamatok egyik leggyakoribb hibája az oszlop eltömődése, amelyet szinte kizárólag a sejtek vagy szövetek homogenizálása során felszabaduló, nagy molekulatömegű genomikus DNS okoz. Az ép DNS drámai mértékben megnöveli a minta viszkozitását, megköti a peptideket, és eltömíti a mikroporózus S-Trap™ szorbenságyat.
Az ultrahangos feldolgozás úgy oldja meg ezt a problémát, hogy a DNS-t mechanikusan apró, oldható fragmensekre bontja. Szabályozott akusztikus energia alkalmazásával a VialTweeter hatékonyan nyírja a nukleinsavakat anélkül, hogy túlzott hő keletkezne, vagy idegen szennyeződések kerülnének a rendszerbe. Ez a viszkozitáscsökkenés biztosítja a minták zökkenőmentes betöltését, az egyenletes átfolyási sebességet és a megszakításmentes emésztési kinetikát.
A VialTweeter ultrahangos kezelésének optimalizált paraméterei
A protokoll egy rendkívül jól reprodukálható ultrahangkezelési eljárást ír le, amelyet a biológiai minták integritásának megőrzésére és a későbbi tömegspektrometriai (MS) elemzéssel való kompatibilitásra optimalizáltak. 1,5 ml-es mikrocentrifuga-csövekben lévő minták esetében a Hielscher VialTweeter érintésmentes blokkos ultrahangos készülék használatával a következő paraméterek biztosítják a sejtfalak felbomlását és az optimális DNS-széttörést, miközben megőrzik a fehérjék szerkezetét:
- Amplitúdó: 30% teljesítmény
- Ciklusmintázat: 10 másodperc BE / 10 másodperc KI
- Időtartam: 3 ciklus (10 másodperc BE/10 másodperc KI) → 1 perc pihenés jégen → még kétszer megismételni
- Hőmérséklet-szabályozás: A mintákat a feldolgozás során jégre helyezik, hogy megakadályozzák a hő hatására történő denaturációt és az enzimek idő előtti aktivitását.
Ez az impulzusos ultrahangos kezelési módszer megakadályozza a helyi túlmelegedést, minimalizálja a peptidek oxidációját, és biztosítja az egyenletes akusztikai hatást az összes fiolában. A zárt csővel rendelkező berendezésnek köszönhetően nincs szükség a szonda tisztítására a minták között, ami jelentősen csökkenti a kézzel végzett munkára fordított időt és a kezelői eltéréseket.
A modern proteomikai munkafolyamatok legfontosabb előnyei
A VialTweeter beépítése az alulról felfelé építkező proteomikai munkafolyamatba számos gyakorlati és tudományos előnnyel jár:
- A DNS következetes fragmentációja: Az összes fiolában egyenletes akusztikus energia-ellátás biztosítja a viszkozitáscsökkenés reprodukálhatóságát, és megakadályozza az S-Trap™ feltöltésénél a tételek közötti eltéréseket.
- A labilis módosítások megőrzése: A jégfürdőben végzett alacsony hőmérsékletű feldolgozás megóvja a transzlációs utáni módosításokat (PTM-eket), és megakadályozza a hő hatására bekövetkező fehérje-aggregációt a sejtlizis során.
- Hatékonyabb utómunkálatok: A VialTweeter-rel feldolgozott lizátumok centrifugálással közvetlenül tisztíthatók, és további tisztítási lépések nélkül mennyiségileg meghatározhatók, ami felgyorsítja az S-Trap™ emésztéshez vezető folyamatot.
- Méretezhetőség & Hajlékonyság: Ugyanezek az ultrahangkezelési beállítások alkalmazhatók mind a nagy komplexitású szövetmintákra, mind a sejtszuszpenziókra, támogatva ezzel a felfedező proteomikát, a célzott mennyiségi meghatározást és a glikoproteomikai munkafolyamatokat. A Hielscher mikrolemez-ultrahangkezelők lehetővé teszik a nagy mintaszámra való egyszerű méretnövelést több üreges lemezeken.
Az érintésmentes Multi-Tube Sonicator VialTweeter hűtőszekrényekben is üzemeltethető
Ultrahangos készülékek proteomikai minták előkészítéséhez
A tömegspektrometriához szükséges kiváló minőségű peptidminták előkészítése nem csupán hatékony lízist igényel – Ehhez a DNS-szétvágás, a hőmérséklet és a szennyeződés megelőzésének pontos szabályozására van szükség. A Hielscher VialTweeter beépítésével a bottom-up proteomikai munkafolyamatba kiküszöbölhető az S-Trap™ eltömődése, biztosítható a fehérje-visszanyerés reprodukálhatósága, és fenntartható az érzékeny MS-elemzésekhez szükséges tisztaság. Akár emberi szövetet, tenyésztett sejteket, akár komplex lizátumokat dolgoz fel, az ultrahangos blokkfeldolgozás biztosítja azt a megbízhatóságot, skálázhatóságot és folyamatirányítást, amelyre a modern proteomikai laboratóriumoknak szükségük van.
Ha nagyobb mintaszámra szeretne átállni, használja ki a Hielscher fókuszált, érintésmentes mikrolemez-ultrahangos készülékeinek, az UIP400MTP és az UIP550MTP modellek előnyeit! Bármilyen szabványos többlyukú lemezt feldolgozhat nagy áteresztőképességű proteomikai vizsgálatokhoz!
