Baktériumminták ultrahangos sejtfelbomlasztása
A baktériumminták ritkán érkeznek valódi egysejtű szuszpenziók formájában. A tenyészetek láncokban és csomókban növekednek, a környezeti izolátumok extracelluláris polimer anyagokkal összekötött aggregátumokat alkotnak, a centrifugált üledékek pedig gyakran ellenállnak az újbóli szuszpendálásnak még alapos vortexelés ellenére is. Az életképes sejtek számlálása, az optikai sűrűség, az áramlási citometria és a mikrobióm-profilozás mind azt feltételezik, hogy egy részecske egy sejtnek felel meg. Az ultrahangos sejtdiszaggregáció megoldja ezt az ellentmondást: rövid, szabályozott ultrahangos impulzusok szétválasztják az aggregátumokat egyes sejtekre anélkül, hogy azokat felbomlasztanák.
Miért rontja a sejtek összecsapzódása az eredményeket?
Az aggregáció biológiai jelenség, nem pedig a mintakészítés során bekövetkezett hiba. A Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces és számos környezeti baktériumfaj láncokban, csomókban vagy biofilm-töredékekben szaporodik, és az extracelluláris DNS és poliszacharidok összeragasztják a sejteket a csomókban és a tamponeluatokban. Ennek analitikai következményei szisztematikusak:
- A kolóniák számát alulbecsülik, mivel egy csomó – függetlenül attól, hogy hány sejtet tartalmaz – egy kolóniát alkot.
- Az optikai sűrűségmérők és a részecskeszámlálók a sejtek helyett az aggregátumokat mérik, ami torzítja a növekedési görbéket.
- Az áramlási citometria és a sejtválogatás nem veszi figyelembe a csomósodott eseményeket, és kizárja azokat az elemzésből.
- A DNS- és fehérje-kivonások kizárólag az aggregátum felületén található sejteket tükrözik, ami torzítja a mikrobiómra és az omikára vonatkozó adatokat.
A hagyományos módszerek lassúak, nem teljes körűek, vagy kémiai változásokat idéznek elő. Az erőteljes pipettázás és vortexelés mikroszemcséket hagy hátra. Az enzim- vagy kelátképző alapú diszpergálás megváltoztatja a sejt felületét, amelyet esetleg elemezni szeretne. A szabályozott kavitációval történő mechanikus szétválasztás másodpercek alatt hat, és nem igényel adalékanyagokat.
Egy aggregátum egy kolóniának felel meg – és egy hibás eredmény. Nézze meg, hogyan hoz létre az ultrahangos szétválasztás valódi egysejtű szuszpenziókat sejtfelbomlás, aeroszolok vagy szondák használata nélkül. Kérjen további információt!
Többcsöves Sonicator VialTweeter az érintésmentes mintakészítéshez: A lezárt csövekben lévő sejtcsomókat szét kell szedni
Hogyan bontja szét az ultrahang a sejteket anélkül, hogy azokat felbomlasztaná?
Az ultrahangos sejtfelbomlás a mechanikai szilárdságbeli különbséget használja ki. A baktérium-aggregátumokat viszonylag gyenge sejtközi kötések és egy extracelluláris mátrix tartja össze, míg az ép sejtburkolat lényegesen nagyobb nyíróerőnek is ellenáll. Amikor a kalibrált ultrahang behatol a szuszpenzióba, az akusztikus kavitáció mikroszivárgást, nyomásimpulzusokat és nyíróerőket generál, amelyek elsősorban az aggregátumok határfelületein hatnak. A csomók, láncok és biofilm-töredékek szétnyíródnak (deagglomeráció), mielőtt elérnék azt az energiaszintet, amelynél a membránok megrepednek (lízis).
Bakteriális sejtcsomók ultrahangos szétválasztása
Szétválasztás vagy lízis – Miért fontosak az ultrahangos kezelés paraméterei?
Ennek gyakorlati következménye, hogy a diszaggregáció és a lízis ugyanazon a berendezésen, csak különböző paraméterekkel végzett eljárások. Mérsékelt amplitúdó, rövid impulzusciklusok és szabályozott hőmérséklet mellett életképes egysejtű szuszpenziót kapunk. Az amplitúdó, az expozíciós idő vagy a minta hőmérsékletének növelésével a folyamat az intracelluláris célpontok teljes sejtfelbomlása felé tolódik el. A Hielscher generátorok lehetővé teszik az amplitúdó, a teljesítmény, az impulzus és az energiabevitel pontos beállítását, valamint a módszer mentését, így a diszaggregációs lépés minták, kezelők és futtatások között is reprodukálható.
