Váltsa ki a sejtkaparást a nagy áteresztőképességű UIP400MTP ultrahangos készülékkel

A letapadó sejtvonalak leválasztása és extrakciója többlyukú lemezekről multiomikai elemzés céljából mindennapos feladat a laboratóriumokban. A többlyukú lemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos készülékkel végzett, nagy áteresztőképességű sejtleválasztás kiváltja a kézi sejtkaparást, és nagyobb RNS-, összlipid- és összespolárismetabolit-hozamot eredményez. Egy új módszer a Hielscher UIP400MTP ultrahangos készüléket a Beckman Coulter i7 folyadékkezelő munkaállomással integrálja, lehetővé téve a sejtek nagy áteresztőképességű, reprodukálható és hatékony feldolgozását az RNS, a metabolitok és a lipidek extrakciójához. A bemutatott módszer felülmúlja a hagyományos kézi sejtkaparási módszereket, mivel különböző sejttípusok és kísérleti körülmények esetén jobb reprodukálhatóságot és nagyobb hozamot biztosít.

Egyszerűsítse a sejtleválasztást a mikrolemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos készülékkel

A letapadó sejttenyésztési rendszerek kulcsfontosságú szerepet játszanak a toxikológiai és az orvosbiológiai kutatásokban. Ebben az összefüggésben Cruchley-Fuge et al. (2024) egy jelentős kihívással foglalkoztak a PrecisionTox projektben, amely az omikai technológiák alkalmazására összpontosított a vegyi anyagok veszélyességének értékelésében. A projekt célja különféle vegyi anyagokkal kezelt minták ezreinek nagy áteresztőképességű elemzése volt. Ezen igény kielégítésére a kutatók automatizált munkafolyamatot dolgoztak ki, amely az UIP400MTP ultrahangos készüléket bevált kétfázisú extrakciós protokollokkal kombinálta a folyadékkromatográfiás–tömegspektrometriás (LC-MS) elemzéshez. Tanulmányuk a többlyukú lemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos készülék hatékonyságát értékeli a letapadó sejtek leválasztásában, a kézi kaparással és más hagyományos módszerekkel összehasonlítva.

A multiomika egyszerűsítése: letapadó sejtek automatizált extrakciója az UIP400MTP készülékkel

A Birminghami Egyetemen dolgozó Laura Cruchley-Fuge kutatócsoportja három humán sejtvonalat használt: HepG2 (májráksejtek), HepaRG (differenciált hepatocitaszerű sejtek) és H295R (mellékveseráksejtek). Ezeket a sejteket 24 és 96 lyukú lemezeken tenyésztették, és olyan vizsgálati vegyi anyagoknak tették ki őket, mint az aflatoxin B1 és a forskolin.

Kísérleti terv:

1. fázis: Az UIP400MTP ultrahangos készülék teljesítménybeállításainak optimalizálása, valamint összehasonlítás a kézi sejtkaparással és az ultrahangos vízfürdőkkel. Az RNS, a metabolitok és a lipidek kinyerésének értékeléséhez HepG2 sejteket használtak.
2. fázis: Az UIP400MTP integrálása egy kétfázisú extrakciós munkafolyamatba a Beckman Coulter i7 rendszer használatával. A validálást HepaRG és H295R sejtekkel végezték.

Extrakciós munkafolyamat: A munkafolyamat magában foglalta a többlyukú lemezeken végzett vegyianyag-expozíciókat, a sejtek leválasztását az UIP400MTP készülékkel, valamint a Bligh & Dyer (B&D) módszerrel végzett kétfázisú extrakciót. A lipofil és poláris vegyületek LC-MS elemzését Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120 készülékkel végezték. A B&D módszer, amely a lipidek mennyiségi meghatározásában arany standardnak számít, metanollal, kloroformmal és vízzel végzett kétlépéses extrakciót foglal magában, amelyet a lipidek mennyiségi meghatározása követ a kloroformfázisban.

A mikrolemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos készülék megkönnyíti a letapadó sejtvonalak leválasztását a többlyukú lemezekről és a Petri-csészékről

Eredmények:

1. fázis: Az optimális ultrahangos kezelési körülményeket 60%-os teljesítménynél azonosították.
Az UIP400MTP biztosította a legnagyobb RNS-kinyerést, kivételes reprodukálhatósággal a kézi kaparáshoz és az ultrahangos fürdőkhöz képest.
A poláris metabolitok kinyerése az egyes módszerekkel hasonló volt, míg a lipidek kinyerése az UIP400MTP készülékkel számottevően jobb volt.
2. fázis: A HepaRG és H295R sejteken végzett validálás a lipidomikai és metabolomikai adatok nagyfokú reprodukálhatóságát mutatta, amit a PCA-pontszámok szoros csoportosulása jelzett.
Az aflatoxin B1- és forskolinkezeléseket hatékonyan elkülönítették a kontrolloktól, ami kiemeli a módszer érzékenységét és megbízhatóságát.

„A Hielscher UIP400MTP ultrahangos kezelőberendezés kiváló minőségű és reprodukálható alternatív megközelítést kínál a kézi sejtkaparás „arany standardjával” szemben, nagyobb RNS-, összlipid- és összespolárismetabolit-hozamot eredményezve.” (Cruchley-Fuge et al., 2024)

Cruchley-Fuge et al. kiemelik az UIP400MTP ultrahangos készülék előnyeit a letapadó sejtek feldolgozásában. A kézi kaparás kiváltásával ez a módszer javítja a reprodukálhatóságot, növeli a mintafeldolgozási kapacitást és a hozamot, így felbecsülhetetlen értékű eszközzé válik az olyan nagyszabású vizsgálatokban, mint a PrecisionTox. Az UIP400MTP automatizált munkafolyamatokba történő integrálása nemcsak a variabilitást csökkenti, hanem a munkaigényes folyamatokat is egyszerűsíti, lehetővé téve kiváló minőségű multiomikai adatok gyűjtését.

Cruchley-Fuge et al. (2024) munkája megkönnyíti és egyszerűsíti a letapadó sejttenyészetek feldolgozását multiomikai elemzés céljából. Az UIP400MTP ultrahangos készülék automatizált munkafolyamatokkal történő integrálása egyenletes és hatékony minta-előkészítést biztosít, így ideálisan alkalmas a nagy áteresztőképességű toxikológiai kutatásokhoz.

A Hielscher UIP400MTP a legrugalmasabban használható szonikátor többlyukú lemezekhez, PCR-lemezekhez vagy mintacsövekhez. Folyamatos, 400 wattos ultrahangos kimeneti teljesítményével olyan alkalmazásokra készült, mint a sejtlízis, emulgeálás, fehérje-extrakció, DNS / RNS-fragmentálás, deagglomerálás, FFPE-extrakció, nanoanyagok diszpergálása vagy emulgeálás. A UIP400MTP nem ultrahangos fürdő, hanem nagy intenzitású, kehely alakú ultrahangos kürttel működő készülék fókuszált ultrahangos kezeléshez. Ez a nagy teljesítményű, érintkezésmentes szonikátor egyenletes ultrahangos kezelést biztosít a szabványos lemez minden lyukában. Az amplitúdó, a teljesítmény és az impulzusüzem precízen szabályozható. A beépített időzítő és hőmérséklet-érzékelő egyenletes eredményeket biztosít. A UIP400MTP lemezszonikátor vízfürdővel hűti a mintákat, és opcionálisan külső hűtőberendezéssel is kiegészíthető.

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban készült minőség

A Hielscher ultrahangos készülékek a legmagasabb minőségi és tervezési színvonalukról ismertek. Strapabíróságuk és egyszerű kezelésük lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását az ipari létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos készülékek könnyedén megbirkóznak a zord körülményekkel és az igényes környezetekkel.

A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, amely különös hangsúlyt fektet a csúcstechnológiát és felhasználóbarát kezelést kínáló, nagy teljesítményű ultrahangos készülékekre. Természetesen a Hielscher ultrahangos készülékek megfelelnek a CE előírásainak, valamint az UL, CSA és RoHs követelményeinek.

