MBEC vizsgálati protokoll a 96 lyukú lemezes szonikátor UIP400MTP használatával

Az MBEC vizsgálatot a csapos fedeleken képződött biofilmek eltávolításához szükséges antimikrobiális szerek koncentrációjának meghatározására használják. A biofilm életképességének értékeléséhez a biofilmeket először le kell választani egy 96 lyukú lemez csapos fedeléről. A szonikálás a legmegbízhatóbb és leghatékonyabb módszer erre a leválasztásra. A többlyukú lemezes szonikátor UIP400MTP kifejezetten a vizsgálati lemezek maximális hatékonysággal és kényelemmel történő feldolgozására tervezték, egyszerűsítve és felgyorsítva a nagy áteresztőképességű MBEC vizsgálatokat.

Szonikálás a biofilm leválasztásához

A szonikálás döntő lépés a minimális biofilm eradikációs koncentráció (MBEC) vizsgálatokban, lehetővé téve a biofilm sejtek hatékony elmozdulását a felületi tapadásukból. A biofilmek eredendően strukturált mikroorganizmus-közösségek, amelyek extracelluláris mátrixba vannak zárva, ami jelentősen ellenállóbbá teszi őket az antimikrobiális szerekkel szemben, mint a planktonikus sejtek. Az MBEC vizsgálatok során az ultrahangos kezelés ultrahangos hullámokat használ szabályozott kavitáció létrehozására, megzavarva a biofilm mátrixot és felszabadítva a beágyazott sejteket szuszpenzióba. Ez a lépés biztosítja, hogy a biofilm sejtek egyenletesen oszlanak el a visszanyerő közegben, megkönnyítve a pontos életképességi értékeléseket lemezelési, hígítási vagy spektrofotometriás módszerekkel. Megfelelő biofilm leválasztás nélkül a maradék mátrixkomponensek árnyékolhatják a sejteket, ami az antimikrobiális hatékonyság alábecsüléséhez vezet. Ezért az ultrahangos kezelés elengedhetetlen a megbízható és reprodukálható MBEC értékek megszerzéséhez, tükrözve a vizsgált szerek valódi felszámolási potenciálját. A többlyukú lemezes szonikátor UIP400MTP lehetővé teszi a könnyed, nagy áteresztőképességű mintaelőkészítést a vizsgálati lemezekben.

Minimális biofilm felszámolási koncentráció (MBEC) vizsgálati protokoll

1. lépés: Biofilm képződés

1. Készítse elő a baktérium-szuszpenziót:
   Tenyésztse a baktériumokat megfelelő táptalajban a logfázisú növekedéshez.
   Hígítsuk fel a baktériumtenyészetet egy meghatározott optikai sűrűségre (pl. OD600 ~0,1).
2. Oltsuk be a 96 lyukú lemezt:
   Adja hozzá a baktériumszuszpenziót (pl. 150–200 μl) egy standard 96 lyukú mikrotiterlemez minden vájatába.
3. Rögzítse a csap fedelét:
   Helyezze a csap fedelét a beoltott lemezre, hogy lehetővé tegye a biofilm képződését a csap felületén.
4. Inkubáljuk a lemezt:
   Inkubáljuk az összeállítást megfelelő hőmérsékleten (pl. 37 °C) 24–48 órán keresztül rázás nélkül, hogy elősegítsük a biofilm növekedését.

2. lépés: Kezelés antimikrobiális szerekkel

• Készítsen antimikrobiális oldatokat:
  Készítsen elő egy sor antimikrobiális koncentrációt friss táptalajban.
  Biofilmek expozíciója antimikrobiális szereknek:
  Távolítsa el a csap fedelét a baktériumtenyészetből, és öblítse le steril sóoldatban vagy PBS-ben a planktonsejtek eltávolításához.
  Helyezze a csap fedelét egy új, 96 lyukú lemezbe, amely az antimikrobiális oldatokat tartalmazza.
• Inkubáljuk a lemezt:
  Inkubáljuk meghatározott ideig (pl. 24 órán keresztül) az antimikrobiális expozíció lehetővé tétele érdekében.

