Proteomikai protokoll: az érintkezésmentes ultrahangos kezelés javítja a peptidminták előkészítését MS céljára

A bottom-up proteomika a modern biomarker-felfedezés, a szerkezeti biológia és a klinikai diagnosztika egyik alapkövévé vált. A fehérjék peptidekké történő emésztésével a tömegspektrometriás (MS) elemzés előtt a kutatók nagyobb szekvencialefedettséget és megbízhatóbb mennyiségi meghatározást érhetnek el. A nagy komplexitású biológiai minták előkészítése MS céljára azonban továbbra is komoly technikai kihívást jelent. A közelmúlt módszertani fejlesztései rávilágítanak arra, hogy a szabályozott ultrahangos feldolgozás – különösen az érintkezésmentes VialTweeter többcsöves ultrahangos kezelőberendezéssel és az UIP400MTP mikrolemez-kezelő ultrahangos berendezéssel – jelentősen egyszerűsítheti ezt a munkafolyamatot, javíthatja a reprodukálhatóságot, és megelőzheti a műszerek működésében gyakran jelentkező szűk keresztmetszeteket.
Itt részletes minta-előkészítési protokollt talál az MS segítségével végzett elemzéshez megfelelő méretű peptidek előállításához.

Kiknek érdemes érintkezésmentes ultrahangos kezelést alkalmazniuk a peptidminták előkészítéséhez?

• Bottom-up proteomikai és felfedező kutatólaboratóriumok: Azoknak a kutatóknak, akik nagy komplexitású mintákat készítenek elő LC-MS vagy MALDI alkalmazásával végzett munkafolyamatokhoz, és különféle biológiai mátrixokból következetesen nagy hozamú peptidkinyerést igényelnek.
• Az S-Trap™ és a szuszpenziós csapdázás felhasználói: Azoknak a csoportoknak, amelyek mikrooszlopos tisztításra támaszkodnak, és szabályozott DNS-nyírást igényelnek az oszlopok eltömődésének megelőzéséhez, valamint a zökkenőmentes mintafelvitel és emésztés biztosításához.
• Klinikai és transzlációs kutatócsoportok: Azoknak a laboratóriumoknak, amelyek szövetet, sejteket, plazmát, szérumot vagy agy-gerincvelői folyadékot dolgoznak fel, és amelyeknél kritikus fontosságú a mintasorozatok közötti reprodukálhatóság és a minták integritása.
• Kvantitatív és célzott MS vizsgálatokat végző csoportok: Azoknak a laboratóriumoknak, amelyek szigorú összehasonlító vizsgálatokat végeznek, és amelyeknél a szondás ultrahangos kezelőberendezések olyan keresztszennyeződési kockázatokat jelentenek, amelyek veszélyeztethetik a kis mennyiségben jelen lévő peptidek mennyiségi meghatározását.
• Központi szolgáltató laboratóriumok és nagy mintaáteresztő képességű feldolgozást végző egységek: Azoknak a csoportoknak, amelyek egyidejűleg több biológiai ismétlést dolgoznak fel, és előnyt jelent számukra a VialTweeter berendezéssel végzett, zárt csöves, többcsöves blokkos ultrahangos kezelés, amely szükségtelenné teszi a szonda tisztítását, csökkenti a kézi munkára fordított időt, és fenntartja az aszeptikus körülményeket.
• A PTM-ek és a fehérjeszerkezet kutatói: Azoknak a kutatóknak, akik kíméletes, szabályozott hőmérsékletű feldolgozást igényelnek a labilis módosítások megőrzéséhez és a szekvencialefedettség maximalizálásához a sejtlízis és a homogenizálás során.

A protokoll áttekintése: szövetekből és sejtekből MS segítségével végzett elemzésre kész peptidek

A Wojtkiewicz és munkatársai által ismertetett, széles körben alkalmazott bottom-up proteomikai munkafolyamat robusztus, skálázható módszert kínál peptidminták előkészítésére különféle biológiai mátrixokból. A protokoll 50–100 mg gyorsfagyasztott szövetből vagy 1–20 millió sejtből kiindulva alkalmazza a szuszpenziós csapdázási (S-Trap™) technológiát a detergensek, sók és szennyező anyagok hatékony eltávolítására az enzimatikus emésztés előtt.
A lízis, a fehérjék mennyiségi meghatározása, a redukció és az alkilezés után a mintát megsavanyítják, majd egy S-Trap™ centrifugálható oszlopra viszik fel, ahol trypsin/lysC alkalmazásával végzett emésztés történik. A kapott peptideket eluálják, szárítják, majd LC-MS segítségével elemzik. Ha ezt a munkafolyamatot 50 mg emberi szívszövetre alkalmazzák, következetesen elegendő peptidet eredményez 30–40 injektáláshoz, és mérésenként több mint 4 000 egyedi fehérje azonosítását teszi lehetővé. Bár a kémiai eljárások és az oszlopos tisztítás jól meghatározottak, a teljes munkafolyamat sikere nagymértékben függ a kezdeti fizikai feltárási és DNS-kezelési lépésektől.
A protokoll a VialTweeter többcsöves ultrahangos kezelőberendezés használatát javasolja a sejtek ultrahangos líziséhez és a DNS nyírásához – mindkét lépés kritikus fontosságú a peptidelemzéshez.