Hatékony érintésmentes ultrahangkezelés
A fürdőben végzett ultrahangos kezelés nem érheti utol ezt a szabályozást. Az ultrahangos tisztítófürdők és tartályok csak alacsony szintű ultrahangenergiát biztosítanak, ami a kezelés hiányosságához vezet, és a kavitáció egyenetlenül zajlik le, így az egyes csöveket a fürdőben elfoglalt helyzetüknek megfelelően kezelik. A VialTweeter intenzív, fókuszált ultrahangos erőt továbbít közvetlenül a tartály falán keresztül, egyszerre akár 10 lezárt mintára. Azok a kezelések, amelyek hosszú, változó expozíciós időt igényelnek a fürdőben, szabványosított impulzusmintázat szerint valósulnak meg.
A Hielscher érintésmentes ultrahangos készülékei intenzív, fókuszált ultrahangot juttatnak a zárt fiolák falain keresztül. A VialTweeter egyszerre akár 10 fiolát is feldolgoz azonos intenzitással, anélkül, hogy szonda lenne a mintában, keresztfertőzés lépne fel, vagy aeroszol szabadulna fel. Ha a feldolgozási kapacitás megköveteli, az UIP400MTP és UIP550MTP mikrolemez-ultrahangos készülékek ugyanazt az ellenőrzött energiaátvitelt biztosítják a többlyukú lemezek esetében is.
A VialTweeter Egyszerre akár 10 kisebb fiolát és 5 nagyobb kémcsövet is szonikázhat.
Az érintésmentes ultrahangos szétválasztás előnyei
- Nulla keresztfertőzés: Mivel az üvegcsék végig lezárt állapotban maradnak, és a mintába nem merítenek be semmilyen mérőszondát, a keresztfertőzés és a mintaveszteség teljesen kizárható. A minták között nincs semmi, amit sterilizálni kellene, és az egyik vizsgálat nem befolyásolhatja a következőt.
- Aeroszol elleni védelem: A nyitott szondás ultrahangkezelés fertőző aeroszolokat hoz létre, és szennyezi a műszerek felületét. A lezárt fiolás ultrahangkezelés során a minta a saját csőjében marad, ami fontos szempont olyan kórokozó baktériumok kezelése során, mint a Mycobacterium tuberculosis, valamint egyéb BSL-2-es vagy BSL-3-as kórokozók.
- Nincs borravaló-csökkenés: A titánszondák működés közben kis mennyiségű mikrorészecskét bocsáthatnak ki a mintába. Ezek a részecskék megváltoztatják az optikai sűrűséget és a részecskeszámot a folyamat későbbi szakaszában. A tartályfalon keresztül történő közvetett ultrahangkezelés teljes mértékben kiküszöböli ezt a szilárdanyag-forrást.
- Egyenletes átviteli sebesség: A VialTweeter akár 10 fiolának is azonos ultrahangintenzitást biztosít, így az ultrahangkezelés eredményei egyenletesek és megismételhetők. A fürdőkben és az egyetlen mintára irányuló szondázásnál előforduló pozícióhatások megszűnnek, és az alapvonalak az ismételt kísérletek során is összehasonlíthatók maradnak.
- A minta épsége: A csövek a feldolgozás teljes ideje alatt zárva maradnak, így a minta nem szennyeződhet, nem romolhat meg és nem párologhat el. A kis térfogatú minták hígítás nélkül is feldolgozhatók, beleértve azokat a értékes klinikai pelleteket is, amelyeknél nem engedhető meg egy további átöntési lépés.
- Folyamatirányítás: Az amplitúdó 20 és 100% között, az impulzusmód pedig 0 és 100% között állítható be; a rendszerek hőmérséklet-figyelést is támogatnak, így a hőérzékeny törzsek és fehérjék a káros határértékek alatt maradnak.
Tipikus alkalmazások
- Mikrobióma- és bél tartalomelemzés: a Lactobacillus- és Bifidobacterium-tenyészetek, valamint a székletminták szétoszlatása a lemezre helyezés vagy a szekvenálás előtt, hogy a csomók ne csökkentsék a kimutatott számot.