3. lépés: Szonikálás a 96-lyukú lemezes szonikátorral UIP400MTP

Az ultrahangos lépés kritikus fontosságú a biofilmek leválasztásához a csapos fedelekről az életképesség felméréséhez. Kövesse az alábbi lépéseket a UIP400MTP szonikátorhoz:

1. Készítse elő a beállítást:
   Töltsön meg egy friss, 96 lyukú lapot visszanyerő táptalajjal (pl. semlegesítő táptalajjal vagy friss táptalajjal) minden vájatba.
2. Helyezze át a csap fedelét:
   Távolítsa el a csap fedelét az antimikrobiális kezelőlemezről.
   Öblítse le a csap fedelét steril sóoldatban vagy PBS-ben a maradék antimikrobiális szerek eltávolításához.
3. Helyezze el a lemezt és az ultrahangos készüléket:
   Csatlakoztassa a csap fedelét a visszanyerő közeg lemezéhez.
   Helyezze a visszanyerő közeglemezt a UIP400MTP ultrahangos platformra, biztosítva, hogy a lemez középre kerüljön és stabil legyen.
4. Állítsa be az ultrahangos paramétereket:
   Állítsa be az ultrahangos paramétereket a UIP400MTP (A beállítások beállíthatók a biofilmhez):
   Amplitúdó: 70–100%.
   Szonikációs idő: 1-3 perc (állítsa be a biofilm robusztussága alapján) ciklus üzemmódban.
5. Szonikálás:
   Indítsa el az ultrahangos folyamatot. Az ultrahangos rezgés kiszorítja a biofilmeket a csapfelületekről a visszanyerő közegbe.
6. Figyelemmel kíséri a folyamatot:
   Használja a dugaszolható hőmérséklet-érzékelőt a minta hőmérsékletének ellenőrzésére a vájatokban. A UIP400MTP hűtés céljából laboratóriumi hűtőhöz csatlakoztatható.
7. Szonikálás utáni kezelés:
   A visszanyerő táptalajt (amely most leválasztott biofilmeket tartalmaz) azonnal át kell helyezni egy friss, steril lemezre későbbi elemzés céljából.

(A) TSB-t tartalmazó lemez, 2% glükózzal, amelyet biofilm képződésre, sejtvisszanyerésre használnak, és
a MIC és az MBCB meghatározása; (B) Csapokkal ellátott fedél sztafilokokkuszok által termelt biofilmek készítéséhez. a MIC és az MBCB meghatározása; (B) Csapokkal ellátott fedél sztafilokokkuszok által termelt biofilmek készítéséhez.
A csapokon képződött biofilm sejteket szonikálással (Hielscher ultrahang technológia) 5 percig 96 lyukú lemezeken távolították el, amelyek friss táptalajt tartalmaznak a sejtek visszanyeréséhez.
(Kép és tanulmány: ©de Oliveira et al., 2016)

4. lépés: Az életképesség értékelése

Lemez- és tenyészetalapú leválasztott biofilmek:

1. Végezzük el a visszanyerő táptalaj és a lemez sorozatos hígítását agaron, hogy számba vegyük a telepképző egységeket (CFU).
   Alternatív megoldásként használjon kolorimetriás vagy fluoreszcencia alapú életképességi vizsgálatot.
2. Eredmények rögzítése:
   Határozzuk meg az MBEC-et az antimikrobiális szer azon legalacsonyabb koncentrációjaként, amely megszüntette a kimutatható biofilm életképességét.

Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban gyártott minőség

A Hielscher ultrahangos készülékek jól ismertek a legmagasabb minőségi és tervezési szabványokról. A robusztusság és a könnyű kezelhetőség lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A durva körülmények és az igényes környezetek könnyen kezelhetők a Hielscher szonikátorokkal.

Hielscher Ultrasonics egy ISO tanúsítvánnyal rendelkező cég, és különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű ultrasonicatorokra, amelyek a legmodernebb technológiát és felhasználóbarátságot mutatják. Természetesen a Hielscher ultrasonicators CE-kompatibilis és megfelel az UL, CSA és RoHs követelményeinek.

Olvassa el itt, hogyan használják a UIP400MTP a biofilm leválasztására mintaelőkészítési lépésként az ASTM E2799 protokoll során a fertőtlenítőszerek hatékonyságának tesztelésére a Pseudomonas aeruginosa biofilm ellen az MBEC vizsgálat segítségével.