Minimális gátló koncentráció (MIC) vizsgálati protokoll

A Biofilm-Based Minimum Inhibitory Concentration (MIC) vizsgálat alapvető módszer az antimikrobiális szerek biofilm-asszociált mikroorganizmusokkal szembeni hatékonyságának értékelésére, amelyek védő extracelluláris mátrixuk miatt fokozott rezisztenciát mutatnak. A vizsgálat kulcsfontosságú lépése a biofilm struktúrák megzavarása, hogy beágyazott sejteket szabadítsanak fel a pontos életképességi értékelés érdekében. A UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátor megkönnyíti ezt a folyamatot azáltal, hogy fókuszált ultrahangot alkalmaz szabályozott kavitáció létrehozására, hatékonyan leválasztja a biofilm sejteket és egyenletes szuszpenzióba diszpergálja őket. Ez a precíz és reprodukálható biofilm-zavar növeli a MIC-vizsgálatok megbízhatóságát és teljesítményét, így a UIP400MTP a biofilm-kutatás fejlesztésének alapvető eszközévé válik.

Szonikálás a biofilm leválasztásához

A Biofilm-alapú MIC vizsgálat jellemzően a baktériumok életképességét vagy növekedésgátlását méri olyan módszerekkel, mint a lemezelés, a telepszámlálás vagy az optikai sűrűség mérése. A szonikálás kritikus lépés a biofilm alapú MIC-vizsgálatokban, amikor felmérik a biofilm-társult mikroorganizmusok antimikrobiális érzékenységét. Elsődleges feladata a biofilm mátrixba ágyazott sejtek leválasztása és diszpergálása egységes szuszpenzióba a pontos elemzés érdekében.
A biofilmek szignifikánsan ellenállóbbak az antimikrobiális szerekkel szemben, mint a planktonikus sejtek, így a megfelelő leválás kritikus fontosságú a pontos elemzéshez. E folyamat során az ultrahangos hullámok szabályozott kavitációt generálnak, szétbontják a biofilm mátrixot, és felszabadítják a beágyazott sejteket egy egységes szuszpenzióba a helyreállítási közegben. Ez a lépés lehetővé teszi a biofilm-diszpergált sejtek pontos életképességének értékelését olyan módszerekkel, mint a lemezelés, hígítás és telepszámlálás. A megfelelő biofilm megszakítása szonikálással megakadályozza a maradék mátrix komponensek árnyékolását a sejtektől, ami egyébként az antimikrobiális aktivitás alábecsüléséhez vezethet. A többlyukú lemezes szonikátor UIP400MTP különösen alkalmas erre a célra, pontos és reprodukálható szonikációs feltételeket kínálva a vizsgálati lemezek megbízható és nagy áteresztőképességű előkészítésének biztosítása érdekében.

Miért van szükség szonikálásra a biofilm alapú minimális gátló koncentráció vizsgálatokban

Az életképességi mérésekhez és a sejtszámláláshoz az egyes sejtek teljes és megbízható leválasztása és diszperziója szükséges. A UIP400MTP elősegíti az egyenletes, nem káros biofilm leválást és sejtdiszperziót a robusztus vizsgálati eredmények érdekében.

• Biofilm komplexitás: A biofilmek strukturált mikrobiális közösségek, amelyek extracelluláris polimer anyag (EPS) mátrixba vannak zárva, amely védi a mikroorganizmusokat és ellenállóbbá teszi őket az antimikrobiális szerekkel szemben.
• Egyenletes diszperzió: A biofilmbe ágyazott sejtek életképességének vagy antimikrobiális szerekkel szembeni érzékenységének pontos méréséhez a biofilmet először ki kell szorítani és homogén szuszpenzióra kell bontani.

Biofilm-alapú minimális gátló koncentráció vizsgálati protokoll

A minimális gátló koncentráció (MIC) vizsgálat meghatározza az antimikrobiális szer azon legalacsonyabb koncentrációját, amely a mikroorganizmusok látható növekedésének gátlásához szükséges. Ezt a protokollt biofilmhez kapcsolódó mikroorganizmusokhoz tervezték, UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátort használva a biofilm megzavarására.

1. lépés: Bakteriális inokulum előállítása

1. Készítse elő a baktérium-szuszpenziót:
   Tenyésztjük a baktériumokat megfelelő közegben a logaritmikus fázis közepéig.
   Hígítsuk fel a tenyészetet, hogy standardizált sejtsűrűséget érjünk el (pl. 0,5 McFarland standard vagy OD600 ~ 0,1).
2. Készítsen antimikrobiális oldatokat:
   Hígítsuk fel az antimikrobiális szert megfelelő táptalajban, hogy koncentrációtartományt hozzunk létre (pl. kétszeres sorozatos hígítások).
3. Adagolja a 96-os lyukú lemezbe:
   Adja hozzá az antimikrobiális oldatokat egy standard 96 lyukú lemez vájataiba, ~150–200 μl végső lyuktérfogattal.
   Tartalmazzon növekedéskontrollokat (antimikrobiális szerek nélkül) és sterilitási kontrollokat (bakteriális inokulum nélkül).

