Staphylococcus-biofilm tenyésztési és leválasztási protokollja

A megbízható kutatási eredményekhez elengedhetetlenek a szabványosított módszerek. Itt a staphylococcus-biofilmek tenyésztési és leválasztási protokollját találja. Ez a protokoll a hatékony, nagy áteresztőképességű minta-előkészítésre összpontosít az UIP400MTP többlyukú lemezekhez készült ultrahangos kezelő használatával, amely a biofilmek hatékony, nagy áteresztőképességű leválasztását teszi lehetővé 96 lyukú lemezeken. A protokoll a biofilm tenyésztésének, mosásának és láthatóvá tételének kulcsfontosságú lépéseit is tartalmazza, a változékonyság minimalizálására és a reprodukálhatóság biztosítására összpontosítva.

Staphylococcus-biofilmek és antibiotikumok kutatása

A Staphylococcus-biofilmek az antibiotikumokkal és az immunválaszokkal szembeni ellenálló képességük miatt meghatározó szerepet játszanak a tartós fertőzésekben. A biofilmképződés védett környezetet biztosít a baktériumoknak, ami megnehezíti a fertőzések kezelését. A biofilmek kutatása gyakran a kialakulásuk, viselkedésük és antimikrobiális szerekkel szembeni érzékenységük megértésére összpontosít, különös hangsúlyt fektetve a kísérleti munkafolyamatokat egyszerűsítő, nagy áteresztőképességű módszerekre.
Az UIP400MTP többlyukú lemezekhez készült ultrahangos kezelő jelentős előnyt kínál a biofilmkutatásban azáltal, hogy lehetővé teszi a biofilmek gyors és hatékony leválasztását a 96 lyukú lemezekről. Ez a készülék minden lyukba egyenletes ultrahangenergiát juttat, biztosítva a következetes eredményeket, miközben minimalizálja a változékonyságot.

Protokoll Staphylococcus-biofilm tenyésztéséhez és leválasztásához

Az alábbiakban lépésről lépésre végigvezetjük a staphylococcus-biofilm tenyésztésének és leválasztásának folyamatán. Egy analitikai lépés példájaként bemutatjuk, hogyan határozható meg spektrofotometriásan a tenyésztett biomassza mennyisége kristályibolyás festéssel.

Staphylococcus-biofilm tenyésztése

Szükséges anyagok és eszközök:

• Steril, lapos aljú, 96 lyukú, szövettenyésztéshez felületkezelt polisztirol mikrotiterlemezek fedéllel
• Triptikus szója tápleves (TSB) 0,25% glükózzal
• Biológiai biztonsági fülke

Lépések:

1. A szennyeződés minimalizálása érdekében alakítson ki steril munkakörnyezetet egy biológiai biztonsági fülkében.
2. Adjon 0,25% glükózt tartalmazó TSB-t a mikrotiterlemez lyukaiba. A glükóz nélküli TSB általában nem támogatja a biofilmképződést, és szükség esetén kizárólag kontrollként használható.
3. Oltsa be a lyukakat az alábbiak szerint előkészített baktériumtörzsekkel:
4. Készítsen baktériumszuszpenziókat, és gondoskodjon arról, hogy ne maradjanak bennük korábban kialakult sejtaggregátumok: homogenizálja a szuszpenziókat ultrahangos kezeléssel, vagy bontsa fel az aggregátumokat 23 gauge méretű tűvel és rövid vortexkeveréssel.
5. Zárja le a lemezt a fedelével, és inkubálja a biofilmképződéshez optimális körülmények között (például 37°C-on 24 órán át).
6. A megbízhatóság biztosítása érdekében végezze el a kísérletet minden baktériumtörzzsel három párhuzamos ismétlésben (törzsenként három lyukban).
7. Lemezenként hat lyukat különítsen el negatív kontrollok számára. Egy 96 lyukú lemezen akár 30 törzs is vizsgálható.

A biofilm láthatóvá tétele és mosása

1. Az inkubálás után óvatosan távolítsa el a tápközeget, hogy ne bolygassa meg a biofilmet.
2. Mosson át minden lyukat négyszer fiziológiás sóoldattal a planktonikus baktériumok eltávolításához.
3. Vizsgálja meg a lyukak alját, és keressen fehér foltokat, amelyek biofilm jelenlétére utalnak.

