A minimális gátló koncentráció (MIC) vizsgálati protokollja

A biofilmalapú minimális gátló koncentráció (MIC) vizsgálata alapvető módszer az antimikrobiális szerek hatékonyságának értékelésére a biofilmhez társult mikroorganizmusokkal szemben, amelyek védő extracelluláris mátrixuk miatt fokozott rezisztenciát mutatnak. E vizsgálat egyik döntő lépése a biofilmstruktúrák leválasztása, hogy a beágyazott sejtek felszabaduljanak az életképesség pontos értékeléséhez. Az UIP400MTP többlyukú lemezekhez készült ultrahangos kezelőberendezés fókuszált ultrahanggal szabályozott kavitációt hoz létre, és ezzel elősegíti ezt a folyamatot: hatékonyan leválasztja a biofilm sejtjeit, és egyenletes szuszpenzióban diszpergálja őket. A biofilm ilyen pontos és reprodukálható megbontása növeli a MIC-vizsgálatok megbízhatóságát és mintafeldolgozási kapacitását, így az UIP400MTP alapvető eszköz a biofilmkutatás előmozdításában.

Miért érdemes ultrahangos kezelést alkalmazni a MIC-vizsgálatok során?

• Pontos, reprodukálható adatok: Hozzon létre egyenletes sejtszuszpenziókat, amelyek kiküszöbölik a mátrix védőhatását, így a telepszámok és az optikai sűrűség mérési eredményei valóban az antimikrobiális hatékonyságot tükrözik.
• Hatékony, nagy áteresztőképességű feldolgozás: Kezeljen egy teljes 96 lyukú lemezt egyszerre, mindössze 1–3 perc alatt, és váltsa fel a lassú, egyenetlen eredményű kézi lekaparást egy egyszerűsített munkafolyamattal.
• Megőrzött sejtéletképesség: Válassza le kíméletesen a beágyazott sejteket a lekaparás okozta fizikai károsodás nélkül, fenntartva a magasabb túlélési arányt a megbízható MIC/MBEC-számításokhoz.
• A keresztszennyeződés kockázata nulla: Használja ki az érintkezésmentes, csésze alakú ultrahangos sugárzóval kialakított konstrukció előnyeit, amely minden lyukat egyenletesen kezel anélkül, hogy szondák érintenék az egyes mintákat vagy lyukakat.
• Szabványoknak megfelelő módszertan: Igazítsa módszertanát validált iparági protokollokhoz, például az ASTM E2799-22-höz, hogy adatai hitelesebbek legyenek hatósági vagy publikációs célokra.
• Megbízható gyógyszer- és kezelésszűrés: Támaszkodjon érzékenységi eredményeire, hogy megalapozottabb döntéseket hozzon az antimikrobiális hatékonyság, a rezisztenciaprofil meghatározása vagy a terápiák fejlesztése terén.

Ultrahangos kezelés a biofilm leválasztásához

A biofilmalapú MIC-vizsgálat jellemzően a baktériumok életképességét vagy növekedésük gátlását méri olyan módszerekkel, mint a lemezre szélesztés, a telepszámlálás vagy az optikai sűrűség mérése. Az ultrahangos kezelés kulcsfontosságú lépés a biofilmalapú MIC-vizsgálatokban, amikor a biofilmhez társult mikroorganizmusok antimikrobiális érzékenységét értékelik. Elsődleges feladata a biofilmmátrixba ágyazott sejtek leválasztása és egyenletes szuszpenzióban történő diszpergálása a pontos elemzéshez.
A biofilmek lényegesen ellenállóbbak az antimikrobiális szerekkel szemben, mint a planktonikus sejtek, ezért a megfelelő leválasztás döntő fontosságú a pontos elemzéshez. E folyamat során az ultrahanghullámok szabályozott kavitációt hoznak létre, amely megbontja a biofilmmátrixot, és a beágyazott sejteket egyenletes szuszpenzióba szabadítja fel a visszanyerő tápközegben. Ez a lépés lehetővé teszi a biofilmből diszpergált sejtek életképességének pontos értékelését olyan módszerekkel, mint a lemezre szélesztés, a hígítás és a telepszámlálás. A biofilm megfelelő ultrahangos megbontása megakadályozza, hogy a visszamaradó mátrixkomponensek védjék a sejteket, ami egyébként az antimikrobiális aktivitás alulbecsléséhez vezethetne. Az UIP400MTP többlyukú lemezekhez készült ultrahangos kezelőberendezés különösen alkalmas erre a célra, mivel pontos és reprodukálható ultrahangos kezelési körülményeket biztosít a vizsgálati lemezek megbízható, nagy áteresztőképességű előkészítéséhez.

