Proteomikai munkafolyamatok nagy áteresztőképességű fehérjeemésztéssel

A proteomika a biológiai folyamatok és rendszerek megértésének alapvető területe, amelynek munkafolyamataiban kritikus lépés a fehérjeemésztés. Hagyományosan a fehérje emésztését oldatban végezzük proteolitikus enzimekkel, például tripszinnel, amely specifikusan hidrolizálja a peptidkötéseket lizin és arginin maradékokban. Ez a folyamat olyan peptideket hoz létre, amelyek kiválóan alkalmasak ionizációra és fragmentációra tömegspektrometriás (MS) alkalmazásokban. A hagyományos emésztési módszerek azonban 12–24 órát igényelnek a befejezéshez, ami jelentős szűk keresztmetszeteket okoz a proteomikai munkafolyamatokban.
Az ultrahangos kezelés erőteljes alternatívát kínál, drasztikusan lerövidítve az emésztési időt órákról néhány percre. A fejlett többmintás szonikátorokkal, például a Hielscher CupHorn, VialTweeter és a 96-lyukú lemezes szonikátor UIP400MTP kombinálva az ultrahangos kezelés lehetővé teszi a gyorsított, nagy áteresztőképességű proteomikát. Ezek a technológiák egyszerűsítik a munkafolyamatokat, csökkentik a mintaelőkészítési időt és növelik a hatékonyságot anélkül, hogy veszélyeztetnék a reprodukálhatóságot vagy az adatminőséget.

Az ultrahangos energia szerepe a fehérje emésztésében

Az ultrahangos kezelés fókuszált ultrahanghullámokat alkalmaz kavitáció létrehozására - lokalizált mikrobuborékok, amelyek összeomlanak, hogy intenzív nyíróerőket generáljanak. Ez a jelenség fokozza a tömegátadást, elősegíti az enzimek szubsztrátokkal való keveredését, és kibontakoztatja a fehérjeszerkezeteket, kitéve a hasítási helyeket a proteolitikus enzimeknek, például a tripszinnek.
Az eredmény? Az emésztési idő jelentős csökkentése a hatékonyság vagy a reprodukálhatóság veszélyeztetése nélkül.

Ultrahanggal fokozott proteolitikus emésztés: módszertan és eredmények

Gyorsított emésztési protokoll

Az ultrahangos emésztés kombinálja a proteolitikus enzimeket és az ultrahangos energiát a munkafolyamatok felgyorsítása érdekében. Például a Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) használatával az emésztési munkafolyamat a következőképpen megy végbe:

1. Redukció: A fehérjemintákat (0,5 mg/ml, 20 μL) DTT-vel (2 μL, 110 mM) kezeljük ammónium-hidrogén-karbonát pufferben (12,5 mM). Az ultrahangos kezelést 50% amplitúdóval alkalmazzuk 5 percig.
2. Alkilezés: IAA (2 μL, 400 mM) hozzáadása után az ultrahangos kezelést ugyanolyan körülmények között megismételjük.
3. Emésztés: A mintákat immobilizált tripszin nanorészecskékkel hígítjuk és inkubáljuk. Az ultrahangos kezelés utolsó fordulója (5 perc) befejezi az emésztést. A peptideket elkülönítik, szárítják és tárolják MS elemzéshez.

Ez az ultrahangos módszer csökkenti a teljes előkészítési időt 12 óráról 30 perc alatt. A gyorsított folyamat ellenére a peptidhozam és -minőség továbbra is összhangban van a hagyományos éjszakai módszerekkel.

Az ultrahangos fehérje emésztés hatékonysága

E. coli proteomokat alkalmazó összehasonlító vizsgálatokban:

• Fehérje azonosítás: Az ultrahanggal emésztett minták 777 fehérjét azonosítottak 5 perc alatt, szemben a 817-tel 12 órán belül. A megosztott fehérjeazonosítások meghaladták a 70%-ot.
• Reprodukálhatóság: A párhuzamos elemzések 98% feletti korrelációs értékeket mutattak az egyes módszereken belül, ami a megbízhatóságot bizonyítja.
• Szelektivitás: Bizonyos fehérjéket előnyösen emésztettünk minden módszerrel, az ultrahangos emésztés 65 fehérjét és az éjszakai emésztést 54 fehérjét részesítette előnyben. Az ilyen árnyalt különbségek hangsúlyozzák az ultrahangos kezelés egyedülálló potenciálját speciális alkalmazásokhoz.

Hét tüskés fehérje címkémentes mennyiségi meghatározása egy E. coli-ba
minta. A következő fehérjéket két különböző szinten adtuk hozzá, amint azt az oszlopban jeleztük
"Theo Ratio" néven nevezték el. A Theo-arány az ebben használt két szint elméleti aránya
kísérlet. Szarvasmarha-szérum albumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), citokróm c (CYC), ovalbumin (OVAL) és karboanhidráz 2
(CAH2). Az arányokat a MaxQuant-ból nyert LFQ fehérjeintenzitások felhasználásával számítottuk ki.
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Tanulmány és grafika: © Martins et al., 2019)

Nanorészecske-immobilizált tripszin

Az immobilizált tripszin nanorészecskék (pl. T-FMNP-k) ultrahangos kezeléssel történő integrálása tovább javítja a proteomikai munkafolyamatokat. Ezek a nanorészecskék nagy felületet biztosítanak az enzim-szubsztrát kölcsönhatásokhoz, növelve a hatékonyságot. Komplex proteomokra, például E. coli-ra alkalmazva a kombinált módszer a következőket eredményezi:

• Sebesség: Teljes emésztés 5 percen belül.
• Pontosság: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Méretezhetőség: A többkútú platformokhoz, például a UIP400MTP-hez való alkalmazkodás nagy áteresztőképességű feldolgozást tesz lehetővé.

