Staphylococcus biofilm termesztési és leválási protokoll

A szabványosított módszerek elengedhetetlenek a megbízható kutatási eredményekhez. Itt található a staphylococcus biofilmek termesztési és leválasztási protokollja. Ez a protokoll az áramvonalas, nagy áteresztőképességű mintaelőkészítésre összpontosít UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátor használatával a hatékony, nagy áteresztőképességű biofilm leválasztásához 96 lyukú lemezekben. A protokoll kulcsfontosságú lépéseket tartalmaz a biofilm termesztéséhez, mosásához és megjelenítéséhez is, különös tekintettel a változékonyság minimalizálására és a reprodukálhatóság biztosítására.

Staphylococcus biofilm és antibiotikum kutatás

A Staphylococcus biofilmek kritikus szerepet játszanak a tartós fertőzésekben az antibiotikumokkal szembeni rezisztenciájuk és immunválaszuk miatt. A biofilm képződés védőkörnyezetet biztosít a baktériumok számára, ami megnehezíti a fertőzések kezelését. A biofilmek kutatása gyakran a kialakulásuk, viselkedésük és az antimikrobiális szerekkel szembeni érzékenységük megértésére összpontosít, különös tekintettel a nagy áteresztőképességű módszerekre a kísérleti munkafolyamatok egyszerűsítése érdekében.
A UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátor jelentős előnyt kínál a biofilm kutatásában azáltal, hogy lehetővé teszi a biofilmek gyors és hatékony leválasztását a 96 lyukú lemezekről. Ez a készülék egyenletes ultrahangos energiát biztosít minden kúthoz, biztosítva a következetes eredményeket, miközben minimalizálja a változékonyságot.

A Staphylococcus biofilm termesztésére és leválasztására vonatkozó protokoll

Az alábbiakban lépésről lépésre végigvezetjük Önt a staphylococcus biofilm termesztésének és leválasztásának folyamatán. Példaértékű analitikai lépésként megmutatjuk, hogyan lehet spektrofotometriásan számszerűsíteni a termesztett biomasszát kristályibolya festéssel.

Staphylococcus biofilm termesztése

Szükséges anyagok:

• Steril, lapos fenekű, 96 lyukú polisztirol szövetkultúrával kezelt mikrotiterlemezek fedéllel
• Triptikus szójaleves (TSB) 0,25% glükózzal
• Biológiai biztonsági szekrény

Utaslépcső:

1. Készítsen steril munkakörnyezetet egy biológiai biztonsági szekrényben a szennyeződés minimalizálása érdekében.
2. Adjunk 0,25% glükózt tartalmazó TSB-t a mikrotiter lemez vájatokhoz. A glükóz nélküli TSB általában nem támogatja a biofilm képződését, és csak szükség esetén használható kontrollként.
3. Oltsuk be a vájatokat az alábbiak szerint előkészített baktériumtörzsekkel:
4. Készítsünk bakteriális szuszpenziókat, biztosítva, hogy ne legyenek meglévő sejtcsoportok a szuszpenziók szonikálással történő homogenizálásával vagy a klaszterek 23-as tűvel történő feldarabolásával és rövid örvényléssel.
5. Zárjuk le a lemezt a fedelével, és inkubáljuk a biofilm képződéséhez optimális körülmények között (pl. 37°C-on 24 órán keresztül).
6. A megbízhatóság biztosítása érdekében végezzük el a kísérletet háromszor minden baktériumtörzsre (törzsenként három vájat).
7. Lemezenként hat vájatot rendeljünk a negatív kontrollokhoz. 96 lyukú lemezenként legfeljebb 30 törzs vizsgálható.

Biofilm vizualizáció és mosás

1. Inkubálás után óvatosan dobja ki a táptalajt, hogy elkerülje a biofilm megzavarását.
2. A planktoni baktériumok eltávolításához minden lyukat négyszer mosson fiziológiás sóoldattal.
3. Vizsgáljuk meg a vájatutak alját, hogy nincsenek-e rajta biofilm jelenlétére utaló fehér foltok.

