Ultrahangos szűrővel támogatott mintakészítés (FASP): a proteomikai munkafolyamatok fejlesztése fejlett ultrahangos kezeléssel
Az ultrahangos szűrővel támogatott mintaelőkészítés (FASP) a modern proteomika rendkívül hatékony és reprodukálható módszerévé vált. Az ellenőrzött szonikációnak a bevált FASP munkafolyamatokba történő integrálásával a kutatók jelentősen javíthatják a fehérjeextrakciót, az emésztés hatékonyságát és az általános adatminőséget. A nagy áteresztőképességű és reprodukálható mintaelőkészítés iránti növekvő kereslet miatt a fókuszált szonikátorok, mint például az UIP400MTP mikrolemez szonikátor, egyre nagyobb tudományos és gyakorlati jelentőségre tesznek szert.
Tudományos kontextus: Miért fontos a FASP a proteomikában?
A szűrővel támogatott mintaelőkészítés (FASP) a bottom-up proteomika arany standardjává vált, mivel képes eltávolítani a detergenseket, sókat és egyéb szennyeződéseket, miközben lehetővé teszi a hatékony enzimatikus emésztést. A klasszikus FASP protokollok azonban gyakran szembesülnek a hiányos lízishez, a következetlen emésztéshez és a minták változékonyságához kapcsolódó korlátokkal. – különösen akkor, ha összetett vagy ellenálló biológiai sejtekről vagy szövetekről van szó.
Ez az a terület, ahol a fókuszált ultrahangos energia (szonikáció) döntő előnyt jelent. A mechanikai nyíróerők és a kavitáció bevezetésével a szonikáció a FASP munkafolyamat több kritikus lépését is javítja anélkül, hogy a fehérjék integritását veszélyeztetné.
Több lyukú lemezes szonikátor UIP400MTP megkönnyíti a szűrővel támogatott mintaelőkészítést (FASP)
A szonikáció pozitív hatásai az ultrahangos FASP-ben
A szonikáció ellenőrzött akusztikus kavitációt eredményez – mikroszkopikus buborékképződés és összeomlás – ami helyi nyíróerőket és mikroáramlást generál.
A szonikáció az ultrahangos FASP-ben az alkilezési és az emésztési lépéseket is fokozza azáltal, hogy javítja a tömegátadást és felgyorsítja a reakciókinetikát. Az ultrahangos energia alkalmazása kavitációt generál, ami lokalizált mikroáramláshoz és átmeneti nyíróerőkhöz vezet, amelyek elősegítik a gyors keveredést és a reagensek hatékony behatolását a fehérjemátrixba vagy a szűrőkörnyezetbe. Az alkilezés során ez a ciszteinmaradványok jodoacetamiddal történő egyenletesebb és gyorsabb módosítását eredményezi. Az emésztési lépésben a szonikáció növeli a proteolitikus hasadási helyek hozzáférhetőségét és javítja az enzim-szubsztrát kölcsönhatásokat, ezáltal felgyorsítja a tripszin aktivitását és fokozza az emésztés hatékonyságát. Összességében az ultrahangos kezelés csökkenti a feldolgozási időt, miközben fenntartja vagy javítja a reakció teljességét és reprodukálhatóságát.
A proteomikai mintaelőkészítésben az ultrahangos FASP a következőket jelenti:
- Hatékonyabb sejtbontás és fehérjeextrakció, még kemény szövetekben vagy mikrobiális mintákban is
- A fehérjék fokozott szolubilizációja
- Jobb enzimelérhetőség az emésztés során
- Csökkentett feldolgozási idő és fokozott reprodukálhatóság
A hagyományos mechanikai vagy kémiai lízis módszerekkel ellentétben az ultrahangos feldolgozás jól szabályozható és méretezhető, így különösen alkalmas a standardizált proteomikai munkafolyamatok számára.
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
Az ultrahangos FASP előnyei a hagyományos megközelítésekkel szemben
A szonikáció beépítése a FASP protokollokba mérhető előnyöket biztosít, amelyek közvetlenül befolyásolják a későbbi tömegspektrometriás eredményeket.
Az ultrahangos FASP teljesebb fehérje kinyerést tesz lehetővé, különösen az olyan kihívást jelentő mintákból, mint a rostos szövetek vagy biofilmek. Az egyenletes energiaeloszlás biztosítja az ismétlések közötti következetes kezelést, csökkentve a változékonyságot. – a kvantitatív proteomika alapvető követelménye.
Ezenkívül a szonikáció az enzim-szubsztrát kölcsönhatás javításával felgyorsítja az emésztés kinetikáját. Ez gyakran rövidebb emésztési időt és nagyobb peptidhozamot eredményez, miközben a szekvencia-lefedettség megmarad.
A munkafolyamatok szempontjából az ultrahangos rendszerek csökkentik a kézi beavatkozást és kiküszöbölik az agresszív kémiai kezelések szükségességét, megőrizve a minta integritását és egyszerűsítve a protokollok szabványosítását.
