MBEC-vizsgálati protokoll az UIP400MTP 96 lyukú lemezekhez készült ultrahangos készülék használatával

Az MBEC-vizsgálat a csapos fedeleken kialakult biofilmek eltávolításához szükséges antimikrobiális szerek koncentrációjának meghatározására szolgál. A biofilmek életképességének értékeléséhez először le kell választani a biofilmeket a 96 lyukú lemez csapos fedeleiről. Az ultrahangos kezelés a legmegbízhatóbb és leghatékonyabb módszer erre a leválasztásra. A többlyukú lemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos készüléket kifejezetten a vizsgálati lemezek maximális hatékonyságú és kényelmes feldolgozására tervezték, egyszerűsítve és felgyorsítva a nagy mintaáteresztő képességű MBEC-vizsgálatokat.

Ultrahangos kezelés a biofilm leválasztásához

Az ultrahangos kezelés kulcsfontosságú lépés a minimális biofilm-eradikációs koncentráció (MBEC) meghatározására szolgáló vizsgálatokban, mivel lehetővé teszi a biofilmsejtek hatékony leválasztását arról a felületről, amelyhez tapadnak. A biofilmek eleve strukturált, extracelluláris mátrixba ágyazott mikroorganizmus-közösségek, ami a planktonikus sejtekhez képest jelentősen ellenállóbbá teszi őket az antimikrobiális szerekkel szemben. Az MBEC-vizsgálatok során az ultrahangos kezelés ultrahanghullámokkal szabályozott kavitációt hoz létre, megbontva a biofilm mátrixát és szuszpenzióba juttatva a beágyazott sejteket. Ez a lépés biztosítja, hogy a biofilmsejtek egyenletesen oszoljanak el a visszanyerésükre szolgáló tápközegben, elősegítve az életképesség pontos értékelését lemezre szélesztéssel, hígítással vagy spektrofotometriás módszerekkel. A biofilm megfelelő leválasztása nélkül a visszamaradó mátrixkomponensek megvédhetnék a sejteket, ami az antimikrobiális hatékonyság alulbecsléséhez vezethetne. Ezért az ultrahangos kezelés nélkülözhetetlen a megbízható és reprodukálható MBEC-értékek meghatározásához, amelyek tükrözik a vizsgált szerek tényleges eradikációs képességét. A többlyukú lemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos készülék lehetővé teszi az egyszerű, nagy mintaáteresztő képességű minta-előkészítést a vizsgálati lemezekben.

A minimális biofilm-eradikációs koncentráció (MBEC) vizsgálati protokollja

1. lépés: Biofilmképződés

1. Készítse elő a baktériumszuszpenziót:
   Tenyéssze a baktériumokat megfelelő tápközegekben a logaritmikus növekedési fázis eléréséig.
   Hígítsa a baktériumtenyészetet meghatározott optikai sűrűségre (pl. OD600 ~0,1).
2. Oltsa be a 96 lyukú lemezt:
   Adja a baktériumszuszpenziót (pl. 150–200 µL) egy szabványos, 96 lyukú mikrotiterlemez minden lyukába.
3. Helyezze fel a csapos fedelet:
   Helyezze a csapos fedelet a beoltott lemezre, hogy a csapok felületén biofilm képződhessen.
4. Inkubálja a lemezt:
   Inkubálja az összeállítást megfelelő hőmérsékleten (pl. 37°C), 24–48 órán keresztül, rázatás nélkül, hogy elősegítse a biofilm növekedését.

2. lépés: Kezelés antimikrobiális szerekkel

• Készítse elő az antimikrobiális oldatokat:
  Készítsen különböző koncentrációjú antimikrobiális oldatokat friss tápközegekben.
  Tegye ki a biofilmeket az antimikrobiális szerek hatásának:
  Vegye le a csapos fedelet a baktériumtenyészetről, és öblítse le steril sóoldattal vagy PBS-sel a planktonikus sejtek eltávolításához.
  Helyezze a csapos fedelet egy új, az antimikrobiális oldatokat tartalmazó 96 lyukú lemezbe.
• Inkubálja a lemezt:
  Inkubálja meghatározott ideig (pl. 24 órán keresztül), hogy az antimikrobiális szerek kifejthessék hatásukat.