Biofilm leválasztása az UIP400MTP többlyukú lemezekhez készült ultrahangos kezelővel

A készülék beállítása és paraméterei:

• UIP400MTP ultrahangos kezelő többlyukú lemezekhez
• Üzemi beállítások: 60% amplitúdó, ciklikus üzemmód 60 másodperc BE / 30 másodperc KI időzítéssel

Lépések:

1. Helyezze a megmosott mikrotiterlemezt az UIP400MTP platformjára.
2. Kezelje ultrahanggal a mintákat az ajánlott beállításokkal (60% amplitúdó, 60 másodperc BE, 30 másodperc KI). Igazítsa a beállításokat a baktériumtörzshöz.
3. Indítsa el az ultrahangos kezelést a biofilm leválasztásához. Az ultrahanghullámok megbontják a biofilm mátrixát, felszabadítva a megtapadt baktériumokat.
4. Az UIP400MTP minden lyukban egyenletes ultrahangos behatást biztosít az egységes leválasztási eredmények érdekében.

Analitikai lépés: a leválasztott Staphylococcus-biofilm biomasszájának mennyiségi meghatározása kristályibolyával (CV)

Szükséges anyagok és eszközök:

• 0,1%-os kristályibolya- (CV-) oldat
• 95%-os etanol vagy 30%-os ecetsav (az oldatba vitelhez)
• 570 nm-en mérni képes mikrolemez-olvasó
• Steril mikrotiterlemezek a festéshez

Lépések:

1. A festőlemez előkészítése: Vigyen át az ultrahanggal kezelt lemez minden lyukából 100 µL leválasztott biofilm-szuszpenziót egy tiszta, steril, 96 lyukú mikrotiterlemez megfelelő lyukaiba. Ez tiszta és egységes környezetet biztosít a festéshez.
2. A leválasztott biofilm festése: Adjon 150 µL 0,1%-os kristályibolya-oldatot minden olyan lyukhoz, amely leválasztott biofilm-szuszpenziót tartalmaz. Óvatos pipettázással biztosítsa a biofilm-szuszpenzió és a kristályibolya egyenletes keveredését.
3. Inkubálás: Inkubálja a lemezt szobahőmérsékleten 15 percig, hogy a kristályibolya hatékonyan megfesthesse a biomasszát.
4. Mosás: Az inkubálás után óvatosan távolítsa el a kristályibolya-oldatot a lyukakból a biomassza megbolygatása nélkül. Mosson át minden lyukat háromszor steril fiziológiás sóoldattal a nem kötődött festék eltávolításához.
5. Szárítás: Hagyja a lemezt levegőn megszáradni szobahőmérsékleten vagy steril légáramlású fülkében. Kerülje a melegítést, mivel az megváltoztathatja az eredményeket.
6. Oldatba vitel: Adjon minden lyukhoz 200 µL 95%-os etanolt (vagy a szokásos laboratóriumi gyakorlatnak megfelelően 30%-os ecetsavat) a kötődött kristályibolya oldatba viteléhez. Óvatosan keverje pipettázással vagy a lemez rázatásával 10 percig, szobahőmérsékleten.
7. Mérés: Mérje meg az oldatba vitt kristályibolya-oldat optikai denzitását (OD) 570 nm-en mikrolemez-olvasóval.
8. Adatelemzés: A háttérfestődés figyelembevételéhez vonja ki a negatív kontrollok (TSB-t tartalmazó, de bakteriális inokulum nélküli lyukak) átlagos OD570 értékét a kísérleti lyukak értékeiből. Rögzítse és elemezze az adatokat.

Megjegyzés: A reprodukálhatóság biztosítása érdekében végezze el a kísérletet minden vizsgálati feltétel mellett három párhuzamos ismétlésben. Gondoskodjon a kristályibolya és az etanol megfelelő kezeléséről, a biztonsági és hulladékkezelési protokollok betartásával.
 

Az UIP400MTP legfontosabb előnyei egy pillantásra:

• Nagy áteresztőképességű feldolgozás: Kifejezetten többlyukú lemezekhez tervezték, így egyszerre több minta feldolgozását teszi lehetővé.
• Az ultrahang egyenletes eloszlása: Azonos ultrahang-intenzitást biztosít a lyukakban, így minden mintánál következetes eredményeket nyújt.
• Használjon bármilyen szabványos lemezt: Az UIP400MTP bármilyen szabványos többlyukú lemezt, Petri-csészét és kémcsőállványt képes kezelni. Nincs szükség drága, gyártóspecifikus lemezekre!
• Felhasználóbarát kezelőfelület: Egyszerűen beállítható és vezérelhető, így kiváló eszköz a laboratóriumi termelékenység növelésére. A programozható beállítások és az automatizálás megkönnyítik a folyamatok szabványosítását!