Mikrolemez-ultrahangkezelés a shotgun-proteomikában – Alkalmazási útmutató
A „shotgun” proteomika a komplex biológiai anyagok LC-MS/MS-re alkalmas peptidekké történő átalakításához hatékony, reprodukálható mintakészítésre támaszkodik. Az UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos készülék támogatja ezt a folyamatot azáltal, hogy lehetővé teszi a kis térfogatú minták szabványosított, párhuzamos ultrahangos kezelését, segítve ezzel a laboratóriumokat a mikrolemezes munkafolyamatok során a sejtfalak felbontásának, az extrakciónak és az újbóli oldhatóságnak a javításában. Ez az alkalmazási útmutató leírja, hogyan integrálható az UIP400MTP a proteomikai mintakészítésbe, laboratóriumi körülmények között tesztelt példaként felhasználva a PLA2G12A/Th17-vizsgálatokból származó, publikált extracelluláris vezikuláris munkafolyamatot.
Mikrolemezes ultrahangkezelés a jobb reprodukálhatóságú shotgun-proteomika érdekében
A proteomikai kutatók számára a reprodukálható mintakészítés elengedhetetlen a kiváló minőségű LC-MS/MS-adatokhoz. Az UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos készülék támogatja a szabványosított, párhuzamos ultrahangos kezelést lemezalapú és kis térfogatú/nagy áteresztőképességű munkafolyamatokban.
Különösen hasznos azoknak a laboratóriumoknak, amelyek a következő területeken dolgoznak:
- Nagy mintakészletek, amelyek számos kútban egységes feldolgozást igényelnek
- Olyan anyagok, amelyekből csak korlátozott mennyiség áll rendelkezésre, és amelyeknél a mintaelvesztést és a variabilitást a lehető legkisebb mértékre kell csökkenteni
- Lipidben gazdag minták, például az extracelluláris vezikulák
- Összetett biológiai készítmények, amelyek hatékony felbontást, extrakciót vagy újbóli oldhatóságot igényelnek
- Összehasonlító shotgun-proteomika, ahol elengedhetetlen a különböző körülmények és ismétlések közötti reprodukálhatóság
Az emésztés előtti mikrolemezes ultrahangkezelés beépítésével a kutatók javíthatják a minták előkészítettségét a következőkre:
- Fehérje-kivonás és újbóli oldhatósággá tétel
- Tripszin/Lys-C emésztés
- Nano-LC/MS/MS adatgyűjtés
- Kvantitatív downstream proteomikai elemzés
Ismerje meg, hogyan segít a mikrolemez-ultrahangkezelés a kézi eljárásokból adódó eltérések csökkentésében, a minták hatékonyabb felaprózásában, valamint a komplex biológiai minták előkészítésében a megbízható LC-MS/MS-elemzéshez.
A mikrolemezek ultrahangos kezelése előnyös lehet:
- Proteomikai központi laboratóriumok
- Elektromos járművekkel foglalkozó kutatólaboratóriumok
- Immunológiai és sejtbiológiai laboratóriumok
- Transzlációs kutatócsoportok
- Az élettudományi csapatok az egyetlen minta előkészítésétől a nagyobb áteresztőképességű munkafolyamatokig terjedő skálán dolgoznak
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
Nagy áteresztőképességű mintakészítés az extracelluláris vezikulák proteomjának elemzéséhez
Mi az a „shotgun proteomika”?
A „shotgun” proteomika a komplex biológiai minták jellemzésének központi analitikai stratégiájává vált, a teljes sejt-lizátumoktól és szöveti kivonatoktól kezdve a tisztított organellákig, az extracelluláris vezikulákig és az alacsony mennyiségű klinikai mintákig. Legfőbb erőssége a fehérjeemésztés, a nagy felbontású folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometria és a számítógépes peptid-fehérje következtetés összekapcsolásában rejlik. A végső proteom-adatkészlet minősége azonban már jóval azelőtt eldől, hogy a minta eljutna a tömegspektrométerhez. A hatékony mintaszétzúzás, a fehérjék oldhatóságának biztosítása, a zavaró anyagok eltávolítása, a reprodukálható enzimatikus emésztés és a megbízható peptid-visszanyerés mind döntő fontosságúak a lefedettség mélységének és a mennyiségi megbízhatóságnak a szempontjából.
