Mikrolemezes ultrahangos kezelés a shotgun proteomikában – Alkalmazási jegyzet

A shotgun proteomika hatékony, reprodukálható minta-előkészítésre támaszkodik ahhoz, hogy az összetett biológiai anyagokból LC-MS/MS elemzésre alkalmas peptidek keletkezzenek. Az UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos kezelőberendezés a kis térfogatú minták szabványosított, párhuzamos ultrahangos kezelésével támogatja ezt a folyamatot, segítve a laboratóriumokat a feltárás, az extrakció és az ismételt oldatba vitel javításában a mikrolemezes munkafolyamatok során. Ez az alkalmazási jegyzet bemutatja, hogyan integrálható az UIP400MTP a proteomikai minta-előkészítésbe, laboratóriumban tesztelt példaként egy PLA2G12A/Th17 vizsgálatokból származó, publikált extracellulárisvezikula-munkafolyamatot használva.

Mikrolemezes ultrahangos kezelés a jobban reprodukálható shotgun proteomikáért

A proteomikai kutatók számára a reprodukálható minta-előkészítés döntő fontosságú a kiváló minőségű LC-MS/MS adatok eléréséhez. Az UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos kezelőberendezés szabványosított, párhuzamos ultrahangos kezelést tesz lehetővé lemezalapú, valamint kis térfogatú mintákkal dolgozó, nagy mintaáteresztő képességű munkafolyamatokban.

Különösen hasznos az alábbiakkal dolgozó laboratóriumok számára:

• Nagy mintasorozatok, amelyek számos mérőhelyen egységes feldolgozást igényelnek
• Kis kiindulási anyagmennyiség, amelynél minimalizálni kell a mintaveszteséget és a változékonyságot
• Lipidekben gazdag minták, például extracelluláris vezikulák
• Összetett biológiai készítmények, amelyek hatékony feltárást, extrakciót vagy ismételt oldatba vitelt igényelnek
• Összehasonlító shotgun proteomika, amelyben alapvető a különböző körülmények és ismétlések közötti reprodukálhatóság

A mikrolemezes ultrahangos kezelés emésztés előtti beiktatásával a kutatók javíthatják a minták alkalmasságát az alábbiakra:

• Fehérjeextrakció és ismételt oldatba vitel
• Tripszin/Lys-C-emésztés
• Nano-LC/MS/MS adatgyűjtés
• Későbbi kvantitatív proteomikai elemzés

A mikrolemezes ultrahangos kezelés előnyös lehet az alábbiak számára:

• Proteomikai központi szolgáltató laboratóriumok
• EV-kutatólaboratóriumok
• Immunológiai és sejtbiológiai laboratóriumok
• Transzlációs kutatócsoportok
• Élettudományi csoportok, amelyek az egyedi minták előkészítéséről nagyobb mintaáteresztő képességű munkafolyamatokra térnek át

Nagy mintaáteresztő képességű minta-előkészítés az extracelluláris vezikulák proteomjának elemzéséhez

Mi a shotgun proteomika?

A shotgun proteomika az összetett biológiai minták jellemzésének meghatározó analitikai stratégiájává vált, a teljes sejtlizátumoktól és szövetkivonatoktól a tisztított sejtorganellumokon és extracelluláris vezikulákon át a kis kiindulási mennyiségű klinikai mintákig. Legfőbb erőssége a fehérjeemésztés, a nagy felbontású folyadékkromatográfia–tandem tömegspektrometria és a peptidekből a fehérjékre történő számítógépes következtetés összekapcsolásában rejlik. A végső proteomikai adatkészlet minősége azonban már jóval azelőtt eldől, hogy a minta a tömegspektrométerbe kerülne. A hatékony mintafeltárás, a fehérjék oldatba vitele, a zavaró anyagok eltávolítása, a reprodukálható enzimes emésztés és a megbízható peptidkinyerés egyaránt meghatározó a lefedettség mélysége és a kvantitatív megbízhatóság szempontjából.
A korlátozott mennyiségű vagy értékes mintákkal dolgozó proteomikai kutatók és élettudományi laboratóriumok számára gyakran a minta-előkészítés jelenti a szűk keresztmetszetet.