Venn-diagram, amely az ultrahangos FASP-vel azonosított fehérjék számának növekedését mutatja az éjszakai FASP-hez képest.
Kép és tanulmány: ©Carvalho et al., 2020
UIP400MTP többmélységű lemez szonikátor szűrővel támogatott mintaelőkészítéshez (FASP)
Jegyzőkönyv: UIP400MTP: Nagy áteresztőképességű ultrahangos FASP az UIP400MTP-vel
A nagy mintakészleteket feldolgozó laboratóriumok számára az UIP400MTP mikrolemez-ultrahangos készülék lehetővé teszi a szabványos többlyukú lemezek (pl. 96-lyukú lemezek) egyidejű ultrahangos kezelését, ami jelentősen növeli az átbocsátóképességet és a reprodukálhatóságot.
Ebben a formátumban a minták (jellemzően 50-200 µl/lyuk) közvetlenül az ultraszűréssel vagy a downstream feldolgozással kompatibilis mikrolemezekben készülnek. A lízispufferek hasonlóak a standard FASP protokollokban használtakhoz.
Az UIP400MTP minden kútra egyenletes ultrahangos energiát alkalmaz. A szonikáció jellemzően 60-80%-os amplitúdóval történik 2-4 percig, a minta típusától függően. A hőmérsékletet a csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelő segítségével ellenőrizheti. Impulzus szonikációval és opcionálisan egy laboratóriumi hűtőhöz.
Példaértékű protokoll:
- Az alkilezési lépés során a mintákat mikrolemez-ultrahangosítóval (UIP400MTP) 40%-os amplitúdón 7 cikluson át kezeljük (30 másodperc bekapcsolva, 15 másodperc kikapcsolva; teljes ultrahangkezelési idő: 5 perc 45 másodperc).
- A szonikációt követően a jodoacetamid (IAA) oldatot centrifugálással eltávolítjuk. A tripszin emésztés előtt a mintákat mosni kell a maradék karbamid, az enzimatikus aktivitást gátló erős kaotróp szer eltávolítása érdekében. Ezért a mintákat kétszer 200 μL 25 mM ammónium-bikarbonáttal (AmBic) mossuk.
- Ezt követően 100 μL tripsinoldatot (1:30 enzim/fehérje arány) adunk hozzá, amelyet 12,5 mM ammónium-bikarbonátban készítettünk. Ezután a fehérjeemésztést az UIP400MTP segítségével végezzük el, ugyanolyan szonikációs körülmények között (40%-os amplitúdó, 7 ciklus, 30 s ON / 15 s OFF; teljes idő: 5 perc 45 s).
- A szonikálás után a mintákat szűrőlemezekre kell átvinni, vagy lemezalapú FASP-rendszerekkel kell feldolgozni. A redukciós és alkilezési lépéseket a lemezen belül végzik, fenntartva a racionalizált munkafolyamatot.
- A tripszin emésztést ellenőrzött körülmények között végzik (pl. 37°C, 4-16 óra), az enzimaktivitás felgyorsítása és a peptidhozam javítása érdekében rövid ultrahangos stimulációval.
- A peptideket centrifugálással nyerjük vissza, és készen állnak az LC-MS/MS analízisre.
A rendszer fő előnye abban rejlik, hogy képes azonos feldolgozási feltételeket biztosítani minden kútban, minimalizálva a tételhatásokat és lehetővé téve a nagyszabású proteomikai vizsgálatok robusztus mennyiségi összehasonlítását.
A VialTweeter multi-tube Sonicator felgyorsítja és javítja a szűrővel támogatott mintaelőkészítést (FASP) a proteomikában
Tudományos jelentőség
A szonikáció integrálása a FASP munkafolyamatokba nem pusztán technikai finomítás. – módszertani előrelépést jelent a proteomikai mintaelőkészítésben. Ahogy a terület a nagyobb áteresztőképesség, az automatizálás és a reprodukálhatóság felé halad, az ultrahangos technológiák a mintafeldolgozás alapvető szűk keresztmetszeteit kezelik.
A legújabb tanulmányok egyre inkább kiemelik a következetes mintaelőkészítés fontosságát a megbízható biomarkerek felfedezéséhez és a kvantitatív proteomikához. Az ultrahangos FASP közvetlenül hozzájárul ehhez a célhoz azáltal, hogy javítja az extrakció hatékonyságát, az emésztés konzisztenciáját és a munkafolyamat általános robusztusságát.
Ezenkívül az ultrahangos rendszerek skálázhatósága – az egyes fioláktól a VialTweeterrel a teljes mikrolemezekig az UIP400MTP-vel – összhangban van a feltáró és a nagy kohorszú proteomikai vizsgálatok iránti növekvő igénnyel.
Szerezzen be egy Sonicator-t, hogy megkönnyítse a FASP munkafolyamatát!