A proteomikai kutatók és az élettudományi laboratóriumok számára, amelyek korlátozott mennyiségű vagy értékes mintákkal dolgoznak, a minták előkészítése gyakran jelent szűk keresztmetszetet.
A UIP400MTP biztosítja a megbízható mintaelőkészítést és a meglévő laboratóriumi munkafolyamatokkal való egyszerű integrációt
Az extracelluláris vezikulák jelentette kihívás a proteomikában
Az extracelluláris vezikulák (EV-k) például egy különösen nagy kihívást jelentő mintatípust képviselnek. Ezek membránnal körülvett, lipidben gazdag, nanoszintű részecskék, amelyek fehérje-kihozama viszonylag alacsony, és nagy a kockázata a lipidek, sók, detergensek, szérumfehérjék és egyéb mátrixkomponensek átvitelének. Ezek a tulajdonságok hátráltathatják az emésztés hatékonyságát, a kromatográfiás teljesítményt, az elektrospray-stabilitást és a peptidek azonosítását. Az EV-proteomikához szükséges előkészítési munkafolyamatnak ezért elég erősnek kell lennie ahhoz, hogy felbomlassza a vezikulák szerkezetét és oldhatóvá tegye a fehérjetartalmat, ugyanakkor kompatibilisnek kell maradnia a későbbi enzimatikus emésztéssel és az LC-MS/MS-elemzéssel.
Ebben az összefüggésben a mikrolemezzel kompatibilis ultrahangkezelés praktikus megoldást kínál a reprodukálható, párhuzamos mintakezeléshez. A Hielscher UIP400MTP (400 W) és UIP550MTP (550 W) mikrolemez-ultrahangkezelő modelleket többlyukú lemezekben és kis térfogatú edényekben lévő minták ultrahangkezelésére tervezték, és a hagyományos egyérintkezős ultrahangkezelőkhöz képest nagyobb áteresztőképességű munkafolyamatokat támogatnak. A proteomikai laboratóriumok számára ez a formátum azért vonzó, mert csökkentheti a kézi beavatkozásból adódó variabilitást, javíthatja a több minta párhuzamos feldolgozását, és természetesebben integrálható a lemezalapú mintakészítési folyamatokba.
Példaként szolgáló munkafolyamat
A PLA2G12A által vezérelt Th17-sejtek biológiájában nemrég alkalmazott, extracelluláris vezikulákra irányuló proteomikai munkafolyamat hasznos, laboratóriumi körülmények között tesztelt példát nyújt arra, hogy az UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos készülék hogyan integrálható a shotgun proteomikai mintakészítésbe. Ebben a tanulmánysorozatban az EV-mintákat proteomelemzés céljából metanolkezeléssel, UIP400MTP ultrahangkezeléssel, centrifugálással, szárítással, tripszin/Lys-C emésztéssel, valamint nanoáramlású LC-nagyfelbontású tandem MS-sel dolgozták fel. Ugyanezt a biológiai kutatást először egy bioRxiv-előnyomtatványban tették közzé, majd később a Cell Reports folyóiratban is megjelentették, ahol a proteomikai elemzés segített jellemezni, hogy a PLA2G12A hogyan módosítja az EV-ben található fehérjéket a patogén T-sejt-válaszok kontextusában.
