Proteomikai munkafolyamatok nagy mintaáteresztő képességű fehérjeemésztéssel

A proteomika a biológiai folyamatok és rendszerek megértéséhez nélkülözhetetlen tudományterület, amelynek munkafolyamataiban a fehérjeemésztés kulcsfontosságú lépés. Hagyományosan a fehérjeemésztést oldatban végzik proteolitikus enzimekkel, például tripszinnel, amely specifikusan hidrolizálja a lizin- és argininmaradékoknál található peptidkötéseket. Ez a folyamat olyan peptideket eredményez, amelyek jól alkalmasak a tömegspektrometriás (MS) alkalmazások során végzett ionizációra és fragmentációra. A hagyományos emésztési módszerek teljes végbemeneteléhez azonban 12–24 óra szükséges, ami jelentős szűk keresztmetszeteket teremt a proteomikai munkafolyamatokban.
Az ultrahangos kezelés hatékony alternatívát kínál, amely az emésztési időt órákról mindössze néhány percre csökkenti. Korszerű, több minta kezelésére szolgáló ultrahangos készülékekkel, például a Hielscher CupHorn, a VialTweeter és a 96 lyukú lemezek kezelésére szolgáló UIP400MTP készülékkel kombinálva az ultrahangos kezelés gyorsított, nagy mintaáteresztő képességű proteomikai feldolgozást tesz lehetővé. Ezek a technológiák egyszerűsítik a munkafolyamatokat, csökkentik a minta-előkészítés idejét és növelik a hatékonyságot anélkül, hogy rontanák a reprodukálhatóságot vagy az adatok minőségét.

Az ultrahangenergia szerepe a fehérjeemésztésben

Az ultrahangos kezelés fókuszált ultrahanghullámokkal hoz létre kavitációt – helyi mikrobuborékokat, amelyek összeomlásukkor intenzív nyíróerőket keltenek. Ez a jelenség fokozza az anyagátadást, elősegíti az enzimek és a szubsztrátok keveredését, és kitekeri a fehérjeszerkezeteket, hozzáférhetővé téve a hasítási helyeket a proteolitikus enzimek, például a tripszin számára.
Az eredmény? Az emésztési idő jelentős csökkenése a hatékonyság vagy a reprodukálhatóság romlása nélkül.

Ultrahanggal fokozott proteolitikus emésztés: módszertan és eredmények

Gyorsított emésztési protokoll

Az ultrahanggal segített emésztés proteolitikus enzimek és ultrahangenergia kombinációjával gyorsítja a munkafolyamatokat. Például a Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) használatával az emésztési munkafolyamat a következőképpen zajlik:

1. Redukció: A fehérjemintákat (0,5 mg/mL, 20 µL) DTT-vel (2 µL, 110 mM) kezelik ammónium-hidrogén-karbonát-pufferben (12,5 mM). Az ultrahangos kezelést 50%-os amplitúdóval, 5 percig végzik.
2. Alkilezés: IAA (2 µL, 400 mM) hozzáadása után az ultrahangos kezelést ugyanilyen körülmények között megismétlik.
3. Emésztés: A mintákat hígítják, és immobilizált tripszint hordozó nanorészecskékkel inkubálják. Egy utolsó ultrahangos kezelési ciklus (5 perc) teljessé teszi az emésztést. A peptideket elválasztják, megszárítják és az MS módszerrel végzett elemzéshez tárolják.

Ez az ultrahangos módszer a teljes előkészítési időt 12 óráról 30 percnél rövidebb időre csökkenti. A gyorsított folyamat ellenére a peptidhozam és a peptidek minősége továbbra is megfelel a hagyományos, egy éjszakán át tartó módszerekkel elért eredményeknek.