2. lépés: Biofilm képződés a csapos fedélen

• Rögzítse a csap fedelét:
  Helyezze a speciális csapfedelet a beoltott vájatokra, biztosítva, hogy a csapok teljesen elmerüljenek a baktériumszuszpenzióban.
• Inkubáljuk a lemezt:
  Inkubáljuk a megfelelő hőmérsékleten (pl. 37°C) meghatározott ideig (pl. 24 óra) statikus körülmények között, hogy biofilm képződhessen a csapokon.

3. lépés: Antimikrobiális expozíció

• Öblítse le a csapokat:
  Távolítsa el a csap fedelét a baktériumszuszpenzióról, és óvatosan öblítse le steril sóoldattal vagy PBS-sel a lazán tapadt planktonsejtek eltávolításához.
• Antimikrobiális szereknek való kitettség:
  Helyezze át a csap fedelét egy új, 96 lyukú lemezbe, amely a korábban elkészített antimikrobiális hígításokat tartalmazza.
  Inkubáljuk meghatározott ideig (pl. 24 órán keresztül) statikus körülmények között, hogy az antimikrobiális szer hasson a biofilmre.

4. lépés: Szonikálás a mikrolemez szonikátorral UIP400MTP

Az ultrahangos lépés kritikus fontosságú a biofilmek leválasztásához a csapos fedelekről az életképesség felméréséhez. Kövesse az alábbi lépéseket a UIP400MTP szonikátorhoz:

1. Készítse elő a beállítást:
   Töltsünk meg egy friss, 96 lyukú lapot regeneráló táptalajjal (pl. semlegesítő táptalajjal vagy steril táptalajjal) minden vájatba.
2. Helyezze át a csap fedelét:
   Távolítsa el a csap fedelét az antimikrobiális kezelőlemezről.
   Öblítse le a csap fedelét steril sóoldatban vagy PBS-ben a maradék antimikrobiális szerek eltávolításához.
3. Helyezze a lemezt az ultrahangos készülékbe:
   Csatlakoztassa a csap fedelét a visszanyerő közeg lemezéhez.
   Helyezze a visszanyerő közeglemezt a UIP400MTP szonikátorba, biztosítva, hogy a lemez középen üljön és stabil, mint a leírt kézikönyvben.
4. Állítsa be az ultrahangos paramétereket:
   Állítsa be az ultrahangos paramétereket a UIP400MTP (a beállítások beállíthatók a biofilmhez):
   Amplitúdó: 70–100%.
   Szonikációs idő: 1-3 perc (állítsa be a biofilm szerkezete alapján) ciklus üzemmódban.
5. Szonikálás:
   Indítsa el az ultrahangos folyamatot. Az ultrahangos hullámok megzavarják a biofilm mátrixot, és kiszorítják a sejteket a helyreállítási közegbe.
6. Figyelemmel kíséri a folyamatot:
   Használja a dugaszolható hőmérséklet-érzékelőt a minta hőmérsékletének ellenőrzésére a vájatokban. A UIP400MTP hűtés céljából laboratóriumi hűtőhöz csatlakoztatható.
7. Szonikálás utáni kezelés:
   A levált biofilmet tartalmazó visszanyerő táptalajt azonnal át kell helyezni egy friss, steril lemezre későbbi elemzés céljából.

A) 2% glükózt tartalmazó TSB-t tartalmazó lemez, amelyet biofilm képződéshez, sejtvisszanyeréshez, valamint a MIC és az MBEC meghatározásához használnak; (B) Csapokkal ellátott fedél sztafilokokkuszok által termelt biofilmek készítéséhez.
A csapokon képződött biofilm sejteket szonikálással (Hielscher ultrahang technológia) 5 percig 96 lyukú lemezeken távolították el, amelyek friss táptalajt tartalmaznak a sejtek visszanyeréséhez.
(Kép és tanulmány: ©de Oliveira et al., 2016)

4. lépés: Az életképesség értékelése

Lemez- és tenyészetalapú leválasztott biofilmek:

1. Végezzük el a visszanyerő táptalaj és a lemez sorozatos hígítását agaron, hogy számba vegyük a telepképző egységeket (CFU).
2. MIC értékelése:
   Határozzuk meg a MIC-et úgy, mint azt a legalacsonyabb antimikrobiális koncentrációt, amely teljes mértékben gátolja a mikrobák látható növekedését a visszanyerő közegben.

MIC minimális gátló koncentráció: Példa a mikrotiterlemezre és a mikrohígítási eredmények értelmezése.
(Tanulmány és kép: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban gyártott minőség

A Hielscher ultrahangos készülékek jól ismertek a legmagasabb minőségi és tervezési szabványokról. A robusztusság és a könnyű kezelhetőség lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A durva körülmények és az igényes környezetek könnyen kezelhetők a Hielscher szonikátorokkal.

Hielscher Ultrasonics egy ISO tanúsítvánnyal rendelkező cég, és különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű ultrasonicatorokra, amelyek a legmodernebb technológiát és felhasználóbarátságot mutatják. Természetesen a Hielscher ultrasonicators CE-kompatibilis és megfelel az UL, CSA és RoHs követelményeinek.

Olvassa el itt, hogyan használják a UIP400MTP a biofilm leválasztására az ASTM E2799 protokollban – A fertőtlenítőszer hatékonyságának vizsgálata a Pseudomonas aeruginosa biofilm ellen MBEC vizsgálattal.