Bakteriális minták sejtaggregátumainak ultrahangos szétbontása

A bakteriális minták ritkán érkeznek valódi, egyedi sejtekből álló szuszpenzióként. A tenyészetek láncokban és pelyhekben növekednek, a környezeti izolátumok extracelluláris polimer anyagokkal összekötött aggregátumokat képeznek, a centrifugálással kapott üledékeket pedig gyakran még alapos vortexkeverés után is nehéz újraszuszpendálni. Az életképes sejtek számlálása, az optikai sűrűség mérése, az áramlási citometria és a mikrobiomprofil-meghatározás egyaránt azt feltételezi, hogy egy részecske egy sejtnek felel meg. A sejtaggregátumok ultrahangos szétbontása feloldja ezt az ellentmondást: rövid, szabályozott ultrahangos impulzusok egyedi sejtekre választják szét az aggregátumokat anélkül, hogy lizálnák a sejteket.

Miért veszélyezteti a sejtaggregáció az eredményeit?

Az aggregáció biológiai sajátosság, nem pedig minta-előkészítési hiba. A Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces és számos környezeti faj láncokban, csoportokban vagy biofilmtöredékekben növekszik, az extracelluláris DNS és a poliszacharidok pedig összeragasztják a sejteket az üledékekben és a mintavevő pálcák eluátumaiban. Az analitikai következmények szisztematikusak:

• A telepszámot alulbecsülik, mert egy sejtcsomó egyetlen telepet képez, függetlenül attól, hogy hány sejtet tartalmaz.
• Az optikai sűrűség mérése és a részecskeszámlálók sejtek helyett aggregátumokat jeleznek, torzítva a növekedési görbéket.
• Az áramlási citometria és a sejtválogatás hibásan számolja az összecsomósodott sejtekhez tartozó eseményeket, és kizárja azokat az elemzésből.
• A DNS- és fehérjekivonások csak az aggregátum felszínén található sejteket reprezentálják, torzítva a mikrobiom- és omikai adatokat.

A hagyományos megoldások lassúak, nem teljes körűek, vagy kémiai változásokat okoznak. Az erőteljes pipettázás és vortexkeverés után mikroaggregátumok maradnak vissza. Az enzimes vagy kelátképző szereken alapuló diszpergálás módosítja azt a sejtfelszínt, amelyet esetleg elemezni kíván. A szabályozott kavitációval végzett mechanikai szétbontás másodperceken belül hat, és nem igényel adalékanyagokat.

Hogyan bontja szét az ultrahangos kezelés a sejtaggregátumokat a sejtek lizálása nélkül?

A sejtaggregátumok ultrahangos szétbontása a mechanikai szilárdság különbségét használja ki. A bakteriális aggregátumokat viszonylag gyenge sejtközötti kötések és extracelluláris mátrix tartják össze, míg az ép sejtburok lényegesen nagyobb nyíróhatást visel el. Amikor a kalibrált ultrahang belép a szuszpenzióba, az akusztikus kavitáció mikroáramlásokat, nyomásimpulzusokat és nyíróerőket hoz létre, amelyek először az aggregátumok határfelületein hatnak. A nyíróhatás szétválasztja a sejtcsomókat, láncokat és biofilmtöredékeket (deagglomeráció), mielőtt elérné azt az energiaszintet, amelynél a membránok felszakadnak (lízis).

Bakteriális sejtcsomók ultrahangos szétbontása

Aggregátumok szétbontása vagy lízis – az ultrahangos kezelési paraméterek szerepe

Ennek gyakorlati következménye, hogy az aggregátumok szétbontása és a lízis ugyanazzal a készülékkel, eltérő paraméterekkel végezhető. Mérsékelt amplitúdóval, rövid impulzusciklusokkal és szabályozott hőmérsékleten életképes, egyedi sejtekből álló szuszpenziót kap. Az amplitúdó, a kezelési idő vagy a mintahőmérséklet növelése az intracelluláris célanyagok kinyeréséhez szükséges teljes sejtfeltárás felé tolja a folyamatot. A Hielscher generátorok lehetővé teszik az amplitúdó, a teljesítmény, az impulzus és az energiabevitel pontos beállítását, valamint a módszer mentését, így az aggregátumok szétbontása különböző minták, kezelők és futtatások esetén is reprodukálható.