Az ultrahangos fehérjeemésztés hatékonysága

Az E. coli proteomjaival végzett összehasonlító vizsgálatokban:

• Fehérjeazonosítás: Az ultrahanggal emésztett mintákból 5 perc alatt 777 fehérjét azonosítottak, szemben a 12 óra alatt azonosított 817 fehérjével. A mindkét módszerrel azonosított fehérjék aránya meghaladta a 70%-ot.
• Reprodukálhatóság: Az ismételt elemzések az egyes módszereken belül 98% feletti korrelációs értékeket mutattak, igazolva a megbízhatóságot.
• Szelektivitás: Az egyes módszerek bizonyos fehérjéket előnyben részesítve emésztettek: az ultrahangos emésztés 65 fehérjének, az egy éjszakán át tartó emésztés pedig 54 fehérjének kedvezett. Az ilyen árnyalt különbségek rámutatnak az ultrahangos kezelés egyedülálló lehetőségeire bizonyos alkalmazásokban.

Egy E. coli mintához hozzáadott hét fehérje jelölésmentes mennyiségi meghatározásának
eredményei. Az alábbi fehérjéket két különböző szinten adták hozzá, a
„Theo Ratio” nevű oszlopban jelzett módon. A Theo Ratio az ebben a
kísérletben alkalmazott két szint elméleti aránya. Szarvasmarha-szérumalbumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1-kazein (CASA1),
α-S2-kazein (CASA2), citokróm c (CYC), ovalbumin (OVAL) és karboanhidráz 2
(CAH2). Az arányokat a MaxQuant
elemzésből kapott LFQ-fehérjeintenzitások alapján számították ki. Az egyes módszerekkel kapott értékek összehasonlítására Student-féle t-próbát alkalmaztak (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Tanulmány és ábra: © Martins et al., 2019)

Nanorészecskéken immobilizált tripszin

Az immobilizált tripszint hordozó nanorészecskék (pl. T-FMNPs) és az ultrahangos kezelés kombinálása tovább javítja a proteomikai munkafolyamatokat. Ezek a nanorészecskék nagy felületet biztosítanak az enzim–szubsztrát kölcsönhatásokhoz, növelve a hatékonyságot. Összetett proteomok, például az E. coli proteomjának vizsgálatakor a kombinált módszer a következőket eredményezi:

• Gyorsaság: Teljes emésztés 5 percen belül.
• Pontosság: A hagyományos módszerekkel összevethető mennyiségi fehérjemeghatározás (p > 0,01, n=3).
• Skálázhatóság: A többlyukú lemezekkel működő platformokhoz, például az UIP400MTP platformhoz való adaptálás nagy mintaáteresztő képességű feldolgozást tesz lehetővé.

Kattintson ide a részletes protokollért, amely lépésről lépésre ismerteti az eljárást!
(vö. Martins et al., 2019)

Gyors, nagy mintaáteresztő képességű proteolitikus emésztés Hielscher ultrahangos készülékekkel

A legjobb ultrahangos készülékmodellek proteomikai alkalmazásokhoz

A Hielscher Ultrasonics különféle ultrahangos készülékmodelleket kínál több minta egyidejű előkészítésére, megkönnyítve a nagy mintaáteresztő képességű munkafolyamatokat. Akár fiolákkal, kémcsövekkel, többlyukú lemezekkel (pl. 6, 24 vagy 96 lyukú lemezekkel), akár Petri-csészékkel dolgozik – ideális ultrahangos készülékeket kínálunk kísérleteihez.

UIP400MTP ultrahangos készülék többlyukú lemezekhez

A lehető legnagyobb mintaáteresztő képesség érdekében az UIP400MTP lehetővé teszi 96 lyukú lemezek ultrahangos kezelését. Az UIP400MTP bármely szabványos mikrolemezzel kompatibilis, nem igényel drága, kizárólag a gyártótól beszerezhető egyszer használatos eszközöket, és szabadságot ad ahhoz, hogy a kutatásához legjobb többlyukú lemezt válassza. A lemez egészén egyenletesen leadott energiával akár 200 összetett proteom gyors redukcióját, alkilezését és emésztését teszi lehetővé mindössze 1 óra alatt. Az automatizálás és a hatékonyság ilyen szintje kulcsfontosságú a nagy mintaáteresztő képességű proteomikában és a klinikai alkalmazásokban. Tudjon meg többet a többlyukú lemezekhez készült ultrahangos készülékről!