- Élelmiszer- és vízmikrobiológia: a csomók szétválasztása tamponmintákban, öblítőfolyadékokban és tenyésztő táptalajokban a telepek számának és az életképesség pontos meghatározása érdekében.
- Biofilm-kutatás: sejtek kinyerése hordozókról és felületekről egysejtű szuszpenziók formájában, anélkül, hogy enzimatikus kezeléssel eltávolítanák a felületi fehérjéket.
- Klinikai diagnosztika: köpet, genny és tamponeluvátumok reszuszpendálása biztonsági intézkedések mellett.
- Sejtkultúra: az összetapadt emlős-, rovar- és CHO-sejt-aggregátumok szétválasztása a sejtszámlálás és az átültetés előtt.
- A teljes munkafolyamat előkészítése: ugyanaz a készülék, amely alacsony amplitúdón felbontja a mintát, magasabb beállítások mellett teljes sejtfelbontást is végrehajt, így a lízis, a fehérje-kivonás és a DNS-fragmentálás csőáthelyezés nélkül következik egymás után.
UIP400MTP többmélységű lemez szonikátor sejtcsomók nagy áteresztőképességű szétválasztásához
Az UIP400MTP és UIP550MTP típusú mikrolemez-ultrahangos készülékek nem csupán többlyukú lemezeket, hanem csőállványokat is képesek feldolgozni.
Találja meg a szétválasztási munkafolyamatához legmegfelelőbb ultrahangos készüléket
VialTweeter többcsöves szonikátor
A steril, lezárt fiolák felbomlasztásának elsődleges módszere. A 200 wattos, 26 kHz-es frekvenciájú, automatikus hangolású UP200St processzor hajtja, a VialTweeter egyszerre akár 10 zárt fiola falain keresztül közvetett módon továbbítja az ultrahangot, fiolánként legfeljebb 10 W teljesítménnyel, így egyenletes és reprodukálható eredményeket biztosít keresztfertőzés és mintaveszteség nélkül. A titánból készült VialTweeter szonotród autoklávozható, amplitúdója és impulzusai beállíthatók és menthetők, ami pontosan az a szabályozási tartomány, amelyre egy deagglomerációs protokollnak szüksége van. A standard, 10 pozíciós szonotróda alkalmas automatikus mintavevő fiolák, mikrocentrifuga-csövek, valamint 1–5 ml-es Eppendorf- vagy Nunc-csövek befogadására. A VialPress rögzítőberendezés legfeljebb 5 nagyobb, legfeljebb 20 mm átmérőjű edényt képes befogadni.
A Falcon csövekhez, valamint a tartály méretére szabott egyedi fiolákhoz különálló, egycsöves VialTweeter modellek állnak rendelkezésre. A blokk-szonotród szétszerelése után az UP200St alapegység hagyományos szondás ultrahangos készülékként működik, kis és közepes méretű minták közvetlen kezelésére.
Mikrolemezes ultrahangos készülékek
Átállás nagy áteresztőképességű mintakészítésre többlyukú lemezek ultrahangos kezelésével: A lemezalapú munkafolyamatok esetében az UIP400MTP és UIP550MTP mikrolemez-ultrahangos készülékek az érintésmentes, egyenletes ultrahangos kezelést tíz csőből egy teljes lemezre terjesztik ki.
A 400 wattos UIP400MTP készülék szabványos mikrotiter- és többlyukú lemezeket – beleértve a 96-lyukú formátumokat is – kezel, precíz amplitúdó-, teljesítmény- és impulzusvezérléssel, valamint időzítővel, hőmérséklet-érzékelővel és vízfürdős hűtéssel. A biofilm eltávolítása és a baktériumtenyészetek feldolgozása az UIP400MTP mikrolemez-ultrahangos készülék bevett alkalmazási területei.
Az 550 wattos UIP550MTP a nagyobb teljesítményű változat – ideális a nagyobb igénybevételt igénylő alkalmazásokhoz.
Mindkét érintésmentes ultrahangos kezelő rendszer megbízhatóan feldolgozza a 6-, 12-, 24-, 48-, 96- és 384-lyukú lemezeket, valamint a csőállványokat és a Petri-csészéket. A Hielscher mikrolemez-ultrahangosítói bármilyen szabványos lemezzel működnek, így elkerülhetők a drága, gyártóspecifikus fogyóeszközök. A programozható hőmérsékleti határértékeknek köszönhetően az ultrahangosítás automatikusan szünetel a minta maximális hőmérsékletének elérésekor, majd a lehűlés után folytatódik, így megóvva a sejtek életképességét az ismételt ciklusok során. Intelligens és megbízható, nagy áteresztőképességű mintakészítés az ismételhető eredmények érdekében.
