Ultrahangos, szűrővel támogatott minta-előkészítés (FASP): a proteomikai munkafolyamatok javítása fejlett ultrahangos kezeléssel

Az ultrahangos, szűrővel támogatott minta-előkészítés (FASP) rendkívül hatékony és reprodukálható módszerként válik egyre elterjedtebbé a modern proteomikában. A szabályozott ultrahangos kezelés bevált FASP-munkafolyamatokba történő beépítésével a kutatók jelentősen javíthatják a fehérjék extrakcióját, az emésztés hatékonyságát és az adatok általános minőségét. A nagy mintaáteresztő képességű és reprodukálható minta-előkészítés iránti növekvő igény miatt a fókuszált ultrahangos kezelőkészülékek, például az UIP400MTP mikrolemez-kezelő, egyre nagyobb tudományos és gyakorlati jelentőségre tesznek szert.

Tudományos háttér: miért fontos a FASP a proteomikában?

A szűrővel támogatott minta-előkészítés (FASP) a bottom-up proteomika arany standardjává vált, mivel képes eltávolítani a detergenseket, sókat és egyéb szennyező anyagokat, miközben hatékony enzimatikus emésztést tesz lehetővé. A klasszikus FASP-protokollok azonban gyakran ütköznek a nem teljes lízissel, az egyenetlen emésztéssel és a minták változékonyságával kapcsolatos korlátokba – különösen összetett vagy ellenálló biológiai sejtek vagy szövetek esetén.
Itt biztosít döntő előnyt a fókuszált ultrahangos energia alkalmazása (ultrahangos kezelés). Mechanikai nyíróerők és kavitáció létrehozásával az ultrahangos kezelés a FASP-munkafolyamat több kritikus lépését is javítja a fehérjék épségének veszélyeztetése nélkül.

Az ultrahangos kezelés kedvező hatásai az ultrahangos FASP során

Az ultrahangos kezelés szabályozott akusztikus kavitációt – mikroszkopikus buborékok képződését és összeomlását – idézi elő, amely helyi nyíróerőket és mikroáramlásokat hoz létre.
Az ultrahangos kezelés az anyagátadás javításával és a reakciókinetika felgyorsításával az ultrahangos FASP alkilezési és emésztési lépését egyaránt javítja. Az ultrahangos energia alkalmazása kavitációt hoz létre, amely helyi mikroáramlásokhoz és átmeneti nyíróerőkhöz vezet; ezek elősegítik a gyors keveredést és a reagensek hatékony behatolását a fehérjemátrixba vagy a szűrő környezetébe. Az alkilezés során ez a ciszteinmaradékok jódacetamiddal történő egyenletesebb és gyorsabb módosítását eredményezi. Az emésztési lépésben az ultrahangos kezelés növeli a proteolitikus hasítási helyek hozzáférhetőségét és javítja az enzim–szubsztrát kölcsönhatásokat, ezáltal felgyorsítja a tripszin hatását és fokozza az emésztés hatékonyságát. Összességében az ultrahangos kezelés csökkenti a feldolgozási időt, miközben fenntartja vagy javítja a reakció teljességét és reprodukálhatóságát.

A proteomikai minta-előkészítésben az ultrahangos FASP a következőket eredményezi:

• Hatékonyabb sejtfeltárás és fehérjeextrakció, még nehezen feltárható szövetek vagy mikrobiális minták esetén is
• A fehérjék jobb szolubilizálása
• Jobb hozzáférhetőség az enzimek számára az emésztés során
• Rövidebb feldolgozási idő és nagyobb reprodukálhatóság

A hagyományos mechanikai vagy kémiai lízismódszerekkel ellentétben az ultrahangos feldolgozás nagymértékben szabályozható és skálázható, így különösen alkalmas szabványosított proteomikai munkafolyamatokhoz.

Az ultrahangos FASP előnyei a hagyományos megközelítésekkel szemben

Az ultrahangos kezelés FASP-protokollokba történő beépítése mérhető előnyöket biztosít, amelyek közvetlenül befolyásolják a későbbi tömegspektrometriás eredményeket.
Az ultrahangos FASP teljesebb fehérjekinyerést tesz lehetővé, különösen nehezen feldolgozható mintákból, például rostos szövetekből vagy biofilmekből. Az egyenletes energiaeloszlás következetes kezelést biztosít az ismétlések között, csökkentve a változékonyságot – ez a kvantitatív proteomika alapvető követelménye.
Emellett az ultrahangos kezelés az enzim–szubsztrát kölcsönhatás javításával felgyorsítja az emésztés kinetikáját. Ez gyakran rövidebb emésztési időt és nagyobb peptidhozamot eredményez, miközben megőrzi a szekvencialefedettséget.
A munkafolyamat szempontjából az ultrahangos rendszerek csökkentik a kézi beavatkozás szükségességét és kiküszöbölik az agresszív kémiai kezelések szükségességét, megőrizve a minta épségét és egyszerűsítve a protokoll szabványosítását.