UIP400MTP 96-lyukú lemezhez való ultrahangos készülék nagy áteresztőképességű fehérje-kivonáshoz
Ultrahangos készülék: UIP400MTP mikrolemezes szonikátor
Bemenet: 5 µg EV-fehérje-egyenérték
Emésztés: Tripszin/Lys-C
Kijelzés: Nano-LC-MS/MS / DIA proteomika
Lépésről lépésre: UIP400MTP-vel támogatott elektromos jármű-minták előkészítése a Shotgun-proteomikához
Ez a munkafolyamat egy alacsony bemeneti mennyiségű extracelluláris vezikulák (EV) „shotgun” proteomikai mintakészítési módszert ír le, amely az UIP400MTP mikrolemez-ultrahangosítót használja. A módszer egy korábban publikált EV-proteomikai munkafolyamaton alapul, amelynek során az EV-mintákat normalizálták, megszárították, metanollal kezelték, ultrahanggal kezelték, tripszinnel/Lys-C-vel emésztették, savasították, majd nano-LC-MS/MS-sel elemezték.
Az eljárás proteomikai kutatóknak és élettudományi laboratóriumoknak szól, amelyek EV-ket vagy más kis térfogatú, lipidben gazdag biológiai mintákat készítenek elő bottom-up shotgun proteomikai vizsgálatokhoz.
A munkafolyamat áttekintése
| Színpad | Cél | Fő eredmény |
|---|---|---|
| EV-előkészítés | Az EV-minták elkülönítése, mosása és mennyiségi meghatározása | Normalizált EV-bemenet |
| Minták szárítása | Az oldószerrel történő feldolgozás előtt távolítsa el a folyadékot | Szárított EV-anyag |
| Metanolkezelés | A lipidben gazdag EV-anyag szétesésének elősegítése | Metanollal nedvesített minta |
| UIP400MTP ultrahangos kezelés | A felforgatás, a kitermelés és a homogenizálás előmozdítása | Feldolgozott EV-minta |
| emésztés | Peptidek előállítása EV-fehérjékből | Tripszin/Lys-C peptid-emésztés |
| LC-MS/MS-elemzés | A peptidek elválasztása, kimutatása és mennyiségi meghatározása | Proteomikai adatkészlet |
| adatelemzés | Peptidek és fehérjék azonosítása és mennyiségi meghatározása | Fehérje-szintű eredmények |
Lépésről lépésre szóló eljárás
| lépés | Utasítás | Kritikus paraméterek |
|---|---|---|
| 1 | A laboratóriumban kialakított izolációs eljárás szerint készítsenek elő tisztított EV-mintákat. | A proteomikai előkészítés előtt távolítsa el a sejteket, a szövetmaradványokat és a nagyobb szennyeződéseket. |
| 2 | Mérje meg az EV fehérjetartalmát, például BCA-vizsgálattal. | Normalizáljuk az összes mintát úgy, hogy a fehérje-egyenértékű bemeneti mennyiség megegyezzen. |
| 3 | Helyezzen át 5 µg EV-fehérje-egyenértéket tiszta PCR-csövekbe vagy megfelelő kis térfogatú csövekbe. | Ha a minta veszteségétől tartanak, használjanak alacsony kötődésű csöveket. |
| 4 | Szárítsa meg teljesen az EV-mintákat. | Kerülje a túlmelegedést; győződjön meg arról, hogy nem maradt látható folyadék. |
| 5 | Adjunk 25 µL metanolt minden kiszárított EV-mintához. | Győződjön meg arról, hogy a szárított anyag teljesen átnedvesedett. |
| 6 | A mintákat 3 percig ultrahanggal kezelje az UIP400MTP mikrolemez-ultrahangkezelő készülék segítségével. | Minden mintánál azonos ultrahangkezelési beállításokat és elrendezési logikát kell alkalmazni. |
| 7 | Az ultrahanggal kezelt mintákat 19 000 × g-vel, 20 percig, 4 °C-on centrifugáljuk. | A centrifugálás után kerülje el a pelletek vagy az oldhatatlan anyagok felkavarását. |
| 8 | Óvatosan vegyen ki 20 µL felülúszót. | Minden mintánál egységes pipettázási technikát kell alkalmazni. |
| 9 | A fennmaradó mintát teljesen szárítsa meg. | Közvetlenül folytassa az emésztési folyamatot, vagy kizárólag validált körülmények között tárolja. |
