PMCA a prionok nagy áteresztőképességű kimutatásához a UIP400MTP ultrahangos kezelőberendezéssel

A UIP400MTP többlyukú lemezekhez készült ultrahangos kezelőberendezés hatékony megoldást kínál a nagy áteresztőképességű minta-előkészítéshez a hibás fehérjehajtogatás ciklikus amplifikációja (PMCA) során. Azáltal, hogy több mintalyukban egyenletes energiaeloszlást biztosít, és pontosan fenntartja az ultrahangos kezelés paramétereit, ez a rendszer számos minta egyidejű feldolgozását teszi lehetővé kivételes reprodukálhatósággal. Ezek a képességek kulcsfontosságúak a PMCA optimalizálásához, hogy a prionok alacsony koncentrációban is kimutathatók legyenek olyan nehezen vizsgálható biológiai mintákban, mint a nyál, amelyekben a vizsgálatot gátló anyagok elfedhetik az eredményeket.

A prionbetegségek, például a szarvasfélék krónikus sorvadásos betegsége (CWD) és az emberek Creutzfeldt–Jakob-betegsége (CJD), olyan neurodegeneratív rendellenességek, amelyeket hibásan hajtogatott prionfehérjék (PrP^Sc) okoznak. Ezekben a betegségekben a fertőző prionok gyakran alacsony koncentrációban vannak jelen a testnedvekben, például a nyálban, a vérben és a vizeletben, ami megnehezíti a diagnózist és a kutatást. A CWD horizontális terjedése a környezeti mátrixokba ürített prionokon keresztül különösen jelentős következményekkel jár a vadgazdálkodásra és az ökológiai egészségre nézve. Hasonlóképpen, az olyan betegségek esetében, mint a Creutzfeldt–Jakob-betegség, az emberi mintákból származó, hibásan hajtogatott prionfehérjék megbízható amplifikációja elengedhetetlen a diagnosztika fejlesztéséhez és a betegség előrehaladásának megértéséhez.

Módosított PMCA-protokoll alkalmazásával megkerülhetők a vizsgálatot gyakran gátló anyagok (például a nyálban található mucinok), és nagy érzékenység érhető el olyan prionok kimutatásában, amelyek egyébként nem lennének kimutathatók, vagy amelyek kimutatása nem adna egyértelmű eredményt olyan technikákkal, mint a valós idejű, rázás által kiváltott konverzió (RT-QuIC). Ezek az előrelépések javítják a prionok kimutatását különböző betegségek esetén, így a PMCA nélkülözhetetlen eszközzé válik a prionkutatásban és a diagnosztikában. A többlyukú lemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos kezelőberendezés nagy áteresztőképességű PMCA-t tesz lehetővé számos, mikrolemezekben (például 6, 24 vagy 96 lyukú lemezekben), illetve kémcsőtartó állványban elhelyezett fiolákban lévő minta ultrahangos kezelésével.

Protokoll a hibás fehérjehajtogatás nagy áteresztőképességű ciklikus amplifikációjához (PMCA)

A következő protokoll lehetővé teszi a nagy mintaszám hatékony feldolgozását pontosan azonos feltételek mellett a robusztus kutatási eredmények érdekében.

Minta-előkészítés

Starting Material:
Prepare samples by:

• Resuspending sarkosyl extraction pellets in PMCA substrate.
• Közvetlenül tüskés agyi homogenizátumok vagy vérminták prionmaggal.

Substrate:

• Használjunk 10%-os (tömeg/térfogat) agyi homogenizátumot, amelyet transzgenikus egerekből készítenek, és amelyek túlexpresszálják a PrP-t^C (e.g., Tg mice).
• Homogenize the brain tissue in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Store the substrate at -80ºC until use.

Sample Setup in Microplate or Tubes:
Tubes:

• Adjunk hozzá 90 μl agyhomogenizáló szubsztrátumot és magot 10 μl mintával (pl. vér, agyhomogenizátum vagy sarkozilpellet).
• Place 3 Teflon beads (1,59-mm or 2,38-mm diameter) in each 0,2 mL tube.
• Szerelje fel a csöveket a UIP400MTP szonikátorral kompatibilis állványba.