Miért szükséges az ultrahangos kezelés a biofilmalapú minimális gátló koncentráció vizsgálatában?

Az életképesség méréséhez és a sejtszámláláshoz az egyedi sejtek teljes és megbízható leválasztása és diszpergálása szükséges. Az UIP400MTP elősegíti a biofilm egyenletes, károsodásmentes leválasztását és a sejtek diszpergálását a megbízható vizsgálati eredmények érdekében.

• A biofilm összetettsége: A biofilmek extracelluláris polimer anyagokból (EPS) álló mátrixba zárt, strukturált mikrobiális közösségek; ez a mátrix védi a mikroorganizmusokat, és ellenállóbbá teszi őket az antimikrobiális szerekkel szemben.
• Egyenletes diszpergálás: A biofilmbe ágyazott sejtek életképességének vagy antimikrobiális szerekkel szembeni érzékenységének pontos méréséhez a biofilmet először le kell választani, és homogén szuszpenzióvá kell bontani.

A biofilmalapú minimális gátló koncentráció vizsgálati protokollja

A minimális gátló koncentráció (MIC) vizsgálata meghatározza az antimikrobiális szer azon legalacsonyabb koncentrációját, amely a mikroorganizmusok látható növekedésének gátlásához szükséges. Ezt a protokollt biofilmhez társult mikroorganizmusokhoz dolgozták ki, és az UIP400MTP többlyukú lemezekhez készült ultrahangos kezelőberendezést használja a biofilm megbontására.

1. lépés: A bakteriális inokulum előkészítése

1. Készítse elő a baktériumszuszpenziót:
   Tenyéssze a baktériumokat megfelelő tápközegekben a logaritmikus növekedési fázis közepéig.
   Hígítsa a tenyészetet a standardizált sejtsűrűség eléréséhez (pl. 0,5 McFarland-standard vagy OD600 ~0,1).
2. Készítse elő az antimikrobiális oldatokat:
   Hígítsa az antimikrobiális szert megfelelő tápközegben különböző koncentrációk létrehozásához (pl. kétszeres sorozathígításokkal).
3. Adagolja a 96 lyukú lemezbe:
   Adja az antimikrobiális oldatokat egy standard 96 lyukú lemez lyukaiba úgy, hogy a végső térfogat lyukanként ~150–200 µL legyen.
   Alkalmazzon növekedési kontrollokat (antimikrobiális szer nélkül) és sterilitási kontrollokat (bakteriális inokulum nélkül).

2. lépés: Biofilmképződés a csapos fedélen

• Helyezze fel a csapos fedelet:
  Helyezze a speciális csapos fedelet a beoltott lyukakra, ügyelve arra, hogy a csapok teljesen belemerüljenek a baktériumszuszpenzióba.
• Inkubálja a lemezt:
  Inkubálja megfelelő hőmérsékleten (pl. 37°C-on), meghatározott ideig (pl. 24 órán át), statikus körülmények között, hogy a csapokon biofilm képződhessen.

3. lépés: Antimikrobiális kezelés

• Öblítse le a csapokat:
  Emelje ki a csapos fedelet a baktériumszuszpenzióból, és óvatosan öblítse le steril sóoldatban vagy PBS-ben a lazán tapadó planktonikus sejtek eltávolításához.
• Tegye ki antimikrobiális szerek hatásának:
  Helyezze át a csapos fedelet egy új 96 lyukú lemezbe, amely a korábban elkészített antimikrobiális hígításokat tartalmazza.
  Inkubálja meghatározott ideig (pl. 24 órán át), statikus körülmények között, hogy az antimikrobiális szer kifejthesse hatását a biofilmekre.

4. lépés: Ultrahangos kezelés az UIP400MTP mikrolemez-kezelő ultrahangos berendezéssel

Az ultrahangos kezelés döntő fontosságú a biofilmek csapos fedelekről történő leválasztásához az életképesség értékelése céljából. Az UIP400MTP ultrahangos kezelőberendezés használatakor kövesse az alábbi lépéseket:

