Sonikation für die Zelllyse: Aufschluss und Extraktion von Zellen
Die Zelllyse mit Ultraschall ist eine weit verbreitete Technik zur Probenvorbereitung in modernen Biotech-Labors. Ihr Hauptzweck besteht darin, Zellmembranen oder ganze Zellen aufzubrechen, um intrazelluläre Bestandteile wie Proteine, Nukleinsäuren oder Organellen freizusetzen. In der täglichen Laborarbeit bedeutet dies, dass die Sonikation eine Standardmethode für den kontrollierten Zellaufschluss und die effiziente Extraktion von Biomolekülen ist. Der Hauptvorteil von Sonikatoren liegt in ihrer Fähigkeit, kritische Prozessparameter, einschließlich der Ultraschallintensität, der Pulsation und der Temperaturregelung, präzise zu modulieren. Durch diese Steuerung können Forscher eine zuverlässige Lyse erreichen und gleichzeitig die thermische oder mechanische Schädigung empfindlicher Biomoleküle minimieren, was zu einem schonenden und dennoch hocheffizienten Extraktionsverfahren führt.
Zelllyse mit Sonicators
Die Zelllyse mit Ultraschall nutzt die akustische Kavitation, um Zellmembranen zu zerstören und intrazelluläre Moleküle freizusetzen. Hielscher Ultrasonics bietet neben dem klassischen Sondenschallkopf auch Mehrprobenschallköpfe für die sterile Aufbereitung an: den VialTweeter für mehrere Röhrchen und Vials und den 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP für Standard-Mikroplatten.
Hielscher Ultrasonics liefert leistungsstarke Non-Contact Sonicators für die Probenvorbereitung und klinische Analyse. Das Multiwell-Plattenbeschallungsgerät UIP400MTP, Der VialTweeter, das CupHorn und dem GDmini2 Strömungssonicator Verarbeitung der Proben unter sterilen Bedingungen.
Ultraschallhomogenisatoren UP100H (100 Watt) und UP400St (400 Watt): Sonikation für Zelllyse und Extraktion.
Ultraschallhomogenisatoren für Zell-Lyse und Extraktion
| Ultraschallgerät Typ | Anwendungsschwerpunkt | Probenmenge | Typischer Anwendungsfall | Vorteile | Beispielhafte Modelle |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonicator mit Sonotrode | Beschallung von Einzelproben | 0.1 mL bis ~1000 mL | Zelllyse, Proteinextraktion, DNA/RNA-Fragmentierung | Präzise Energiekontrolle; verschiedene Sonotroden; optimal für kleine bis mittlere Proben | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Parallele Verarbeitung von mehreren versiegelten Fläschchen | 8-10 Fläschchen (~1-20 mL pro Stück) | Standardisierte Lyse von Mehrfachzellsuspensionen | Gleichmäßige Beschallung; Vermeidung von Kreuzkontaminationen; reproduzierbare Ergebnisse | VialTweeter, CupHorn |
| Sonicator für 96-Well-Platten | Sonikation von Multiwell- und Mikrotiterplatten | Mikroplatten-Format | Hochdurchsatz-Screening, Proteomik, Zellassays | Gleichzeitige, gleichmäßige Beschallung aller Wells; ideal für Arbeitsabläufe mit mehreren Proben | UIP400MTP |
| Durchflusszellenreaktoren | Kontinuierliche Beschallung für höhere Volumen | >1 L, skalierbar | Zellaufschluss im industriellen Maßstab, Extraktproduktion | Kontinuierliche Verarbeitung; skalierbar; vollständige Prozesskontrolle (Amplitude, Druck, Temperatur) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + Durchflusszelle |
| Sterile / Indirekte Beschallungssysteme | Kontaminationsfreie Probenverarbeitung | Fläschchen/Röhrchen/Mikroplatte abhängig | Empfindliche Proben, sterile Umgebungen, behördliche Vorgaben | Kein Sondenkontakt; vermeidet Verschleppung; minimaler Reinigungsaufwand | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Vorteile der Verwendung von Sonikation für die Zelllyse
Im Vergleich zu anderen Methoden der Lyse und Extraktion hat der Zellaufschluss mit Ultraschall mehrere Vorteile:
- Geschwindigkeit: Die Zelllyse und -extraktion mit Ultraschall ist ein schnelles Verfahren, mit dem Zellen innerhalb von Sekunden aufgebrochen werden können. Dies ist viel schneller als andere Methoden wie Homogenisierung, Gefrier-Auftauen oder Bead-Milling.
- Effizienz: Die ultraschall-gestützte Lyse und Extraktion kann zur Behandlung kleiner, großer oder mehrerer Proben auf einmal verwendet werden, was sie effizienter macht als andere Methoden, mit denen jeweils nur kleine einzelne Proben individuell bearbeitet werden können.
- Chemikalien-frei: Die Zelllyse und -extraktion mit Ultraschall ist eine nicht-invasive Methode, die ohne den Einsatz von aggressiven Chemikalien oder Enzymen auskommt. Dies macht sie ideal für Anwendungen, bei denen die Integrität des Zellinhalts erhalten bleiben muss. Unerwünschte Kontaminationen der Proben können dadurch vermieden werden.
- Hohe Ausbeute: Durch den Zellaufschluss mit Ultraschall kann eine hohe Ausbeute an intrazellulären Substanzen, einschließlich DNA, RNA und Proteinen, gewonnen werden. Dies liegt daran, dass die Hochfrequenz-Schallwellen die Zellwände aufbrechen und die Inhalte in die umgebende Lösung freisetzen.