Kapcsolódó témák

Szakirodalom / Hivatkozások

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.

Gyakran ismételt kérdések

Mi a sejtleválasztás?

A kutatásban a sejtleválasztás a letapadó sejtek elválasztását jelenti a tenyésztőedény vagy a hordozó felületétől. Ezt általában a sejtek begyűjtése céljából végzik olyan további alkalmazásokhoz, mint az elemzés, az átoltás vagy a krioprezerválás. A leválasztás enzimatikus módszerekkel (pl. tripszinnel), vegyi anyagokkal (pl. EDTA-val), mechanikai módszerekkel (pl. kaparással) vagy fizikai technikákkal, például ultrahangos kezeléssel érhető el, a sejttípustól és a kutatási követelményektől függően.

Hogyan választhatók le a letapadó sejtek?

A letapadó sejtek ultrahangos kezeléssel történő leválasztása során fókuszált ultrahanghullámokat alkalmaznak, hogy szabályozott környezetben megszüntessék a sejtek felülethez való tapadását. A mikrolemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos készülék ezt konkrétan helyi mechanikai rezgések létrehozásával éri el, amelyek megszakítják a sejtek és a tenyésztőfelület közötti kötéseket. A fő lépések a következők:

Előkészítés: A sejteket többlyukú lemezeken tenyésztik, és a kísérleti terv részeként meghatározott vegyi anyagoknak is kitehetik őket.
Ultrahangos kezelés: Az UIP400MTP ultrahangos készüléket optimalizált beállításokkal (pl. 60%-os teljesítménnyel) programozzák, hogy biztosítsák a hatékony leválasztást a sejtek károsítása vagy a biomolekulák épségének veszélyeztetése nélkül.
Hőmérséklet-szabályozás: A készülék stabil hőmérsékletet tart fenn, hogy a folyamat során megakadályozza a sejtek vagy molekulák hő okozta károsodását.
Leválasztás után: A leválasztott sejteken további extrakciós protokollokat alkalmaznak, például a Bligh & Dyer kétfázisú módszert, az RNS, a lipidek és a metabolitok kinyerésére.

Ez a módszer felülmúlja a kézi kaparást automatizáltsága, reprodukálhatósága és a nagy áteresztőképességű, hatékony mintafeldolgozást lehetővé tevő képessége révén.

Mi a károsodásmentes sejtleválasztás?

A károsodásmentes sejtleválasztás a letapadó sejtek elválasztását jelenti a hordozójuktól anélkül, hogy veszélyeztetné a sejtek életképességét, épségét vagy működőképességét. Kíméletes módszerekkel, például szabályozott ultrahangos kezeléssel vagy enzimmentes oldatokkal érhető el.
A sejtek roncsolásának elkerülése kulcsfontosságú szerkezeti és molekuláris jellemzőik megőrzéséhez, amelyek elengedhetetlenek az olyan további alkalmazások pontosságához, mint a multiomikai elemzés, a funkcionális vizsgálatok vagy a terápiás felhasználás. A károsodott sejtekből kiszabadulhat a sejten belüli tartalom, ami torzíthatja a kísérleti eredményeket vagy ronthatja a minta minőségét.

Mi az enzimmentes sejtleválasztás előnye?

Az enzimmentes sejtleválasztás számos előnnyel jár, többek között megőrzi a sejtfelszíni fehérjéket és receptorokat, fenntartja a sejtek életképességét, és elkerüli a biomolekulák esetleges enzimatikus károsodását. Ez a megközelítés különösen előnyös az olyan érzékeny további alkalmazásoknál, mint az áramlási citometria, a proteomika vagy a funkcionális vizsgálatok, amelyekben az enzimatikus változások ronthatják az adatok minőségét vagy a kísérleti eredményeket. Ezenkívül az enzimmentes módszerek gyakran jobban reprodukálhatók, és nagy áteresztőképességű munkafolyamatokhoz is adaptálhatók.