Biofilm leválasztás a többlyukú lemezes szonikátor segítségével UIP400MTP

Eszköz beállítása és paraméterei:

• UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátor
• Működési beállítások: 60% amplitúdó, ciklus üzemmód 60 másodperc BE / 30 másodperc KI

Utaslépcső:

1. Helyezze a mosott mikrotiter lemezt a UIP400MTP platformra.
2. Szonikálja a mintákat az ajánlott beállításokkal (60% amplitúdó, 60 másodperc BE, 30 másodperc KI). Állítsa be a beállításokat a baktériumok törzséhez.
3. Indítsa el az ultrahangos folyamatot a biofilm leválasztásához. Az ultrahangos hullámok megzavarják a biofilm mátrixot, felszabadítva a tapadó baktériumokat.
4. A UIP400MTP egyenletes expozíciót biztosít minden vájatban a következetes leválási eredmények érdekében.

Analitikai lépés: Leválasztott Staphylococcus biofilm biomassza mennyiségi meghatározása kristályibolya (CV) alkalmazásával

Szükséges anyagok:

• 0.1% kristályibolya (CV) oldat
• 95% etanol vagy 30% ecetsav (oldódáshoz)
• Mikrolemez-olvasó, amely 570 nm-en képes leolvasni
• Steril mikrotiter lemezek festéshez

Utaslépcső:

1. A festőlemez előkészítése: 100 μl leválasztott biofilm szuszpenziót vigyünk át az ultrahangos lemez minden lyukából egy tiszta, steril 96 lyukú mikrotiter lemez megfelelő vájatába. Ez tiszta és egyenletes környezetet biztosít a festéshez.
2. A levált biofilm festése: Adjunk 150 μl 0,1%-os kristályibolya oldatot a leválasztott biofilm szuszpenziót tartalmazó minden vájatba. Óvatosan pipettázzunk, hogy a biofilm szuszpenzió és a kristályibolya egyenletesen keveredjen.
3. Inkubálás: Hagyjuk a lemezt szobahőmérsékleten inkubálni 15 percig, hogy a kristályibolya hatékonyan megfesthesse a biomasszát.
4. Mosás: Inkubálás után óvatosan dobja ki a kristályibolya oldatot a vájulatokból anélkül, hogy megzavarná a biomasszát. Minden lyukat háromszor mosson steril fiziológiás sóoldattal a nem kötött foltok eltávolítása érdekében.
5. Szárítás: Hagyja a lemezt szobahőmérsékleten vagy steril légáramú burkolat alatt levegőn megszáradni. Kerülje a melegítést, mivel ez megváltoztathatja az eredményeket.
6. Oldódás: Adjunk 200 μl 95%-os etanolt (vagy 30%-os ecetsavat, a szokásos laboratóriumi gyakorlattól függően) minden vájatba, hogy oldjuk a kötött kristályibolyát. Óvatosan keverjük össze pipettázással vagy a lemez szobahőmérsékleten 10 percig tartó rázásával.
7. Mérés: Mérjük meg az oldott kristályibolya oldat optikai sűrűségét (OD) 570 nm-en mikrolemez-olvasó segítségével.
8. Adatelemzés: Vonja le a negatív kontrollok (TSB-vel rendelkező, de bakteriális inokulum nélküli vájatok) átlagos OD570 értékét a kísérleti vájatokból, hogy figyelembe vegye a háttérfestést. Jegyezze fel és elemezze az adatokat.

Megjegyzés: A reprodukálhatóság biztosítása érdekében végezze el a kísérletet három példányban minden körülmény esetében. Biztosítsa a kristályibolya és az etanol megfelelő kezelését, betartva a biztonsági és ártalmatlanítási protokollokat.
 

A UIP400MTP legfontosabb előnyeinek áttekintése:

• Nagy átviteli sebességű feldolgozás: Kifejezetten többlyukú lemezekhez tervezték, lehetővé téve több minta egyidejű feldolgozását.
• Egységes ultrahangos eloszlás: Egyenlő ultrahangos intenzitást biztosít a vájatokban, konzisztens eredményeket biztosítva az összes mintában.
• Használjon bármilyen szabványos lemezt: A UIP400MTP bármilyen szabványos többlyukú lemezt, Petri-csészét és csőtartót képes kezelni. Nincs szükség drága szabadalmaztatott lemezekre!
• Felhasználóbarát felület: Könnyen beállítható és vezérelhető, így kiváló eszköz a laboratóriumi termelékenység növelésére. A programozható beállítások és az automatizálás megkönnyíti a folyamatok szabványosítását!