Az extracelluláris vezikulák jelentette kihívás a proteomikában

Az extracelluláris vezikulák (EV) például különösen nagy kihívást jelentő mintacsoportot alkotnak. Membránnal határolt, lipidekben gazdag, nanoméretű részecskék, amelyek viszonylag alacsony fehérjehozammal jellemezhetők, és nagy az esélye annak, hogy lipidek, sók, detergensek, szérumfehérjék és más mátrixkomponensek is továbbkerülnek velük. Ezek a tulajdonságok ronthatják az emésztés hatékonyságát, a kromatográfiás teljesítményt, az elektrospray stabilitását és a peptidazonosítást. Az extracelluláris vezikulák proteomikai előkészítési munkafolyamatának ezért elég hatékonynak kell lennie a vezikulaszerkezetek feltárásához és a szállított fehérjék oldatba viteléhez, miközben kompatibilisnek kell maradnia az ezt követő enzimes emésztéssel és LC-MS/MS elemzéssel.
Ebben az összefüggésben a mikrolemezekkel kompatibilis ultrahangos kezelés gyakorlati megközelítést kínál a reprodukálható, párhuzamos mintafeldolgozáshoz. A Hielscher UIP400MTP (400 W) és UIP550MTP (550 W) mikrolemezes ultrahangos kezelőberendezéseit több mérőhelyes lemezekben és kis térfogatú edényekben lévő minták ultrahangos kezelésére tervezték, így a hagyományos, egyetlen szondával működő ultrahangos kezelőberendezéseknél nagyobb mintaáteresztő képességű munkafolyamatokat támogatnak. A proteomikai laboratóriumok számára ez az elrendezés vonzó, mert csökkentheti a manuális munkából eredő változékonyságot, javíthatja több minta párhuzamos kezelését, és természetesebben illeszthető a lemezalapú minta-előkészítési folyamatokba.

Példaként szolgáló munkafolyamat

A PLA2G12A által vezérelt Th17 sejtek biológiájának egyik közelmúltbeli extracellulárisvezikula-proteomikai munkafolyamata hasznos, laboratóriumban tesztelt példát nyújt arra, hogyan építhető be az UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos kezelőberendezés a shotgun proteomikai minta-előkészítésbe. Ebben a vizsgálatsorozatban az extracelluláris vezikulák mintáit metanolos kezeléssel, az UIP400MTP készülékkel végzett ultrahangos kezeléssel, centrifugálással, szárítással, tripszin/Lys-C emésztéssel, valamint nano-térfogatáramú LC rendszerrel kapcsolt nagy felbontású tandem MS elemzéssel dolgozták fel proteomelemzés céljából. A biológiai kutatást Mochizuki-Ono és munkatársai 2026-ban közölték; a proteomikai elemzés segített jellemezni, hogyan módosítja a PLA2G12A az extracelluláris vezikulák által szállított fehérjéket a patogén T-sejtes válaszok összefüggésében.

UIP400MTP ultrahangos kezelőberendezés több mérőhelyes lemezekhez

Miért érdemes mikrolemezes ultrahangos kezelést alkalmazni?
Az UIP400MTP lehetővé teszi a kis térfogatú minták szabványosított, párhuzamos ultrahangos kezelését. Ez akkor hasznos, ha fontos a reprodukálhatóság, a kis kiindulási mintamennyiség és a több minta feldolgozását lehetővé tevő mintaáteresztő képesség.


Minőség-ellenőrzési ellenőrzőlista

• Ellenőrizze, hogy minden mintában azonos a kiindulási EV-fehérjeegyenérték-mennyiség.
• Használjon randomizált vagy kiegyensúlyozott mintafeldolgozási elrendezéseket.
• Tartsa egységesen a metanol térfogatát, az ultrahangos kezelés idejét, a szárítási időt és az emésztési térfogatot.
• Kövesse nyomon a peptidhozamot és az összes fehérjeazonosítás számát.
• Ellenőrizze a kihagyott hasítások arányát és a peptidhosszak eloszlását.
• Vizsgálja meg a kromatográfiás csúcsalakot és a retenciós idő reprodukálhatóságát.
• Iktasson be vakmintákat a mintaátvitel nyomon követésére.
• Nagyobb vizsgálatokhoz használjon egyesített QC-mintákat.
• Értékelje az ismétlések variációs együtthatóját.
• Használjon PCA-t vagy rokon módszereket a tételhatások vagy a kiugró minták azonosítására.

Ajánlások a dokumentáláshoz

A munkafolyamat publikálásakor vagy dokumentálásakor adja meg a kiindulási EV mennyiséget, a lemezformátumot, a metanol térfogatát, az UIP400MTP amplitúdóját és ultrahangos kezelési idejét, a centrifugálási körülményeket, a szárítási módszert, az emésztési puffert, az enzimkoncentrációt, az emésztési időt, a savanyítási körülményeket, az LC-MS/MS platformot, az adatgyűjtési módot, a szoftververziót, az adatbázist, az FDR küszöbértékét, a normalizálási módszert és a statisztikai munkafolyamatot.
Minden Hielscher mikrolemezes ultrahangos kezelőberendezés automatikusan rögzíti a fontos folyamatparamétereket, például az amplitúdót, az ultrahangos kezelés időtartamát és a hőmérsékletet dátum- és időbélyeggel, CVS-fájlként a beépített SD-kártyán. A reprodukálhatóságot és a minőség-ellenőrzést szolgáló adatrögzítés még soha nem volt ilyen egyszerű!