Kattintson ide a részletes protokollért lépésről lépésre!
(vö. Martins et al., 2019)

Proteolitikus emésztés nagy sebességgel és nagy áteresztőképességgel Hielscher szonikátorokkal

A legjobb szonikátor modellek a proteomikához

A Hielscher Ultrasonics különböző sonicator modelleket kínál egyidejű többmintás előkészítéshez, megkönnyítve a nagy áteresztőképességű munkafolyamatokat. Akár fiolákkal, kémcsövekkel, többlyukú lemezekkel (pl. 6, 24, 96 lyukú lemezekkel) vagy Petri-csészékkel dolgozik – Kínálunk Önnek az ideális szonikátorokat a kísérletekhez.

UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátor

A végső teljesítmény érdekében a UIP400MTP lehetővé teszi az 96-lyukú lemezek ultrahangos feldolgozását. Bármely szabványos mikrolemezzel kompatibilis, a UIP400MTP nem igényel drága, szabadalmaztatott eldobható eszközöket, és megadja Önnek a szabadságot, hogy kiválassza a legjobb többlyukú lemezt a kutatásához. Azáltal, hogy egyenletes energiát szállít a lemezen, lehetővé teszi akár 200 komplex proteom gyors redukcióját, alkilezését és emésztését mindössze 1 óra alatt. Ez az automatizálási szint és hatékonyság kulcsfontosságú a nagy áteresztőképességű proteomika és klinikai alkalmazások számára. Tudjon meg többet a többlyukú lemezes szonikátorról!

VialMagassugárzó

A VialTweeter olyan laboratóriumok számára készült, amelyek legfeljebb 10 injekciós üveg vagy kémcső egyidejű ultrahangos kezelését igénylik. Nem invazív megközelítése kiküszöböli a keresztszennyeződés kockázatát, miközben biztosítja a reprodukálható fehérjeemésztést. Ez az eszköz ideális azoknak a kutatóknak, akik korlátozott mintamennyiséggel vagy különböző mintatípusokkal dolgoznak.
Tudjon meg többet a VialTweeter többcsöves szonikátorról!

Hielscher UP200St-CupHorn

A CupHorn szonikátor egy erőteljes eszköz, amelyet több minta egyidejű feldolgozására terveztek lezárt tartályokban. Biztosítja az egyenletes ultrahangos energiaeloszlást és a pontos hőmérséklet-szabályozást. Az akár öt minta egyidejű feldolgozásának képessége, valamint a csökkentett, alkilezett és emésztett munkafolyamatokkal való kompatibilitása teszi a CupHornt megbízható eszközzé az MS-alapú proteomikában.
Tudj meg többet a CupHorn SonoReactorról!

Lépésről lépésre protokoll ultrahangos kezeléssel segített proteolitikus emésztéshez nanorészecske-immobilizált tripszin használatával

Martins et al. (2019) protokollja optimalizálva van a gyors fehérje emésztésre ultrahangos energia és nanorészecske-immobilizált tripszin (T-FMNP-k) felhasználásával. A vázolt lépések biztosítják a tömegspektrometriás (MS) alkalmazásokhoz alkalmas hatékony redukciót, alkilezést és proteolízist.
A protokoll lépései

1. A diszulfidkötések csökkentése
   • Adjunk 2 μl DTT-oldatot (110 mM) a 20 μl-es fehérjemintához (0,5 mg/ml) AmBic pufferben.
   • Helyezze a mintacsövet az UP200St-CupHorn szonoreaktorba.
   • Ultrahangos kezelés a mintát 2,5 percig 50% amplitúdóval (200 W, 26 kHz).
   • Szüneteltessük egy rövid időközre, hogy lehetővé tegyük a hűtést, majd ultrahangozzunk további 2,5 percig ugyanazon körülmények között.
2. Redukált ciszteinmaradékok alkilezése
   • Adjunk 2 μl IAA oldatot (400 mM) a redukált fehérjemintához.
   • Sonicate 2,5 percig 50% amplitúdóval az alkilezés megkönnyítése érdekében.
   • Szüneteltesse a hűtést, majd további 2,5 percig ultrahangozzon.

   Megjegyzés: Az IAA lebomlásának megelőzése érdekében minimalizálja az alkilezett minta fénynek való kitettségét.

3. A minta hígítása
   • Hígítsuk fel az alkilezett fehérjemintát 100 μl végső térfogatra 25 mM AmBic pufferrel, amely 4% acetonitrilt (v/v) tartalmaz.
   • Kíméletes pipettázással alaposan keverjük össze.
4. Proteolitikus emésztés nanorészecske-immobilizált tripszinnel
   • Adjunk 20 μl T-FMNP oldatot (3 mg/ml) a hígított fehérjemintához.
   • Sonicate a keveréket a szonoreaktorban 2,5 percig 50% -os amplitúdóval.
   • Szüneteltesse a hűtést, majd további 2,5 percig ultrahangozzon ugyanazon körülmények között.
5. A tripszin nanorészecskék elválasztása
   • Mágnes segítségével válassza el a T-FMNP-ket az emésztett peptideket tartalmazó felülúszótól.
   • Vigyük át a felülúszót egy új mikrocentrifugacsőbe.
6. Peptid előkészítés MS analízishez
   • Szárítsuk meg a felülúszót tartalmazó peptideket vákuumcentrifugában.
   • A szárított peptideket -20°C-on tároljuk a további tömegspektrometriás elemzésig.