| 10 | Adjunk hozzá 4 µL 100 ng/µL koncentrációjú tripszin/Lys-C oldatot 50 mM ammónium-hidrogén-karbonátban. | Készítsen friss enzimoldatot, vagy használjon megfelelően tárolt alikvotokat. |
| 11 | Rövid ideig ultrahanggal kezelje, hogy a kiszáradt fehérjeanyag feloldódjon az emésztőoldatban. | Az ultrahangkezelés után gyűjtsük össze az összes folyadékot a cső aljáról. |
| 12 | 37 °C-on, 300 fordulat/perc sebességgel rázva 2 órán át emésszük. | A kupakokat tartsa szorosan lezárva, hogy megakadályozza a párolgást. |
| 13 | Adjunk hozzá 1 µL 1,25%-os TFA-t a hidrolizátum savasításához. | A savasítás leállítja az emésztést, és előkészíti a peptideket az LC-MS/MS-re. |
| 14 | Helyezzük át a hidrolizátumot LC-MS-kompatibilis fiolákba vagy lemezekre. | Kerülje az oldhatatlan szennyeződések átvitelét. |
| 15 | Elemzés nano-LC-MS/MS módszerrel. | Használjon állandó befecskendezési térfogatot, LC-gradienst és MS-felvételi beállításokat. |
| 16 | A nyers adatokat a DIA, a DDA vagy a célzott proteomikai szoftver segítségével dolgozzuk fel, az esettől függően. | Állítsa be a megfelelő adatbázist, az enzim-specifitást, a módosítási beállításokat és az FDR-küszöbértékeket. |
Több lyukú lemezes szonikátor UIP400MTP
Miért érdemes mikrolemezeket ultrahanggal kezelni?
Az UIP400MTP lehetővé teszi a kis térfogatú minták szabványosított, párhuzamos ultrahangos kezelését. Ez akkor hasznos, ha fontos a reprodukálhatóság, a kis mintamennyiség és a több minta egyidejű feldolgozása.
Használjon bármilyen szabványos mikrolemezt! Nagy áteresztőképességű mintakészítés az UIP400MTP készülékkel
A hivatkozott EV-proteomikai munkafolyamat során 5 µg fehérje-egyenértékű EV-kiindulási anyagot, 25 µL metanolt, 3 perces UIP400MTP-szonikációt, tripszin/Lys-C emésztést, TFA-savazást és nano-LC-MS/MS-elemzést alkalmaztak.
Ajánlott LC-MS/MS-eljárások és adatelemzési lépések
Az emésztés és a savasítás után a minták elemzése nanoáramlású, fordított fázisú folyadékkromatográfiával (LC) és nagy felbontású tandem tömegspektrometriával történhet. A közzétett munkafolyamatban a peptideket egy nano-LC rendszeren választották el, majd az Orbitrap tömegspektrométeren adatfüggetlen adatgyűjtéssel elemezték őket.
| Színpad | Ajánlás | Cél |
|---|---|---|
| Minta betöltése | Használjon C18-csapdát vagy azzal egyenértékű peptid-betöltő rendszert. | Kivonja a peptideket és eltávolítja a rendkívül poláros szennyeződéseket. |
| Peptidek elválasztása | Használjon nanoáramlású fordított fázisú folyadékkromatográfiát. | Javítja a peptidek elválasztását és az MS érzékenységét. |
| MS felvásárlás | A vizsgálat felépítésétől függően alkalmazzon DIA-t, DDA-t vagy célzott MS-t. | Peptidszintű spektrális adatokat generál. |
| Adatbázis-keresés | Használjon a fajnak megfelelő referencia-adatbázist. | Támogatja a peptidek és fehérjék azonosítását. |
| FDR vezérlés | Alkalmazzuk a peptidek és fehérjék hamis felfedezési arányára vonatkozó küszöbértékeket. | Befolyásolja az azonosítás megbízhatóságát. |
| Mennyiségi meghatározás | A peptidek, prekurzorok és fehérjék mennyiségét tartalmazó táblázatok exportálása. | Lehetővé teszi a csoportok közötti statisztikai összehasonlítást. |
Minőség-ellenőrzési ellenőrzőlista
- Ellenőrizze, hogy az összes mintában azonos mennyiségű EV-fehérje-egyenértékű anyagot adtak-e hozzá.
- Használjon véletlenszerűen elrendezett vagy kiegyensúlyozott mintakezelési elrendezéseket.
- A metanol térfogatát, az ultrahangos kezelés időtartamát, a szárítási időt és az emésztési térfogatot tartsa állandó szinten.
- Kövesse nyomon a peptidhozamot és a teljes fehérje-azonosításokat.
- Ellenőrizze a kimaradt hasítások arányát és a peptidek hosszúsági eloszlását.
- Ellenőrizze a kromatográfiás csúcs alakját és a retenciós idő reprodukálhatóságát.
- Helyezzen be üres sorokat az átvitel nyomon követése érdekében.
- Nagyobb léptékű vizsgálatokhoz használjanak összevont minőség-ellenőrzési mintákat.
- Értékelje a replikációs variációs együtthatót.
- Használjon PCA-t vagy ahhoz hasonló módszereket a tételhatások vagy a kiugró minták azonosítására.
A jegyzőkönyvvezetésre vonatkozó ajánlások
A munkafolyamat közzétételekor vagy dokumentálásakor tüntesse fel az EV-adag mennyiségét, a lemez formátumát, a metanol térfogatát, az UIP400MTP amplitúdóját és ultrahangkezelési idejét, a centrifugálási feltételeket, a szárítási módszert, az emésztőpuffert, az enzimkoncentrációt, az emésztési időt, a savasítási feltételeket, az LC-MS/MS platformot, az adatgyűjtési módot, a szoftververziót, az adatbázist, az FDR-küszöbértéket, a normalizálási módszert és a statisztikai munkafolyamatot.
Minden Hielscher mikrolemez-ultrahangos készülék automatikusan rögzíti a fontos folyamatparamétereket – például az amplitúdót, az ultrahangkezelés időtartamát és a hőmérsékletet –, dátummal és időbélyeggel ellátva, CVS fájl formájában a beépített SD-kártyára. Az adatok rögzítése a reprodukálhatóság és a minőség-ellenőrzés érdekében még soha nem volt ilyen egyszerű!
A DIA-proteomika esetében minden mintánál egységes adatgyűjtési beállításokat kell alkalmazni, és lehetőség szerint vegyenek fel összevont minőség-ellenőrzési mintákat is. Figyeljék a prekurzorok számát, a retenciós idő stabilitását és a replikátumok közötti eltéréseket.
Ez a munkafolyamat egy laboratóriumi körülmények között tesztelt példa az elektromos járművek proteomikájára. Más mintatípusok esetében a teljes körű vizsgálatra való kiterjesztés előtt optimalizálja a bemeneti mennyiséget, az oldószer-feltételeket, az ultrahangos kezelés időtartamát, az emésztési térfogatot és az LC-MS/MS-befecskendezési stratégiát.
A tanulmány részletes ismertetése: EV-shotgun-proteomika a PLA2G12A-vizsgálatban
A PLA2G12A-vizsgálat konkrét példát nyújt az UIP400MTP használatára egy „shotgun” proteomikai munkafolyamatban. A biológiai kutatási kérdés az volt, hogy a szekretált PLA2G12A foszfolipáz hogyan módosítja a Th17-sejtekből származó extracelluláris vezikulákat, és ezáltal hogyan befolyásolja a patogén T-sejtek differenciálódását. A szerzők kimutatták, hogy a PLA2G12A az EV-membránokra hatva lizofoszfolipideket termel, köztük 1-oleoil-lizofoszfatidil-etanolamint, és hogy az LPA2-n keresztül történő, ezt követő lizofoszfatidsav-jelátvitel hozzájárul a Th17-differenciálódáshoz. A lipidjelátvitel mellett a tanulmányok az EV-k tartalmát is vizsgálták, beleértve az RNS- és fehérjetartalmat, így a shotgun-proteomika a jellemzési stratégia fontos eleme lett.
Az EV-előállítási munkafolyamat során a Th17-sejteket exoszómáktól megtisztított borjú szérumot tartalmazó tápközegben tenyésztettük. A tenyészet felülúszóit először centrifugálták a sejtek eltávolítása érdekében, majd 0,22 µm-es szűrőn szűrték, ultraszűréssel/ultracentrifugálással koncentrálták, mosták, PBS-ben reszuszpendálták, és BCA fehérje-assay segítségével meghatározták a mennyiségüket. Ez az EV-előkészítés biztosította, hogy meghatározott, fehérje-egyenértékű mennyiségű EV-anyag kerülhessen be a proteomikai munkafolyamatba.
A shotgun proteomikai elemzéshez a szerzők 5 µg fehérje-egyenértéknek megfelelő EV-mintákat használtak. Ezeket a mintákat PCR-csövekben szárították meg, majd 25 µL metanolt adtak hozzájuk. A mintákat ezután 3 percig ultrahangosították az UIP400MTP mikrolemez-ultrahangosítóval. Az ultrahangkezelés után a mintákat 4 °C-on, 19 000 × g-vel 20 percig centrifugálták. 20 µL felülúszó eltávolítása után a mintákat szárazra centrifugálták. Ezt követően a fehérjéket ultrahangos kezeléssel oldottuk fel 4 µL 100 ng/µL koncentrációjú tripszin/Lys-C oldatban, 50 mM ammónium-hidrogén-karbonátban. Az emésztést 2 órán át 37 °C-on, 300 rpm-es rázás mellett végeztük. Az emésztett anyagot 1 µL 1,25%-os trifluor-ecetsavval savasítottuk, majd nanoáramlású LC-nagyfelbontású tandem tömegspektrometriás elemzésnek vetettük alá.
Ez a munkafolyamat számos hasznos alapelvet mutat be a kis mennyiségű kiinduló anyaggal végzett EV-proteomika területén. Először is, a kiinduló anyagot fehérje-egyenérték alapján normalizálták, ami fontos a különböző genotípusokból vagy kezelésekből származó EV-k összehasonlításakor. Másodszor, az ultrahangos kezelés előtt metanolt alkalmaztak, ami elősegítette a sejtmembránok felbomlását és az extrakciót, miközben elkerülték az LC-MS/MS-t bonyolíthatóvá tevő detergensrendszerek használatát. Harmadszor, az ultrahangos kezelés rövid és szabványosított volt, ami összeegyeztethető a párhuzamos mintakezeléssel. Negyedszer, a tripszin/Lys-C emésztést nagyon kis térfogatban végezték, ami csökkentette a hígítást és elősegítette az alacsony bemeneti mennyiségű peptidek kinyerését. Végül, az emésztésből a savasításba, majd az LC-MS/MS-be történő közvetlen átmenet minimalizálta a felesleges kezelési lépéseket.
A későbbi LC-MS/MS-módszer nanoáramlású, fordított fázisú elválasztást alkalmazott, amelyhez egy Q-Exactive HF Orbitrap tömegspektrométer volt kapcsolva. A mintákat egy C18 előoszlopon fogták fel, majd 200 nL/min áramlási sebességgel és 40 °C hőmérsékleten egy 50 µm belső átmérőjű analitikai oszlopon választották el. A gradiens 60 perc alatt alacsony szerves oldószer-tartalomtól 35%-os B oldószer-tartalomig haladt, amelyet magas szerves oldószer-tartalmú mosás és újraegyensúlyozás követett. Az MS-adatgyűjtést pozitív ion módban végezték, adatfüggetlen adatgyűjtéssel és magasabb energiájú ütközési disszociációval. A DIA nyers fájlokat DIA-NN 1.8 szoftverrel, in silico előre jelzett spektrális könyvtár segítségével elemeztük.
Nagy áteresztőképességű fehérje-kivonás A 96 lyukú lemezes szonikátor UIP400MTP
Gyakran Ismételt Kérdések
Kinek hoz a legnagyobb hasznot a mikrolemez-ultrahangkezelés a shotgun-proteomikában?
A mikrolemez-ultrahangkezelés különösen hasznos azoknak a proteomikai laboratóriumoknak, amelyek több mintát dolgoznak fel párhuzamosan, ideértve a központi laboratóriumokat, a proteomikai kutatócsoportokat, az immunológiai laboratóriumokat, a transzlációs kutatócsoportokat, valamint azokat az élettudományi laboratóriumokat, amelyek a nagyobb áteresztőképességű LC-MS/MS munkafolyamatok felé haladnak. Különösen fontos szerepet játszik olyan esetekben, amikor a minták közötti reprodukálhatóság kritikus fontosságú.
Miért érdemes az UIP400MTP-t használni a hagyományos szondás ultrahangos készülék helyett?
A hagyományos szondás ultrahangos készülékek általában egyszerre csak egy mintát dolgoznak fel, és a minták közötti átvitel csökkentése érdekében gondos tisztítást igényelnek. Az UIP400MTP és UIP550MTP mikrolemezes ultrahangos készülékek támogatják a párhuzamos ultrahangkezelést lemezes vagy kis térfogatú formátumban, ami segít csökkenteni a kézi kezelést, javítja az eredmények konzisztenciáját, és egyszerűsíti a több mintából álló előkészítést. Ezenkívül könnyen integrálhatók az automatizált munkafolyamatokba is.
Hogyan illeszkedik az ultrahangkezelés a shotgun-proteomika munkafolyamatába?
Az ultrahangkezelést általában a mintakészítés előemésztési szakaszában alkalmazzák. Ez elősegítheti a sejtek felbomlását, az extrakciót, a homogenizálást és az újbóli oldhatóságot a tripszinnel, Lys-C-vel vagy tripszin/Lys-C keverékkel végzett enzimatikus emésztés előtt.
Ezen felül az ultrahangkezelés az emésztés során is alkalmazható, hogy jelentősen felgyorsítsa a fehérjék enzimatikus lebontását. Fedezze fel az ultrahangos fehérjeemésztésben rejlő lehetőségeket a gyors proteomikai munkafolyamat érdekében!
Hasznos-e a mikrolemez-ultrahangkezelés az extracelluláris vezikulák proteomikájában?
Igen. Az extracelluláris vezikulák lipidben gazdag, membránnal körülvett részecskék, amelyek feldolgozása reprodukálható módon nehézségekbe ütközhet. A hivatkozott PLA2G12A-tanulmányokban az EV-mintákat metanollal kezelték, UIP400MTP készülékkel ultrahangosították, megszárították, tripszinnel/Lys-C-vel emésztették, majd nano-LC/MS/MS módszerrel elemezték.
Milyen típusú minták esetében előnyös a mikrolemez-ultrahangkezelés?
A mikrolemezes ultrahangkezelés hasznos lehet sejtlizátumok, organellafrakciók, immunoprecipitátumok, fehérjeaggregátumok, membránban gazdag minták, extracelluláris vezikulák és egyéb kis térfogatú biológiai készítmények esetében. Minden mintatípus esetében optimalizálni kell az ultrahangkezelés intenzitását és időtartamát, az oldószer-feltételeket, a bevitt mennyiséget és az emésztési stratégiát.
A szonikáció helyettesíti-e az enzimatikus emésztést?
Nem. Az ultrahangkezelés elősegíti a minta emésztésre való előkészítését azáltal, hogy javítja a sejtek szétzúzását, az extrakciót vagy az újbóli oldhatóságot. A „bottom-up” shotgun proteomikához szükséges peptidek előállításához továbbra is szükség van proteolitikus emésztésre.
Tudjon meg többet az ultrahanggal elősegített fehérjeemésztésről a proteomikai munkafolyamatokban!
Az UIP400MTP kompatibilis-e az alacsony bemeneti mennyiségű proteomikával?
Igen, a mikrolemezes formátum kiválóan alkalmas olyan kis térfogatú munkafolyamatokra, ahol a minta megőrzése és az egységes feldolgozás fontos szerepet játszik. A közzétett EV-munkafolyamatban a proteomikai előkészítést 5 µg fehérje-egyenértékű EV-kiindulási anyaggal végezték.
Javíthatja-e a mikrolemez ultrahangos kezelése a reprodukálhatóságot?
A Hielscher ultrahangos készülékei több mintán át egységes ultrahangkezelési feltételek alkalmazásával segítik elő a reprodukálhatóságot. Ugyanakkor más tényezők – például a sejtek vagy az EV-k izolálása, a bemeneti minták normalizálása, az emésztés hatékonysága, az LC-MS/MS stabilitása, az adatfeldolgozás és a statisztikai elemzés – szintén hozzájárulnak a proteomika általános reprodukálhatóságához.
Javítja-e a mikrolemez ultrahangos kezelése a fehérjék azonosításának részletességét?
Ez hozzájárulhat az azonosítás mélységének javulásához, amennyiben a minta felbomlása vagy újbóli oldhatósága korlátozó tényezőnek bizonyul. A hatás a minta típusától, a fehérje kémiai tulajdonságaitól, a tisztítási stratégiától, az emésztési feltételektől, valamint az LC-MS/MS-módszer teljesítményétől függ.
Mit kell optimalizálni, mielőtt a munkafolyamatot rutinszerűen használni kezdjük?
A legfontosabb paraméterek közé tartozik a minta bevitel, a puffer vagy oldószer összetétele, a lemez formátuma, az ultrahangos kezelés amplitúdója és időtartama, a szárítási feltételek, a hidrolízis térfogata, az enzimkoncentráció, az inkubációs idő, valamint az LC-MS/MS-be történő befecskendezés mennyisége. Javasolt egy kísérleti teszt elvégzése, mielőtt a munkafolyamatot egy teljes kísérleti sorozatra alkalmaznák.
Alkalmazható-e ez a munkafolyamat a DIA-proteomikában?
Igen. A hivatkozott EV-munkafolyamat adatfüggetlen mintavételt alkalmazott, amelyet DIA-NN-elemzés követett. A mikrolemez ultrahangos kezelése az előkészítési folyamat része, és integrálható a DIA-, DDA- vagy célzott proteomikai módszerekkel.
Mely minőség-ellenőrzési mutatókat kell figyelemmel kísérni?
Az ajánlott minőség-ellenőrzési mutatók közé tartoznak a peptidhozam, az azonosított peptidek és fehérjecsoportok száma, a kimaradt hasítások aránya, a peptidek hosszúsági eloszlása, a kromatográfiás csúcs alakja, a retenciós idő stabilitása, a replikációs variációs együttható, az átvitel, valamint a biológiai csoportok PCA-val vagy kapcsolódó módszerekkel történő elválasztása.
Mi a legfőbb előnye annak, ha az UIP400MTP vagy UIP550MTP típusú mikrolemezes ultrahangos készülékeket beépítik a proteomikai mintakészítésbe?
A fő előnye a kis térfogatú minták szabványosított, párhuzamos feldolgozása. Ez segít a laboratóriumoknak csökkenteni a kézi feldolgozásból adódó eltéréseket, és a komplex biológiai mintákat következetesebben előkészíteni az emésztésre, az LC-MS/MS-mérésre és a kvantitatív proteomikai elemzésre.
A Hielscher mikrolemez-ultrahangos készülékei zökkenőmentesen integrálhatók az automatizált munkafolyamatokba.
Irodalom / Hivatkozások
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics gyárt nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorok labor hoz ipari méret.