Ultrahangos sejt- és szövetlízis fehérjekinyeréshez

A bottom-up proteomikai munkafolyamatban az ultrahangos kezelés a sejtminták lízisének egyik kulcsfontosságú lépése, amelynek célja a fehérjék kinyerése a későbbi tömegspektrometriás elemzéshez. Miután SDS-tartalmú sejtlízispuffert adtak a sejtpellethez, a mintákat a VialTweeter többcsöves ultrahangos kezelőberendezéssel dolgozzák fel. A protokoll 1,5 mL térfogatú mikrocentrifugacsöveket használ, és az ultrahangos berendezés 30% teljesítményen történő működtetését írja elő 10 másodperces bekapcsolt és 10 másodperces kikapcsolt szakaszokkal, 3 cikluson át ismételve. 1 perc várakozás után a ciklust még kétszer megismétlik. A mintákat folyamatosan jéggel hűtik.
Ez az eljárás nemcsak a sejtfeltárást segíti, hanem kifejezetten szükséges a lízis során felszabaduló genomi DNS nyírásához is. A hatékony DNS-nyírás kulcsfontosságú a minta viszkozitásának csökkentéséhez és az S-Trap™ oszlopok eltömődésének megelőzéséhez, ezáltal biztosítva az optimális fehérjekinyerést és a megbízható későbbi peptidemésztést.

Az ultrahangos DNS-nyírás kritikus szerepe

Az S-Trap™-alapú munkafolyamatok egyik leggyakoribb hibája az oszlop eltömődése, amelyet szinte kizárólag a sejtek vagy szövetek homogenizálása során felszabaduló, nagy molekulatömegű genomi DNS okoz. Az ép DNS drámai mértékben növeli a minta viszkozitását, csapdába ejti a peptideket, és eltömíti az S-Trap™ mikropórusos szorbenságyát.
Az ultrahangos feldolgozás ezt a problémát úgy oldja meg, hogy mechanikusan kis, oldható fragmentumokra töredezi a DNS-t. Szabályozott akusztikus energia alkalmazásával a VialTweeter hatékonyan nyírja a nukleinsavakat anélkül, hogy túlzott hőt termelne vagy idegen szennyező anyagokat juttatna a mintába. A viszkozitás ilyen csökkentése zökkenőmentes mintafelvitelt, egyenletes átfolyási térfogatáramot és zavartalan emésztési kinetikát biztosít.

A VialTweeter ultrahangos kezelésének optimalizált paraméterei

A protokoll nagymértékben reprodukálható ultrahangos kezelési eljárást ír elő, amelyet a biológiai minták integritásának megőrzésére és a későbbi MS vizsgálatokkal való kompatibilitásra optimalizáltak. A Hielscher VialTweeter érintkezésmentes blokkos ultrahangos kezelőberendezéssel, 1,5mL térfogatú mikrocentrifugacsövekben feldolgozott minták esetében az alábbi paraméterek biztosítják a lízist és az optimális DNS-nyírást a fehérjeszerkezet megőrzése mellett:

• Amplitúdó: 30% teljesítmény
• Ciklusmintázat: 10 másodperc BE / 10 másodperc KI
• Időtartam: 3 ciklus (10 másodperc BE/10 másodperc KI) → 1 perces pihentetés jégen → ismétlés még 2 alkalommal
• Hőmérséklet-szabályozás: a mintákat a feldolgozás során jégre helyezik a termikus denaturáció és az idő előtti enzimaktivitás megelőzésére

Ez az impulzusos ultrahangos kezelési megközelítés megelőzi a helyi túlmelegedést, minimalizálja a peptidek oxidációját, és minden fiolában egyenletes akusztikus kitettséget biztosít. A zárt csöves elrendezés emellett szükségtelenné teszi a szonda tisztítását a minták között, drasztikusan csökkentve a kézi munkára fordított időt és a kezelők közötti eltéréseket.

Fő előnyök a modern proteomikai munkafolyamatok számára

A VialTweeter beépítése a bottom-up proteomikai munkafolyamatba számos működési és tudományos előnyt kínál:

1. Egyenletes DNS-fragmentálás: Az akusztikus energia egyenletes bevitele minden fiolába reprodukálható viszkozitáscsökkenést biztosít, és megelőzi az S-Trap™ mintafelvitelének mintasorozatok közötti eltéréseit.
2. A labilis módosítások megőrzése: A jégfürdőben, alacsony hőmérsékleten végzett feldolgozás védi a poszttranszlációs módosításokat (PTM-eket), és megelőzi a hő által kiváltott fehérjeaggregációt a sejtlízis során.
3. Egyszerűsített további feldolgozás: A VialTweeter berendezéssel kezelt lizátumok közvetlenül deríthetők centrifugálással, és fehérjetartalmuk további tisztítási lépések nélkül meghatározható, ami felgyorsítja az S-Trap™-emésztéshez vezető folyamatot.
4. Skálázhatóság és rugalmasság: Ugyanazok az ultrahangos kezelési beállítások alkalmazhatók a nagy komplexitású szövetmintákra és a sejtszuszpenziókra is, támogatva a felfedező proteomikai, a célzott mennyiségi meghatározási és a glikoproteomikai munkafolyamatokat. A Hielscher mikrolemez-kezelő ultrahangos berendezései lehetővé teszik a feldolgozás egyszerű kiterjesztését nagy mintaszámra, többlyukú lemezeken.

Szakirodalom / Hivatkozások

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.