Az alábbi táblázat áttekintést nyújt az élettudományok, a genomika, a proteomika és a diagnosztika területén alkalmazott laboratóriumi mintavizsgáló ultrahangos készülékeink hozzávetőleges feldolgozási kapacitásáról:
| Ajánlott eszközök | Kötegelt mennyiség | Áramlási sebesség |
|---|---|---|
| VialTweeter többcsöves szonikátor | 00,5–1,5 ml-es fiolák | n.a. |
| UIP400MTP többlyukú lemez-ultrahangos készülék (440 watt) | Több lyukú / mikrotiter lemezek | n.a. |
| UIP550MTP többlyukú lemez-ultrahangos készülék (550 watt) | Több lyukú / mikrotiter lemezek | n.a. |
| Ultrahangos CupHorn | CupHorn injekciós üvegekhez vagy főzőpohárhoz | n.a. |
| UP100H 100 wattos szondás ultrahangos készülék | 1–500 ml | 10–200 ml/perc |
| UP200Ht, UP200St 200 wattos szondás ultrahangos készülékmodellek | 10–1000 ml | 20–200 ml/perc |
| UP400St 400 wattos szondás ultrahangos készülék | 10 és 2000 ml között | 20–400 ml/perc |
| GDmini2 | steril ultrahangos mikroáramlású reaktor | n.a. |
| Ultrahangos szitarázó | n.a. | n.a. |
Gyakran feltett kérdések az ultrahangos sejtfelbontásról
Mi a különbség a sejtek szétválasztása és a sejtek lízise között?
A diszaggregáció – más néven deagglomeráció – az összetapadt sejteket egysejtű szuszpenzióvá választja szét úgy, hogy a sejtek sértetlenek és életképesek maradnak. A lízis felbontja a sejtburkot, és felszabadítja a sejten belüli tartalmat. Mindkét folyamatot a kavitációs nyíróerő hajtja, a különbség pedig az energiabevitelben rejlik. Az amplitúdó, az impulzus és a hőmérséklet optimális beállításával az ultrahangos kezelés a lízis küszöbérték alatt valósítja meg a diszaggregációt.
Miért nem alkalmasak az ultrahangos fürdők a szabványosított szétválasztásra?
A fürdők csak alacsony szintű ultrahangenergiát biztosítanak, ami a kezelés hiányosságához vezet, és a kavitáció a tartályban nagyon egyenetlenül alakul ki, így az egyes minták elhelyezkedésüktől függően eltérő kezelésben részesülnek. A mikrobiológiai számlálások és az összehasonlító vizsgálatok az összehasonlíthatóságtól függenek. Az érintésmentes ultrahangos készülékek, mint például a Multi-Tube Sonicator VialTweeter, valamint az UIP400MTP és UIP550MTP mikrolemez-ultrahangos modellek minden edényt beállított ultrahangos feltételek mellett dolgoznak fel, ami javítja a reprodukálhatóságot a replikátumok között.
A szonikálás károsíthatja a sejteket?
Igen, ha a paramétereket nem szabályozzák. A túlzott ultrahangkezelés vagy a szabályozatlan felmelegedés károsíthatja a sejteket, a felszabaduló DNS pedig viszkózusabbá teszi a mintákat, és elősegíti az újbóli aggregációt. Éppen ezért a folyamatot gondosan kell kidolgozni: a mérsékelt amplitúdó, az impulzusos ciklusok, a hűtés és a hőmérséklet-korlátozott műszerek biztosítják, hogy a kezelés a görbe diszaggregációs oldalán maradjon.
A Hielscher összes digitális ultrahangos készüléke pontosan szabályozható paraméterekkel, csatlakoztatható hőmérséklet-érzékelőkkel, programozható beállításokkal és automatikus adatnaplózással rendelkezik a megbízható mintakészítés érdekében.
Át kell-e helyezni a mintát egy másik edénybe?
Nem. A fiolákat és a lemezeket eredeti, lezárt csomagolásukban dolgozzák fel. A közvetett ultrahangkezelés révén elkerülhetők mind az áthelyezésből adódó veszteségek, mind a szonda kezelésével járó szennyeződés.