3. lépés: Ultrahangos kezelés az UIP400MTP 96 lyukú lemezekhez készült ultrahangos készülékkel

Az ultrahangos kezelés lépése döntő fontosságú a biofilmek csapos fedelekről történő leválasztásához és életképességük értékeléséhez. Az UIP400MTP ultrahangos készülék használatakor kövesse az alábbi lépéseket:

1. Készítse elő az összeállítást:
   Töltsön egy új, 96 lyukú lemez minden lyukába a sejtek visszanyerésére szolgáló tápközeget (pl. semlegesítő táplevest vagy friss tenyésztőközeget).
2. Helyezze át a csapos fedelet:
   Vegye le a csapos fedelet az antimikrobiális kezeléshez használt lemezről.
   Öblítse le a csapos fedelet steril sóoldattal vagy PBS-sel a visszamaradt antimikrobiális szerek eltávolításához.
3. Állítsa megfelelő helyzetbe a lemezt és az ultrahangos készüléket:
   Helyezze fel a csapos fedelet a sejtek visszanyerésére szolgáló tápközeget tartalmazó lemezre.
   Helyezze ezt a lemezt az UIP400MTP ultrahangos készülék platformjára, ügyelve arra, hogy a lemez középen és stabilan helyezkedjen el.
4. Állítsa be az ultrahangos kezelés paramétereit:
   Állítsa be az ultrahangos kezelés paramétereit az UIP400MTP készüléken (a beállítások a biofilmhez igazíthatók):
   Amplitúdó: 70–100%.
   Az ultrahangos kezelés időtartama: 1–3 perc (a biofilm ellenálló képességéhez igazítva), ciklikus üzemmódban.
5. Végezze el az ultrahangos kezelést:
   Indítsa el az ultrahangos kezelést. Az ultrahangos rezgés leválasztja a biofilmeket a csapok felületéről, és a visszanyerésükre szolgáló tápközegbe juttatja őket.
6. Kövesse nyomon a folyamatot:
   A csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelővel kövesse nyomon a lyukakban lévő minták hőmérsékletét. Az UIP400MTP hűtés céljából laboratóriumi hűtőkészülékhez csatlakoztatható.
7. Az ultrahangos kezelést követő műveletek:
   Azonnal helyezze át a sejtek visszanyerésére szolgáló tápközeget (amely ekkor már a leválasztott biofilmeket tartalmazza) egy új, steril lemezbe a további elemzéshez.

(A) 2% glükózt tartalmazó TSB-vel töltött lemez a biofilm kialakításához, a sejtek visszanyeréséhez és a
MIC és MBCB meghatározásához; (B) Csapos fedél staphylococcus-biofilmek kialakításához. a MIC és MBCB meghatározásához; (B) Csapos fedél staphylococcus-biofilmek kialakításához.
A csapokon kialakult biofilmsejteket 5 min időtartamú ultrahangos kezeléssel (Hielscher Ultrasound Technology) választották le a sejtek visszanyeréséhez friss tenyésztőközeget tartalmazó 96 lyukú lemezekben.
(Kép és tanulmány: ©de Oliveira et al., 2016)

4. lépés: Az életképesség értékelése

Szélessze lemezre és tenyéssze a leválasztott biofilmeket:

1. Készítsen sorozathígításokat a sejtek visszanyerésére szolgáló tápközegből, és szélessze azokat agarra a telepképző egységek (CFU) megszámlálásához.
   Alternatív megoldásként alkalmazzon kolorimetriás vagy fluoreszcenciaalapú életképességi vizsgálatot.
2. Rögzítse az eredményeket:
   Határozza meg az MBEC-t az antimikrobiális szer azon legalacsonyabb koncentrációjaként, amely megszüntette a biofilm kimutatható életképességét.

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban készült minőség

A Hielscher ultrahangos készülékek a legmagasabb minőségi és tervezési színvonalukról ismertek. Robusztus kialakításuk és egyszerű kezelhetőségük lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását az ipari létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos készülékek könnyedén megbirkóznak a mostoha körülményekkel és a nagy igénybevételt jelentő környezettel.

A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, és különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű, a legkorszerűbb technológiát és felhasználóbarát működést kínáló ultrahangos készülékekre. A Hielscher ultrahangos készülékek természetesen megfelelnek a CE előírásainak, és teljesítik az UL, a CSA és a RoHs követelményeit.

Itt olvashat arról, hogyan használják az UIP400MTP készüléket a biofilm leválasztására minta-előkészítési lépésként az ASTM E2799 protokoll során, amely a fertőtlenítőszerek Pseudomonas aeruginosa biofilmmel szembeni hatékonyságát teszteli MBEC-vizsgálattal.