Az ultrahangos szűrővel támogatott mintaelőkészítés egyesíti a FASP bevált erősségeit a szonikáció fizikai előnyeivel. A lízis fokozásával, az emésztés javításával és a munkafolyamatok szabványosításával az ultrahangos rendszerek hatékony megoldást kínálnak a modern proteomika számára.
A Multi-Tube Sonicator VialTweeter és a Microplate Sonicator UIP400MTP példázza, hogy a fókuszált ultrahangos energia hogyan alakíthatja át a rutinszerű mintaelőkészítést hatékonyabb, reprodukálhatóbb és tudományosan megbízhatóbb folyamattá. – ami végső soron jobb minőségű proteomikai adatokhoz és mélyebb biológiai betekintéshez vezet.
Válassza ki a legmegfelelőbb szonikátort a szűrővel támogatott mintaelőkészítéshez
| Sonicator modell | Az FASP előnyei | Legjobb felhasználás |
| UIP400MTP mikrolemezes szonikátor | Egyenletes szonikálás a teljes mikroplasztikában; nagymértékben reprodukálható energiabevitel; felgyorsítja az alkilezést és az enzimatikus emésztést a nagy áteresztőképességű munkafolyamatokban; kompatibilis az automatizált mintaelőkészítéssel. | Nagy áteresztőképességű FASP munkafolyamatok 96 lyukú vagy hasonló lemezformátumokban, beleértve a proteomikai szűrési alkalmazásokat. |
| VialTweeter többcsöves szonikátor | Több zárt cső egyidejű, egyenletes szonikálása; minimalizálja a keresztszennyeződést és a mintaveszteséget; fokozza a reagensek behatolását és keveredését, javítva az alkilezés és az emésztés hatékonyságát. | Több FASP-minta párhuzamos feldolgozása mérsékelt teljesítmény mellett, magas reprodukálhatósággal. |
| Cuphorn (közvetett szonikáció “nagy intenzitású fürdő” lezárt csövek esetén) | Nagy intenzitású közvetett szonikálás zárt edényekhez; kiváló hőmérséklet-szabályozás és szennyeződésmentes feldolgozás; elősegíti a hatékony anyagátvitelt közvetlen szondakontaktus nélkül. | Minták feldolgozása különböző mintatartályokban / érzékeny vagy veszélyes minták esetében zárt tartályokra és egyenletes energiaelosztásra van szükség. |
| Laboratóriumi szonda típusú szonátorok (közvetlen szonikáció) | Maximális ultrahang-intenzitás és energiaátvitel; gyors bontás és reakciógyorsítás; hatékony a nehezen emészthető vagy rendkívül összetett fehérjeminták esetében. | Egyetlen minta feldolgozása, nagyobb minták vagy olyan igényes mátrixok, ahol maximális teljesítményre és sebességre van szükség. |
Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban gyártott minőség
A Hielscher ultrahangos készülékek jól ismertek a legmagasabb minőségi és tervezési szabványokról. A robusztusság és a könnyű kezelhetőség lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A durva körülmények és az igényes környezetek könnyen kezelhetők Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics egy ISO tanúsítvánnyal rendelkező cég, és különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű ultrasonicatorokra, amelyek a legmodernebb technológiát és felhasználóbarátságot mutatják. Természetesen a Hielscher ultrasonicators CE-kompatibilis és megfelel az UL, CSA és RoHs követelményeinek.
Gyakran Ismételt Kérdések
Mire használják a szűrővel támogatott mintaelőkészítést?
A szűrővel támogatott mintaelőkészítés (FASP) a fehérjeminták tömegspektrometriai alapú proteomikai elemzéshez való előkészítésére szolgál. Lehetővé teszi a detergensek, sók és egyéb kis molekulatömegű szennyeződések hatékony eltávolítását, miközben a fehérjéket egy molekulatömeg-határoló szűrőn tartják, ahol azok denaturálhatók, redukálhatók, alkilezhetők és enzimatikusan LC-MS/MS elemzésre alkalmas peptidekké emészthetők.
Milyen előnyei vannak a FASP-nek a proteomikában?
A FASP fő előnye a proteomikában az, hogy képes kezelni a komplex és detergensekben gazdag mintákat, miközben a tömegspektrometriával kompatibilis, rendkívül tiszta peptidkeverékeket állít elő. Javítja az emésztés hatékonyságát és reprodukálhatóságát azáltal, hogy a reakciókat zárt szűrőkörnyezetben végzi, csökkenti a mintaveszteséget a kicsapáson alapuló módszerekhez képest, és lehetővé teszi a hatékony puffercserét. Összességében a FASP javítja a peptidvisszanyerést, az adatminőséget és a proteom lefedettséget, így robusztus és széles körben elfogadott munkafolyamat az alulról felfelé irányuló proteomikában.
Irodalom / Hivatkozások
-
FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Az UIP400MTP érintésmentes szonikátor megkönnyíti a FASP-ot 96 lyukú lemezekben
Hielscher Ultrasonics gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok labor hoz ipari méret.