Milyen típusú fiolákat képes feldolgozni a VialTweeter?
A szabványos, 10 pozíciós szonotróda alkalmas automatikus mintavevő fiolák, mikrocetrifuga-csövek, valamint 1–5 ml-es Eppendorf- vagy Nunc-csövek befogadására. A VialPress kiegészítő legfeljebb 5 nagyobb, legfeljebb 20 mm átmérőjű edény befogadására alkalmas. Különleges, egycsöves VialTweeter modellek kaphatók Falcon-csövekhez, valamint egyedi, egyfiolás vagy nagyobb méretű formátumokhoz.
Lehet-e egy készülékkel elvégezni a szétválasztást és a lízist?
Igen. Ugyanaz a berendezés, amely mérsékelt amplitúdónál szétválasztja a sejteket, nagyobb amplitúdón és hosszabb expozíciós idő mellett teljes sejtfelbomlást eredményez, így az egysejtű szuszpenzió előállítása és a későbbi kivonás egymást követően, platformváltás nélkül elvégezhető.
Alkalmazzák-e az ultrahangkezelést az MBEC-vizsgálatok során?
Az ultrahangkezelés egy bevált és nagyrészt szabványos eljárás. A peg-lid MBEC-vizsgálatban, miután a biofilmeket polisztirol csapokon tenyésztették és antibiotikumnak tették ki, a csapokat friss táptalajra helyezik át, majd vortexelésnek és ultrahangkezelésnek vetik alá, hogy a tapadó biofilmsejteket leválasszák és szétválasszák, és planktonikus szuszpenzióvá alakítsák őket a sorozatos hígítás és az életképes sejtek számlálása előtt (az MBEC-értéket úgy határozzák meg, mint a legalacsonyabb olyan koncentrációt, amely a visszanyert sejtszámot ≥3 log10-rel csökkenti a kezeletlen biofilmhez képest). Az ultrahangkezelés jelentősen javítja a diszperzió minőségét: a beágyazódott sejtek nem teljes felszabadulása az EPS-mátrixból alulbecsüli a biofilm felszámolását, és felfelé torzítja az MBEC-értékeket. A vizsgálati lemezeken található, csapokat tartó üregek célzott ultrahangkezelése az UIP400MTP mikrolemez-ultrahangkezelővel kiküszöböli a hagyományos fürdőultrahangkezelés gyengeségeit – nevezetesen az egyenetlen energiaeloszlás, a túlmelegedés, valamint az aeroszolok és a keresztfertőzés kockázata.
Tudja meg, hogyan segíti elő az érintésmentes UIP400MTP mikrolemez-ultrahangos készülék az MBEC-vizsgálatok elvégzését!
Alkalmazzák-e az ultrahangkezelést a MIC-vizsgálatok során?
Az ultrahangkezelést különböző, a MIC-hez kapcsolódó munkafolyamatok során alkalmazzák a hatékonyság és a reprodukálhatóság javítása érdekében:
- a mikobakteriológia területén, ahol a köpetet és más viszkózus mintákat az érzékenységi vizsgálat előtt rutinszerűen fertőtlenítik és homogenizálják – esetenként ultrahangos kezeléssel –, és a csomóképző mikobaktérium-inokulátumok esetében a pontos MIC-értékek meghatározásához célszerű a rövid idejű diszpergálás;
- aggregációra hajlamos organizmusok (pl. streptococcusok, pellet formájú staphylococcusok), amelyeknél a mikroaggregátumok torzítják az inokulum sűrűségét; és
- kombinált diagnosztikai módszerek, például az implantátum ultrahangos tisztítása és folyadékkultúra, majd az erre követő érzékenységi vizsgálat a protézis-fertőzések esetén (MBEC-szerű, nem pedig klasszikus MIC-alapú alkalmazás).
Fedezze fel az ultrahangos kezelés alkalmazását a MIC-vizsgálatokban!
Irodalom / Hivatkozások
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Válassz magadnak egy tányért! Az UIP550MTP mikrolemezes ultrahangos készülék bármely szabványos többlyukú lemezen szétválasztja a baktériummintákat.
Hielscher Multi-Sample Sonicator modellek UIP400MTP mikrolemezekhez, VialMagassugárzó és Cuphorn: nagy sebességű és nagy áteresztőképességű mintaelőkészítés