VialTweeter

A VialTweeter olyan laboratóriumok igényeihez igazodik, amelyekben akár 10 fiola vagy kémcső egyidejű ultrahangos kezelésére van szükség. Nem invazív megközelítése kiküszöböli a keresztszennyeződés kockázatait, miközben reprodukálható fehérjeemésztést biztosít. Ez a készülék ideális a korlátozott mintatérfogatokkal vagy különféle mintatípusokkal dolgozó kutatók számára.
Tudjon meg többet a több cső kezelésére szolgáló VialTweeter ultrahangos készülékről!

Hielscher UP200St-CupHorn

A CupHorn ultrahangos készülék nagy teljesítményű eszköz, amelyet több, lezárt tartályban lévő minta egyidejű feldolgozására terveztek. Egyenletes ultrahangenergia-eloszlást és pontos hőmérséklet-szabályozást biztosít. Az akár öt minta egyidejű feldolgozásának lehetősége, valamint a redukciót, alkilezést és emésztést magukban foglaló munkafolyamatokkal való kompatibilitása a CupHorn készüléket az MS módszeren alapuló proteomika megbízható eszközévé teszi.
Tudjon meg többet a CupHorn SonoReactor készülékről!

Lépésről lépésre követhető protokoll ultrahanggal segített proteolitikus emésztéshez nanorészecskéken immobilizált tripszin használatával

Martins et al. (2019) e protokollját ultrahangenergia és nanorészecskéken immobilizált tripszin (T-FMNPs) alkalmazásával végzett gyors fehérjeemésztésre optimalizálták. A bemutatott lépések hatékony redukciót, alkilezést és proteolízist biztosítanak a tömegspektrometriás (MS) alkalmazásokhoz.
A protokoll lépései

1. Diszulfidkötések redukciója
   • Adjon 2 µL DTT-oldatot (110 mM) az AmBic pufferben lévő 20 µL fehérjemintához (0,5 mg/mL).
   • Helyezze a mintát tartalmazó csövet az UP200St-CupHorn szonoreaktorba.
   • Kezelje a mintát ultrahanggal 2,5 percig, 50%-os amplitúdóval (200 W, 26 kHz).
   • Tartson rövid szünetet a lehűléshez, majd folytassa az ultrahangos kezelést további 2,5 percig ugyanilyen körülmények között.
2. Redukált ciszteinmaradékok alkilezése
   • Adjon 2 µL IAA-oldatot (400 mM) a redukált fehérjemintához.
   • Az alkilezés elősegítésére végezzen ultrahangos kezelést 2,5 percig, 50%-os amplitúdóval.
   • Tartson szünetet a lehűléshez, majd folytassa az ultrahangos kezelést további 2,5 percig.

   Megjegyzés: Az IAA lebomlásának megelőzése érdekében a lehető legkisebb mértékben tegye ki fénynek az alkilezett mintát.

3. A minta hígítása
   • Hígítsa az alkilezett fehérjemintát 100 µL végtérfogatra 4% acetonitrilt (v/v) tartalmazó 25 mM AmBic pufferrel.
   • Óvatos pipettázással alaposan keverje össze.
4. Proteolitikus emésztés nanorészecskéken immobilizált tripszinnel
   • Adjon 20 µL T-FMNP-oldatot (3 mg/mL) a hígított fehérjemintához.
   • Kezelje a keveréket ultrahanggal a szonoreaktorban 2,5 percig, 50%-os amplitúdóval.
   • Tartson szünetet a lehűléshez, majd folytassa az ultrahangos kezelést további 2,5 percig ugyanilyen körülmények között.
5. A tripszint hordozó nanorészecskék elválasztása
   • Mágnessel válassza el a T-FMNPs nanorészecskéket az emésztett peptideket tartalmazó felülúszótól.
   • Vigye át a felülúszót egy új mikrocentrifuga-csőbe.
6. Peptidek előkészítése az MS módszerrel végzett elemzéshez
   • Szárítsa meg a peptideket tartalmazó felülúszót vákuumcentrifugában.
   • Tárolja a megszárított peptideket -20°C-on a további tömegspektrometriás elemzésig.