Zártcsöves feldolgozás a hagyományos szondás ultrahangos készülékekkel szemben
A múltban a kutatók a DNS-szétvágáshoz közvetlen érintkezésű szondás ultrahangos készülékeket használtak. Bár ezek hatékonyak, a szondás rendszerek számos kritikus korlátot jelentenek a proteomikai munkafolyamatokban:
- Keresztfertőzés kockázata: Ha egy szondát több mintán is újra felhasználnak, az aeroszolos átvitelhez vezet, és keresztfertőző anyagokat juttat a mintákba, amelyek torzítják a kvantitatív tömegspektrometriai eredményeket.
- Mintaelvesztés: A közvetlen bejuttatás a értékes peptidek fröccsenéséhez, elpárolgásához és a szonda felületéhez való tapadásához vezethet.
- Tisztítás: A vizsgálatok közötti alapos szondatisztítás időigényes és gyakran nem teljes körű, ami veszélyezteti a ritkán előforduló fehérjékkel kapcsolatos kutatásokat.
A VialTweeter blokkos ultrahangos berendezés a mintákat teljes egészében lezárt mikrocentrifuga-csövekben dolgozza fel. Ez a zárt rendszerű kialakítás kiküszöböli a szonda és a minta közötti érintkezést, megakadályozza az aeroszol-képződést, és a homogenizálás és a lízis teljes folyamata alatt szigorú aszeptikus körülményeket biztosít. Azoknál a laboratóriumoknál, amelyek nagy komplexitású szöveti lizátumokat vagy több sejtvonalat dolgoznak fel, ez tisztább MS-adatokat, magasabb peptid-visszanyerést és megbízhatóbb biológiai replikákat eredményez.
Átállás a nagy áteresztőképességű mintakészítésre többlyukú lemezeken
Az UIP400MTP és UIP550MTP típusú mikrolemez-ultrahangos készülékekkel, a csőben történő feldolgozás bármely szabványos többlyukú lemezen könnyen kiterjeszthető nagy áteresztőképességű mintafeldolgozásra.
Több lyukú lemezes szonikátor UIP400MTP a mintákból történő nagy áteresztőképességű fehérjeextrakcióhoz
Gyakran feltett kérdések a peptidminták előkészítéséhez alkalmazott ultrahangkezelésről
Miért szükséges az ultrahangos kezelés az S-Trap™ peptid feldolgozása előtt?
Az ultrahangkezelés elengedhetetlen a sejt- vagy szöveti lízis során felszabaduló, nagy molekulatömegű genomikus DNS felaprózásához. Az ép DNS drasztikusan megnöveli a minta viszkozitását, ami eltömítheti az S-Trap™ mikrokolonnát és visszatarthatja a peptideket, ami jelentősen csökkenti a kinyerési hatékonyságot és az MS-kompatibilitást.
Milyen előnyökkel jár a VialTweeter blokkos ultrahangos készülék a minták előkészítésében a hagyományos szondás ultrahangos készülékekhez képest?
A közvetlen érintkezésű szondás ultrahangos készülékekkel ellentétben – amelyeknél a futtatások között gondos tisztításra van szükség, és fennáll az aeroszol-átvitel kockázata – a VialTweeter a mintákat teljes egészében lezárt fiolákban és mikrocentrifuga-csövekben dolgozza fel. Ez a zártcsöves kialakítás kiküszöböli a keresztfertőzést, megakadályozza a minta veszteségét, és szigorú aszeptikus körülményeket biztosít a homogenizálás és a sejtlysis teljes folyamata alatt.
Melyek a proteomikai minták előkészítéséhez optimális ultrahangkezelési paraméterek?
Biológiai minták – például sejtek és szövetek – esetében az ajánlott eljárás szerint a VialTweeter ultrahangos készüléket 30%-os teljesítményen, 10 másodperces bekapcsolási és 10 másodperces kikapcsolási ciklussal kell használni, amelyet háromszor kell megismételni. A mintákat a feldolgozás során jégen kell tartani, és ha ≥5 millió sejtet dolgoznak fel, a ciklust még kétszer meg kell ismételni. (vö. Wojtkiewicz et al., 2021)
Mit tegyek, ha az S-Trap™ oszlopom eltömődik a minta betöltése közben?
Az oszlop eltömődését általában a DNS magas viszkozitása vagy a nem megfelelő tisztítás okozza. A probléma megoldásához a lizátumot a pipettázás előtt alaposan centrifugálja le, és gondoskodjon arról, hogy a DNS ultrahangos kezeléssel megfelelően felaprózódjon.
Milyen előnyökkel jár az érintésmentes ultrahangkezelés a kvantitatív proteomikai munkafolyamatok szempontjából?
Kvantitatív vizsgálatok során még a minták közötti nyomnyi keresztfertőzés is torzíthatja a ritkán előforduló peptidek mérési eredményeit. A VialTweeter zárt csővel működő, több fiolát egyszerre feldolgozó rendszere kiküszöböli a szonda bevezetésének szükségességét, biztosítja a tételek közötti reprodukálhatóságot, és megőrzi a minták integritását a pontos összehasonlító elemzések érdekében.
Milyen fehérjehozamra és MS-mélységre számíthatok ennek az eljárásnak a segítségével?
50 mg emberi szívszövetből vagy 5 millió sejtből kiindulva az S-Trap™ munkafolyamat általában 30–50 LC-MS-injekcióhoz elegendő peptidet eredményez, és futásonként következetesen több mint 4 000 egyedi fehérjét azonosít. (vö. Wojtkiewicz et al., 2021)
Irodalom / Hivatkozások
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű, érintésmentes ultrahangos készülékeket forgalmaz mintakészítéshez és klinikai elemzésekhez. A többlyukú lemezhez tervezett UIP400MTP ultrahangos készülék, a VialTweeter, a CupHorn és a GDmini2 áramlásos ultrahangos készülék a mintákat érintés nélkül dolgozza fel.