A vizsgálat részletesen: EV shotgun proteomika a PLA2G12A-vizsgálatban

A PLA2G12A vizsgálat konkrét példát nyújt az UIP400MTP használatára egy shotgun proteomikai munkafolyamatban. A biológiai kérdés az volt, hogyan módosítja a szekretált PLA2G12A foszfolipáz a Th17 sejtekből származó extracelluláris vezikulákat, és ezáltal hogyan befolyásolja a patogén T-sejtek differenciálódását. A szerzők kimutatták, hogy a PLA2G12A az extracelluláris vezikulák membránjaira hatva lizofoszfolipideket, köztük 1-oleoil-lizofoszfatidil-etanolamint termel, és hogy az ezt követő, LPA2 receptoron keresztüli lizofoszfatidsav-jelátvitel hozzájárul a Th17 sejtek differenciálódásához. A lipidjelátvitelen túl a vizsgálatok az extracelluláris vezikulák által szállított anyagokat, köztük az RNS- és fehérjetartalmat is vizsgálták, így a shotgun proteomika a jellemzési stratégia fontos összetevőjévé vált.
Az extracelluláris vezikulák előkészítési munkafolyamatában a Th17 sejteket exoszómáktól mentesített magzati szarvasmarhaszérumot tartalmazó tápközegben tenyésztették. A tenyészetek felülúszóit először centrifugálták a sejtek eltávolítására, 0,22 µm-es szűrőn átszűrték, ultraszűréssel/ultracentrifugálással koncentrálták, mosták, PBS oldatban újraszuszpendálták, és BCA fehérjevizsgálattal mennyiségileg meghatározták. Ez az előzetes vezikula-előkészítés biztosította, hogy az extracellulárisvezikula-anyag meghatározott fehérjeegyenérték-mennyisége kerülhessen a proteomikai munkafolyamatba.
A shotgun proteomikai elemzéshez a szerzők 5 µg fehérjeegyenértéknek megfelelő extracellulárisvezikula-mintákat használtak. Ezeket a mintákat PCR csövekben megszárították, majd 25 µL metanolt adtak hozzájuk. Ezután a mintákat 3 percig ultrahanggal kezelték az UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos kezelőberendezéssel. Az ultrahangos kezelést követően a mintákat 4°C-on 20 percig centrifugálták 19 000 × g mellett. 20 µL felülúszó eltávolítása után a mintákat szárazra centrifugálták. A fehérjéket ezután ultrahangos kezeléssel oldották fel 4 µL, 50 mM ammónium-hidrogén-karbonátban készített, 100 ng/µL koncentrációjú tripszin/Lys-C oldatban. Az emésztést 2 órán át, 37°C-on, 300 rpm sebességű rázatás mellett végezték. Az emésztményt 1 µL 1,25%-os trifluor-ecetsavval savanyították, majd nano-térfogatáramú LC rendszerrel kapcsolt nagy felbontású tandem tömegspektrometriás elemzésnek vetették alá.
Ez a munkafolyamat több hasznos alapelvet emel ki a kis kiindulási mennyiségű mintákkal végzett extracellulárisvezikula-proteomikához. Először is, a kiindulási mennyiséget fehérjeegyenérték alapján normalizálták, ami fontos a különböző genotípusokból vagy kezelésekből származó extracelluláris vezikulák összehasonlításakor. Másodszor, az ultrahangos kezelés előtt metanolt használtak, amely elősegítette a feltárást és az extrakciót, miközben elkerülték az LC-MS/MS elemzést esetleg megnehezítő detergensrendszereket. Harmadszor, az ultrahangos kezelési lépés rövid és szabványosított volt, ami kompatibilis a párhuzamos mintafeldolgozással. Negyedszer, a tripszin/Lys-C emésztést nagyon kis térfogatban végezték, csökkentve a hígulást, és elősegítve a peptidek kinyerését kis kiindulási mennyiségből. Végül az emésztésről a savanyításra és az LC-MS/MS elemzésre történő közvetlen áttérés minimalizálta a szükségtelen mintakezelési lépéseket.
Az ezt követő LC-MS/MS módszer nano-térfogatáramú fordított fázisú elválasztást alkalmazott Q-Exactive HF Orbitrap tömegspektrométerrel kapcsolva. A mintákat C18 előoszlopon kötötték meg, majd 50 µm belső átmérőjű analitikai oszlopon választották el, 200 nL/min térfogatáram és 40°C mellett. A gradiens 60 perc alatt az alacsony szervesoldószer-tartalomtól 35% B oldószerig emelkedett, majd magas szervesoldószer-tartalmú mosás és újbóli egyensúlyba hozás következett. Az MS adatgyűjtést pozitívion-módban, adatfüggetlen adatgyűjtéssel és nagyobb energiájú ütközéses disszociációval végezték. A DIA nyers adatfájljait DIA-NN 1.8 használatával, in silico előrejelzett spektrumkönyvtárral elemezték.