6-Well Microplate:

• Adagoljon minden lyukba 5 mL agyhomogenátum-szubsztrátot, majd oltson be lyukanként 500 μL mintával.
• Add 3 Teflon beads to each well.

PMCA-eljárás

Placement:
Helyezze a csőtartót vagy az 6-lyukú mikrolemezt a UIP400MTP szonikátorba a gyártó utasításainak megfelelően.

Cycling Program:
Perform 144 PMCA cycles as follows:

• Inkubáció: 29 perc és 30 másodperc 37°C-on.
• Sonication: 30 seconds at 60% amplitude.
• A hőmérséklet figyelése: A dugaszolható hőmérséklet-érzékelővel figyelheti a minta hőmérsékletét, és beprogramozhatja a UIP400MTP max. 48–50 °C-ra.

Subsequent Rounds:
A 144 ciklus első körének befejezése után vigyünk át egy aliquot részt a felerősített anyagból:

• Hígítsuk fel 10-szeresére friss transzgenikus egéragy homogenizátum szubsztrátummá.
• Végezze el az 96 PMCA ciklusokat a következő fordulókban, ugyanazokat az ultrahangos paramétereket fenntartva.
• Folytassa a kívánt számú körrel (általában legfeljebb 5-ig).

Detection of PrP^Sc

1. Proteinase K Digestion:
   – Kezelje a mintákat proteináz K-val (50 μg/mL) 37°C-on 1 órán át.
   – Állítsa le az emésztést SDS-mintapuffer hozzáadásával és 10 percig tartó forralással.
2. Western Blot Analysis:
   – Analyze digested samples using:
   – 6H4 or PRC1 anti-PrP antibodies.
   – Végezzen SDS-PAGE elválasztást, majd a kimutatáshoz vigye át a fehérjéket PVDF-membránokra.

 

A Hielscher UIP400MTP a legsokoldalúbban használható ultrahangos kezelőkészülék többüregű lemezekhez, PCR-lemezekhez és mintacsövekhez. 400 watt folyamatos ultrahangos kimenőteljesítményével olyan alkalmazásokra készült, mint a sejtlízis, az emulgeálás, a fehérjekivonás, a DNS / RNS fragmentálása, a deagglomerálás, az FFPE-extrakció, a sejtek és biofilmek leválasztása vagy az emulgeálás. Az UIP400MTP nem ultrahangos fürdő, hanem nagy intenzitású, csésze alakú szonotróddal működő készülék célzott ultrahangos kezeléshez. Ez a nagy teljesítményű, érintésmentes készülék egyenletes ultrahangos kezelést biztosít a szabványos mikrolemez minden üregében. Az amplitúdó, a teljesítmény és az impulzusüzem pontosan szabályozható. A beépített időzítő és hőmérséklet-érzékelő egyenletes eredményeket biztosít. Az UIP400MTP lemezkezelő készülék vízfürdővel hűti a mintákat, opcionálisan külső hűtőberendezéssel.

 

Dolgozzon fel több mintát a megbízhatóbb eredményekért

A többlyukú lemezekhez készült UIP400MTP ultrahangos kezelőberendezés jelentősen növeli a hibás fehérjehajtogatás ciklikus amplifikációjának (PMCA) hatékonyságát és skálázhatóságát, megoldást kínálva az eljárás hagyományosan időigényes jellegére. A rendszer egy 96 lyukú lemezben akár 96 minta egyidejű feldolgozását teszi lehetővé, így egyszerűsíti a PMCA-munkafolyamatokat, miközben minden mintalyukban pontos és egyenletes ultrahangos kezelési körülményeket tart fenn. Ez a nagy áteresztőképességű működés minimálisra csökkenti a kézi mintakezelést, mérsékli a munkaigényes lépéseket, és biztosítja a reprodukálhatóságot, így a berendezés nélkülözhetetlen eszközzé válik a prionkutatásban. Akár a krónikus sorvadásos betegséget, akár a Creutzfeldt–Jakob-betegséget vizsgálják, a UIP400MTP hatékonyabbá teszi a nagy léptékű vizsgálatokat, lehetővé téve a kutatók számára, hogy megfeleljenek a korszerű diagnosztikai és tudományos alkalmazások követelményeinek.

---

---

Szakirodalom / Hivatkozások

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.