Hatékony, érintkezésmentes ultrahangos kezelés

Az ultrahangos fürdőben végzett kezelés nem biztosít ilyen szintű szabályozhatóságot. Az ultrahangos tisztítófürdők és tartályok csak kis ultrahangos energiát biztosítanak, ami hiányos minta-előkészítést eredményez, a kavitáció pedig egyenetlenül jelentkezik, így az egyes csövek kezelése a fürdőben elfoglalt helyzetüktől függ. A VialTweeter intenzív, fókuszált ultrahangos erőket továbbít közvetlenül az edény falán keresztül egyszerre akár 10 lezárt mintába. A fürdőben hosszú, változó idejű kezelést igénylő eljárások szabványosított impulzusmintázattal végezhetők el.
A Hielscher érintkezésmentes ultrahangos készülékei intenzív, fókuszált ultrahangot juttatnak a lezárt fiolák falán keresztül a mintákba. A VialTweeter egyszerre akár 10 fiolát dolgoz fel azonos intenzitással, a mintába helyezett szonda, keresztszennyeződés és aeroszolkibocsátás nélkül. Ahol a mintafeldolgozási kapacitás ezt megköveteli, az UIP400MTP és UIP550MTP mikrolemezekhez készült ultrahangos készülékek ugyanezt a szabályozott energiaátadást többlyukú lemezekre is kiterjesztik.

A sejtaggregátumok érintkezésmentes ultrahangos szétbontásának előnyei

• Keresztszennyeződés teljes kizárása: Mivel a fiolák végig lezárva maradnak, és nem merül szonda a mintába, a keresztszennyeződés és a mintaveszteség teljesen elkerülhető. A minták között semmit sem kell sterilizálni, és az egyik futtatás nem befolyásolhatja a következőt.
• Aeroszolok elleni védelem: A nyitott edényben, szondával végzett ultrahangos kezelés fertőző aeroszolokat hoz létre, és szennyezi a készülék felületeit. A lezárt fiolában végzett ultrahangos kezelés a mintát a saját csövében tartja, ami fontos olyan patogén baktériumok kezelésekor, mint a Mycobacterium tuberculosis, illetve más BSL-2 vagy BSL-3 besorolású ágensek esetén.
• Nincs szondacsúcserózió: A titánszondákból működés közben kis mennyiségű mikrorészecske kerülhet a mintába. Ezek a részecskék megváltoztatják a későbbi optikaisűrűség-mérés és részecskeszámlálás eredményeit. Az edény falán keresztül végzett közvetett ultrahangos kezelés teljesen kiküszöböli ezt a szilárdrészecske-forrást.
• Egyenletes mintafeldolgozási kapacitás: A VialTweeter az akár 10 fiola mindegyikébe azonos intenzitású ultrahangot juttat, így az ultrahangos kezelés eredményei egyenletesek és reprodukálhatók. Megszűnnek a fürdőket és az egyenkénti szondás mintakezelést terhelő helyzetfüggő hatások, és az alapértékek összehasonlíthatók maradnak az ismétlések között.
• A minta épsége: A csövek a feldolgozás teljes ideje alatt zárva maradnak, így a minta nem szennyeződhet, nem romolhat meg és nem párologhat el. Kis térfogatok hígítás nélkül is kezelhetők, beleértve az értékes klinikai üledékeket, amelyeknél nem engedhető meg egy további átviteli lépés.
• Folyamatszabályozás: Az amplitúdó 20 és 100% között, az impulzusüzem 0 és 100% között állítható, a rendszerek pedig támogatják a hőmérséklet-felügyeletet, így a hőérzékeny törzsek és fehérjék hőmérséklete a károsodási küszöbértékek alatt marad.

Tipikus alkalmazások

• Mikrobiom- és béltartalom-elemzés: Lactobacillus-, Bifidobacterium- és székletminták diszpergálása szélesztés vagy szekvenálás előtt, hogy a sejtcsomók ne csökkentsék a számlálási eredményeket.
• Élelmiszer- és vízmikrobiológia: pelyhek szétbontása pálcával vett mintákban, öblítőfolyadékokban és dúsító táplevesekben a telepszám és az életképesség pontos meghatározásához.
• Biofilmkutatás: sejtek kinyerése hordozókról és felületekről egyedi sejtekből álló szuszpenzióként, a felszíni fehérjéket eltávolító enzimes kezelés nélkül.
• Klinikai diagnosztika: köpet, genny és mintavevő pálcák eluátumainak újraszuszpendálása izolációs körülmények között.
• Sejttenyésztés: összecsomósodott emlős-, rovar- és CHO-sejtaggregátumok szétválasztása számlálás és passzálás előtt.
• Előkészítés a teljes munkafolyamathoz: ugyanaz a készülék, amely kis amplitúdónál szétbontja az aggregátumokat, magasabb beállítások mellett teljes sejtfeltárást végez, így a lízis, a fehérjekivonás és a DNS-fragmentálás a minta másik csőbe történő átvitele nélkül következhet.

Szakirodalom / Hivatkozások

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.