Venn-diagram, amely az ultrahangos FASP révén azonosított fehérjék számának növekedését mutatja az egy éjszakán át végzett FASP-hoz képest
Kép és tanulmány: ©Carvalho et al., 2020

Protokoll: nagy mintaáteresztő képességű ultrahangos FASP az UIP400MTP készülékkel

A nagy mintasorozatokat feldolgozó laboratóriumok számára az UIP400MTP ultrahangos mikrolemez-kezelő szabványos többlyukú lemezek (pl. 96 lyukú lemezek) egyidejű ultrahangos kezelését teszi lehetővé, jelentősen növelve a mintaáteresztő képességet és a reprodukálhatóságot.
Ebben a formátumban a mintákat (jellemzően lyukanként 50–200 µL) közvetlenül ultraszűréssel vagy további feldolgozással kompatibilis mikrolemezekben készítik elő. A lízispufferek hasonlóak a standard FASP-protokollokban használtakhoz.

Az UIP400MTP minden lyukban egyenletes ultrahangos energiát biztosít. Az ultrahangos kezelést a minta típusától függően jellemzően 60–80% amplitúdón, 2–4 percig végzik. A csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelővel figyelje a hőmérsékletet. Alkalmazzon impulzusos ultrahangos kezelést, és igény szerint használjon laboratóriumi hűtőkészüléket.

Példaprotokoll:

1. Az alkilezési lépéshez a mintákat az ultrahangos mikrolemez-kezelővel (UIP400MTP), 40% amplitúdón, 7 ciklusban kezelik (30 s BE, 15 s KI; teljes ultrahangos kezelési idő: 5 min 45 s).
2. Az ultrahangos kezelés után a jódacetamid- (IAA-) oldatot centrifugálással eltávolítják. A tripszines emésztés előtt a mintákat meg kell mosni a maradék karbamid eltávolításához, amely erős kaotróp anyagként gátolja az enzimaktivitást. Ezért a mintákat kétszer mossák 200 μL 25 mM-os ammónium-hidrogén-karbonáttal (AmBic).
3. Ezt követően 100 μL, 12,5 mM-os ammónium-hidrogén-karbonátban elkészített tripszinoldatot adnak hozzá (1:30 enzim–fehérje arány). A fehérjék emésztését ezután az UIP400MTP készülékkel, azonos ultrahangos kezelési körülmények között végzik (40% amplitúdó, 7 ciklus, 30 s BE / 15 s KI; teljes idő: 5 min 45 s).
4. Az ultrahangos kezelés után a mintákat szűrőlemezekre helyezik át, vagy lemezalapú FASP-rendszerekkel dolgozzák fel. A redukciós és alkilezési lépéseket a lemezen belül végzik, fenntartva az egyszerűsített munkafolyamatot.
5. A tripszines emésztést szabályozott körülmények között végzik (pl. 37°C, 4–16 óra), és lehetőség van rövid ultrahangos stimulációra az enzimaktivitás felgyorsítása és a peptidhozam javítása érdekében.
6. A peptideket centrifugálással nyerik ki, és készen állnak az LC-MS/MS módszerrel végzett elemzésre.

A rendszer legfontosabb előnye, hogy minden lyukban azonos feldolgozási körülményeket biztosít, minimalizálva a feldolgozási tételek közötti eltérések hatását, és megbízható kvantitatív összehasonlításokat téve lehetővé nagyszabású proteomikai vizsgálatokban.

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban készült minőség

A Hielscher ultrahangos készülékei a legmagasabb minőségi és tervezési követelményeikről ismertek. Robusztusságuk és egyszerű kezelésük lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos készülékei könnyedén megbirkóznak a mostoha körülményekkel és az igényes környezetekkel.

A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, amely különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű, korszerű technológiát és felhasználóbarát működést kínáló ultrahangos készülékekre. A Hielscher ultrahangos készülékei természetesen megfelelnek a CE előírásainak, valamint az UL, CSA és RoHs követelményeinek.

Szakirodalom / Hivatkozások

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).