- Temperaturregelung: Hochentwickelte Ultraschallgeräte ermöglichen eine präzise Temperaturkontrolle der Probe. Die digitalen Ultraschallgeräte von Hielscher sind mit einem steckbaren Temperatursensor und Temperaturüberwachungssoftware ausgestattet.
- Reproduzierbar: Protokolle für den Ultraschall-Zellaufschluss lassen sich leicht reproduzieren und durch ein einfaches lineares Scale-up an verschiedene größere oder kleinere Probenvolumina anpassen.
- Vielseitig: Die Zelllyse und -extraktion mit Ultraschall kann zur Extraktion zahlreicher Zelltypen und Probenvarianten verwendet werden, darunter Bakterien, Hefe, Pilze, Pflanzen- und Säugetierzellen. Es können zuverlässig verschiedene Arten von Molekülen extrahiert werden, z.B. Proteine, DNA, RNA und Lipide.
- Gleichzeitige Vorbereitung einer Vielzahl von Proben: Hielscher Ultrasonics bietet mehrere Lösungen, um zahlreiche Proben unter exakt gleichen Prozessbedingungen komfortabel zu bearbeiten. Das macht den Probenvorbereitungsschritt der Lyse und Extraktion hocheffizient und zeitsparend.
- Einfach zu bedienen: Ultraschallgeräte für die Zelllyse und -extraktion sind einfach zu bedienen und erfordern nur minimale Schulung. Die Geräte sind zudem wirtschaftlich, da es sich um eine einmalige Investition handelt, die keine Neuanschaffung von Verbrauchsmaterialien erfordert. Das macht den Ultraschallhomogenisator für eine Vielzahl von Forschern und Labors sehr attraktiv.
Insgesamt ist die Zelllyse und -extraktion mit Ultraschall ein schnelles, effizientes, genau kontrollierbares und vielseitiges Verfahren zur Extraktion von Zellinhalten. Ihre Vorteile gegenüber alternativen Methoden machen sie zu einer attraktiven Wahl für ein breites Spektrum von Forschungs- und Industrieanwendungen.
Funktionsprinzip des Zellaufschlusses mit Ultraschall
Bei dem Zellaufschluss und der Extraktion mittels Ultraschall werden Zellen mit Hilfe von Hochfrequenzschallwellen aufgespalten und ihr Inhalt freigesetzt. Die Schallwellen erzeugen Druckänderungen in der umgebenden Flüssigkeit, wodurch sich kleine Blasen bilden und in einem als Kavitation bezeichneten Prozess implodieren. Diese Blasenimplosion erzeugt lokal hochintensive mechanische Kräfte, die Zellen aufbrechen und ihren Inhalt in die umgebende Lösung freisetzen können.
Der Zellaufschluss mit einem Ultraschallstab umfasst in der Regel die folgenden Schritte:
- Die Probe wird in ein Röhrchen oder Becherglas mit einem flüssigen Puffer gegeben.
- Der Ultraschallstab (Sonotrode) wird in die Probe eingeführt, und es werden hochfrequente Schallwellen mit ca. 20-30 kHz eingekoppelt.
- Die Ultraschallwellen verursachen Schwingungen und Kavitation in der umgebenden Flüssigkeit, wodurch lokalisiert hochintensive Kräfte entstehen, welche die Zellen aufbrechen und ihren Inhalt freisetzen.
- Die Probe wird zentrifugiert oder filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und das extrahierte Lysat wird für die anschließende Analyse gesammelt.
Nachteile der gängigen Lyseverfahren
Während Ihrer Arbeit in Labors haben Sie vielleicht schon einmal eine der häufigen Probleme mit herkömmlichen mechanischen oder chemischen Lyseprotokollen erlebt.
- Mechanischer Zellaufschluss: Mechanische Lyseverfahren wie das Zerkleinern mit Mörser und Stößel oder das Homogenisieren mit einer French Press, einer Perlmühle oder einem Rotor-Stator-System verfügen oft nicht über präzise Kontroll- und Einstellmöglichkeiten. Das bedeutet, dass beim Mahlen und Zerkleinern schnell Hitze und Scherkräfte entstehen können, die die Probe schädigen und Proteine denaturieren können. Diese Methoden sind zudem häufig zeitaufwendig und erfordern große Mengen an Probenmaterial.
- Chemischer Zellaufschluss: Chemische Lyseverfahren, z. B. auf der Basis von Detergenzien, können die Probe schädigen, indem sie die Lipiddoppelschicht zerstören und Proteine denaturieren. Die chemische Lyse erfordert häufig auch mehrere Durchgänge und hinterlässt Restverunreinigungen, welche nachgelagerte Analyseschritte beeinträchtigen können. Die optimale Dosierung des Detergens zu finden, ist eine zusätzliche Herausforderung.
- Frost-Tau-Zyklen: Gefrier-Tau-Zyklen können bewirken, dass Zellmembranen aufgeschlossen werden. Allerdings können wiederholte Zyklen zur Denaturierung und zur Zersetzung von Proteinen führen. Die Frost-Tau-Methode erfordert meist mehrere Zyklen, was zeitaufwändig ist und oftmals nur geringere Erträge bringt.
- Enzymatische Lyse: Enzymatische Lyseverfahren werden spezifisch für bestimmte Zelltypen entwickelt und erfordern mehrere Schritte, was sie zeitaufwändig macht. Beim enzymatischen Zellaufschluss fällen Abfallprodukte an. Der Prozess der enzymatischen Lyse muss sorgfältig optimiert werden, um eine Denaturierung der Probe zu vermeiden. