Az extracelluláris mátrix extrakciója a 96 lyukú lemezekhez való UIP400MTP ultrahangos készülékkel

Az extracelluláris mátrix (EM) hagyományos extrakciós módszerei gyakran több lépésben bontják meg a biofilm mátrixát. Ezek az eljárások azonban időigényesek lehetnek, és nem mindig adnak következetes eredményeket, ami az eredmények változékonyságához vezethet. A 96 lyukú lemezekhez való UIP400MTP ultrahangos készülék jelentősen megkönnyíti az EM extrakcióját, rendkívül hatékony, pontos és egyenletes biofilmfeltárást biztosítva nagy áteresztőképességű formátumokban. A UIP400MTP fókuszált ultrahanggal szabályozott kavitációt hoz létre, amely hatékonyan megbontja a biofilm mátrixát, miközben megőrzi a biofilmbe ágyazott sejtek életképességét és épségét. A UIP400MTP használata javítja a későbbi vizsgálatok, például a metabolomikai és proteomikai elemzések, az életképességi tesztek és az antimikrobiális érzékenységi vizsgálatok reprodukálhatóságát és pontosságát. Az EM extrakciójának egyszerűsítésével a UIP400MTP lehetővé teszi a kutatók számára, hogy következetes és kiváló minőségű eredményeket érjenek el, mélyebb betekintést nyújtva a biofilmek dinamikájába és a külső ágensekkel való kölcsönhatásaikba.

Az extracelluláris mátrix extrakciója

Az extracelluláris mátrix (EM) a mikroorganizmusok, például a Candida albicans által képzett biofilmek kulcsfontosságú összetevője. A poliszacharidokból, fehérjékből, lipidekből és extracelluláris DNS-ből álló EM biztosítja a szerkezeti integritást, közvetíti a felületekhez való tapadást, és jelentősen hozzájárul az antimikrobiális rezisztenciához. Az EM extrakciója és elemzése elengedhetetlen a biofilmek biológiájának megértéséhez, a gyógyszerrezisztencia mechanizmusainak tisztázásához és új terápiás célpontok azonosításához.

Protokoll az extracelluláris mátrix (EM) Candida albicans biofilmekből történő extrakciójához a UIP400MTP használatával

Ez a protokoll a statikus Candida albicans biofilmek extracelluláris mátrixának (EM) extrakciójára összpontosít. A UIP400MTP ultrahangos készüléket a hagyományos kaparási vagy enzimalapú lépések kiváltására építi be az eljárásba a hatékonyság és a reprodukálhatóság javítása érdekében.

Szükséges anyagok és eszközök

Az EM extrakciójának lépésenkénti útmutatója

1. Statikus biofilm kialakítása
   Statikus biofilmek kialakításához oltson C. albicans-t egy 96 lyukú lemez lyukaiba RPMI-1640 tápközeg használatával. Minden lyuk azonos térfogatú inokulumot tartalmazzon (pl. lyukanként 200 µL).
   Inkubálja a lemezt 37°C-on, statikus körülmények között 24 órán át, hogy a lyukak felületén biofilm képződhessen.
2. A biofilm előkészítése az extrakcióhoz
   Az inkubálást követően óvatosan szívja le és távolítsa el az elhasznált tápközeget minden lyukból a biofilm megzavarása nélkül.
   Óvatosan öblítse át mindegyik lyukat steril PBS-sel (pl. 200 µL), hogy eltávolítsa a lazán tapadó sejteket és a planktonikus törmeléket. Ismételje meg ezt a lépést kétszer.
   Az ultrahangos kezelés előkészítéséhez adjon friss PBS-t vagy extrakciós puffert (pl. 200 µL) minden lyukhoz.
3. Ultrahangos kezelés a UIP400MTP készülékkel
   Helyezze a PBS-t vagy extrakciós puffert tartalmazó 96 lyukú lemezt a UIP400MTP ultrahangos készülék tálcájába. A többlyukú lemez megfelelő elhelyezéséhez kövesse a kézikönyv utasításait.
   Végezzen ultrahangos kezelést 5–6 percig kíméletes beállítással (60% amplitúdó, impulzusüzemmód), biztosítva a biofilm szerkezetének egyenletes megbontását és az EM összetevőinek felszabadulását.
   A túlzott felmelegedés vagy a minták károsodásának elkerülésére használja a UIP400MTP ultrahangos készülék hőmérséklet-szabályozását (hőmérséklet-érzékelő és beállítások).
4. Kezelés kationcserélő gyantával (CER)
   Vigye át az ultrahanggal kezelt folyadékot minden lyukból egy új 96 lyukú lemezre.
   Adjon kétszeres térfogatú CER-szuszpenziót (PBS-ben vagy pufferben elkészítve) minden lyukhoz (pl. lyukanként 400 µL össztérfogat).
   Zárja le a lemezt, és inkubálja lemezrázón vagy forgatóberendezésen 400 rpm mellett 3 órán át, hogy az EM összetevői megkötődhessenek és elkülöníthetők legyenek.
5. Elválasztás és szűrés
   Centrifugálja a lemezt 2 000 × g mellett 10 percig, hogy elválassza a gyantát és a sejteket a felülúszótól.
   Óvatosan vigye át az EM-et tartalmazó felülúszót minden lyukból egy új 96 lyukú lemezre.
   Szűrje át a felülúszót egy 0,22 µm-es szűrőn lemezekhez kialakított vákuumos elosztórendszerrel vagy azzal egyenértékű rendszerrel, hogy tiszta EM-extraktumot kapjon.
6. Az EM elemzése
   Az EM összetevőinek jellemzéséhez használjon olyan technikákat, mint az UPLC-Q-TOF-MS a nem célzott metabolitprofil-meghatározáshoz, vagy alkalmazzon specifikus vizsgálatokat (pl. BCA-vizsgálatot a fehérjékhez, valamint triglicerid- és szénhidrát-kvantifikáló készleteket).

Az extracelluláris mátrix nagy áteresztőképességű extrakciója

Az extracelluláris mátrix (EM) UIP400MTP ultrahangos készülékkel végzett extrakciójának nagy hatékonysága forradalmasította a minta-előkészítést a biofilmek tulajdonságainak pontos elemzését igénylő vizsgálatokhoz. A UIP400MTP ultrahanghullámokkal pontosan és egyenletesen bontja meg a biofilm mátrixát, lehetővé téve az EM összetevőinek hatékony felszabadulását, miközben megőrzi a sejtek életképességét és épségét. Ez a megközelítés jelentősen javítja az olyan vizsgálatok megbízhatóságát, mint a biofilmek életképességi tesztjei, a proteomikai és metabolomikai vizsgálatok, valamint az antimikrobiális érzékenység értékelése.

A biofilmekből visszanyerhető sejtek vizsgálatakor, például a telepképző egységek (CFU) számlálásakor, a UIP400MTP készülékkel végzett EM-extrakció biztosítja, hogy a reagensek akadálytalanul hozzáférjenek a biofilmbe ágyazott sejtekhez. Hasonlóképpen, a proteomikai és metabolomikai elemzések, például az UPLC-Q-TOF-MS, előnyt élveznek a fehérjék, lipidek és metabolitok nagy hozamú izolálásából. A UIP400MTP a pontos antimikrobiális érzékenységi vizsgálatokat is támogatja, lehetővé téve a biofilm MIC- és MBEC-értékeinek pontos meghatározását. Ezenkívül a UIP400MTP által megkönnyített hatékony extrakció segíti az enzimaktivitási vizsgálatokat, az összetevők mennyiségi meghatározását és a szerkezeti vizsgálatokat, értékes betekintést nyújtva az extracelluláris mátrixok szerepébe a biofilmek felépítésében, tapadásában és rezisztenciamechanizmusaiban.

Ez a nagy áteresztőképességű, reprodukálható extrakciós módszer optimalizálja az EM előkészítését, és kiválóbb eredményeket biztosít a biofilmekkel kapcsolatos vizsgálatok széles körében.