PMCA a prionok nagy áteresztőképességű detektálásához a UIP400MTP Sonicator segítségével

A UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátor hatékony megoldást kínál a nagy áteresztőképességű mintaelőkészítéshez a fehérje hibás hajtogatású ciklikus amplifikációban (PMCA). Azáltal, hogy egyenletes energiaeloszlást biztosít több kút között, és fenntartja a pontos szonikálási paramétereket, ez a rendszer lehetővé teszi számos minta egyidejű feldolgozását kivételes reprodukálhatósággal. Ezek a képességek kritikus fontosságúak a PMCA optimalizálásához, hogy kimutassák a prionokat alacsony koncentrációban kihívást jelentő biológiai mintákban, például nyálban, ahol a vizsgálati inhibitorok elhomályosíthatják az eredményeket.

A prionbetegségek, mint például a szarvasfélék krónikus sorvadásos betegsége (CWD) és az emberi Creutzfeldt-Jakob-kór (CJD), neurodegeneratív rendellenességek, amelyeket rosszul hajtogatott prionfehérjék (PrP^Sc). Ezek a betegségek gyakran magukban foglalják a fertőző prionok alacsony szintjét a testfolyadékokban, például nyálban, vérben és vizeletben, ami bonyolítja a diagnózist és a kutatást. A CWD környezeti mátrixokban vedlett prionokon keresztüli horizontális átvitele különösen jelentős következményekkel jár a vadgazdálkodásra és az ökológiai egészségre. Hasonlóképpen, az olyan betegségekben, mint a Creutzfeldt-Jakob-kór, az emberi mintákból származó, rosszul hajtogatott prionfehérjék megbízható amplifikációja elengedhetetlen a diagnosztika fejlesztéséhez és a betegség progressziójának megértéséhez.

A módosított PMCA protokoll alkalmazása lehetővé teszi a gyakori vizsgálati inhibitorok (pl. mucinok a nyálban) megkerülését és nagy érzékenység elérését olyan prionok kimutatásában, amelyek egyébként nem lennének kimutathatók vagy kétértelműek olyan technikák alkalmazásával, mint a valós idejű rengés által indukált konverzió (RT-QuIC). Ezek a fejlesztések javítják a prion kimutatását különböző betegségek esetében, így a PMCA nélkülözhetetlen eszköz a prionkutatásban és -diagnosztikában. A többlyukú lemezes szonikátor megkönnyíti UIP400MTP a nagy áteresztőképességű PMCA szonikálását számos minta mikrolemezekben (pl. 6-, 24- vagy 96-lyukú lemezek) vagy injekciós üvegekben egy csőtartóban.

Protokoll a nagy áteresztőképességű fehérje hibás feltekeréséhez ciklikus erősítéshez (PMCA)

A következő protokoll lehetővé teszi a nagy mintaszám hatékony feldolgozását pontosan azonos feltételek mellett a robusztus kutatási eredmények érdekében.

Minta előkészítése

Kiindulási anyag:
Készítsen mintákat a következők szerint:

• Sarkosyl extrakciós pelletek reszuszpendálása PMCA szubsztrátumban.
• Közvetlenül tüskés agyi homogenizátumok vagy vérminták prionmaggal.

Hordozó:

• Használjunk 10%-os (tömeg/térfogat) agyi homogenizátumot, amelyet transzgenikus egerekből készítenek, és amelyek túlexpresszálják a PrP-t^C (pl. Tg egerek).
• Homogenizálja az agyszövetet:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Felhasználásig tárolja az aljzatot -80 ° C-on.

A minta beállítása mikrolemezben vagy csövekben:
Csövek:

• Adjunk hozzá 90 μl agyhomogenizáló szubsztrátumot és magot 10 μl mintával (pl. vér, agyhomogenizátum vagy sarkozilpellet).
• Helyezzen 3 teflongyöngyöt (1,59 mm vagy 2,38 mm átmérőjű) minden 0,2 ml-es csőbe.
• Szerelje fel a csöveket a UIP400MTP szonikátorral kompatibilis állványba.

6 lyukú mikrolemez:

• Adjunk hozzá 5 ml agyi homogenizáló szubsztrátumot és magot vájatonként 500 μl mintával.
• Adjunk hozzá 3 teflongyöngyöt minden lyukhoz.

PMCA eljárás

Elhelyezés:
Helyezze a csőtartót vagy az 6-lyukú mikrolemezt a UIP400MTP szonikátorba a gyártó utasításainak megfelelően.

Kerékpáros program:
Hajtson végre 144 PMCA-ciklust az alábbiak szerint:

• Inkubáció: 29 perc és 30 másodperc 37°C-on.
• Szonikálás: 30 másodperc 60% amplitúdóval.
• A hőmérséklet figyelése: A dugaszolható hőmérséklet-érzékelővel figyelheti a minta hőmérsékletét, és beprogramozhatja a UIP400MTP max. 48–50 °C-ra.

További fordulók:
A 144 ciklus első körének befejezése után vigyünk át egy aliquot részt a felerősített anyagból:

• Hígítsuk fel 10-szeresére friss transzgenikus egéragy homogenizátum szubsztrátummá.
• Végezze el az 96 PMCA ciklusokat a következő fordulókban, ugyanazokat az ultrahangos paramétereket fenntartva.
• Folytassa a kívánt számú körrel (általában legfeljebb 5-ig).

A PrP kimutatása^Sc

1. Proteináz K emésztés:
   – Kezelje a mintákat proteináz K-val (50 μg/ml) 37°C-on 1 órán keresztül.
   – Fejezzük be az emésztést SDS-minta puffer hozzáadásával és 10 percig forraljuk.
2. Western Blot elemzés:
   – Elemezze az emésztett mintákat a következők használatával:
   – 6H4 vagy PRC1 anti-PrP antitestek.
   – Végezze el az SDS-PAGE-et, és vigye át PVDF membránokra kimutatás céljából.

 

 

Több minta feldolgozása robusztusabb eredményekért

A UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátor jelentősen növeli a fehérje hibás összecsukható ciklikus amplifikáció (PMCA) hatékonyságát és skálázhatóságát, kezelve az eljárás hagyományosan időigényes jellegét. Azáltal, hogy lehetővé teszi akár 96 minta egyidejű feldolgozását egy 96 lyukú lemezen, a rendszer egyszerűsíti a PMCA munkafolyamatokat, miközben fenntartja a pontos és egységes szonikálási feltételeket minden lyukban. Ez a nagy áteresztőképességű képesség minimalizálja a kézi anyagmozgatást, csökkenti a munkaigényes lépéseket és biztosítja a reprodukálhatóságot, így nélkülözhetetlen eszköz a prionkutatáshoz. Legyen szó akár a krónikus sorvadásos betegségről, akár a Creutzfeldt-Jakob-kórról, a UIP400MTP elősegíti a nagyobb hatékonyságú nagyszabású vizsgálatokat, lehetővé téve a kutatók számára, hogy megfeleljenek a modern diagnosztikai és tudományos alkalmazások igényeinek.

---

---

Irodalom / Hivatkozások

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.