1. Készítse elő az összeállítást:
   Töltsön visszanyerő tápközeget (pl. semlegesítő folyékony táptalajt vagy steril tenyésztő tápközeget) egy új 96 lyukú lemez minden lyukába.
2. Helyezze át a csapos fedelet:
   Vegye le a csapos fedelet az antimikrobiális kezelőlemezről.
   Öblítse le a csapos fedelet steril sóoldatban vagy PBS-ben a visszamaradó antimikrobiális szerek eltávolításához.
3. Helyezze a lemezt az ultrahangos kezelőberendezésbe:
   Helyezze fel a csapos fedelet a visszanyerő tápközeget tartalmazó lemezre.
   Helyezze a visszanyerő tápközeget tartalmazó lemezt az UIP400MTP ultrahangos kezelőberendezésbe, ügyelve arra, hogy a lemez a kézikönyvben leírtak szerint középen és stabilan álljon.
4. Állítsa be az ultrahangos kezelés paramétereit:
   Állítsa be az ultrahangos kezelés paramétereit az UIP400MTP berendezésen (a beállítások a biofilmhez igazíthatók):
   Amplitúdó: 70–100%.
   Ultrahangos kezelési idő: 1–3 perc (a biofilm szerkezete alapján módosítható), ciklikus üzemmódban.
5. Végezze el az ultrahangos kezelést:
   Indítsa el az ultrahangos kezelést. Az ultrahanghullámok megbontják a biofilmmátrixot, és a sejteket leválasztva a visszanyerő tápközegbe juttatják.
6. Kövesse nyomon a folyamatot:
   A csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelővel kövesse nyomon a minták hőmérsékletét a lyukakban. Az UIP400MTP hűtés céljából laboratóriumi hűtőberendezéshez csatlakoztatható.
7. Az ultrahangos kezelés utáni műveletek:
   A leválasztott biofilmeket tartalmazó visszanyerő tápközeget azonnal helyezze át egy új, steril lemezbe a további elemzéshez.

(A) 2% glükózt tartalmazó TSB-vel töltött lemez, amelyet biofilmképzésre, sejtek visszanyerésére, valamint a MIC és az MBEC meghatározására használtak; (B) csapos fedél staphylococcus-biofilmek képzéséhez.
A csapokon képződött biofilmsejteket 5 min ultrahangos kezeléssel (Hielscher Ultrasound Technology) választották le olyan 96 lyukú lemezekben, amelyek friss tenyésztő tápközeget tartalmaztak a sejtek visszanyeréséhez.
(Kép és tanulmány: ©de Oliveira et al., 2016)

4. lépés: Az életképesség értékelése

Szélessze lemezre és tenyéssze a leválasztott biofilmeket:

1. Készítsen sorozathígításokat a visszanyerő tápközegből, és szélessze agarra a telepképző egységek (CFU) számlálásához.
2. Értékelje a MIC-et:
   Határozza meg a MIC-et mint azt a legalacsonyabb antimikrobiális koncentrációt, amely teljesen gátolja a látható mikrobiális növekedést a visszanyerő tápközegben.

MIC – minimális gátló koncentráció: példa mikrotiterlemezre és a mikrohígítási eredmények értelmezésére.
(Tanulmány és kép: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Kiknek előnyös az ultrahangos kezelés a MIC-vizsgálatok során?

• Orvostechnikai eszközök gyártói: A felületi bevonatok hatékonyságának vizsgálatához és a tisztítási protokollok validálásához olyan eszközöknél, amelyeken könnyen képződik biofilm.
• Klinikai mikrobiológusok: Az implantátumokhoz társult fertőzések (például a PJI) pontos diagnosztizálásához az orvostechnikai eszközökről visszanyert baktériumok segítségével.
• Gyógyszerfejlesztők: Új antimikrobiális szerek hatékonyságának értékeléséhez az ellenálló, biofilmbe ágyazott kórokozókkal szemben.
• Tudományos kutatók: Nagy áteresztőképességű, reprodukálható vizsgálatok végzéséhez a biofilmek biológiájáról és az antimikrobiális rezisztencia mechanizmusairól.
• Ipari minőségellenőrzési csoportok: A biológiai lerakódások és a fertőtlenítőszerek hatékonyságának értékeléséhez ipari környezetben (pl. az ASTM E2799-22 szabvány alkalmazásával).

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban készült minőség

A Hielscher ultrahangos berendezései a legmagasabb minőségi és tervezési színvonalukról ismertek. Robusztus felépítésük és egyszerű kezelésük lehetővé teszi ultrahangos berendezéseink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos kezelőberendezései könnyen megbirkóznak a zord körülményekkel és az igényes környezetekkel.

A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, amely különös hangsúlyt fektet a csúcstechnológiát és felhasználóbarát kezelést kínáló, nagy teljesítményű ultrahangos berendezésekre. A Hielscher ultrahangos berendezései természetesen megfelelnek a CE előírásainak, és teljesítik az UL, a CSA és a RoHs követelményeit.

Olvassa el itt, hogyan használják az UIP400MTP berendezést a biofilm leválasztására az ASTM E2799 protokollban – A fertőtlenítőszerek Pseudomonas aeruginosa biofilmmel szembeni hatékonyságának vizsgálata MBEC-vizsgálattal.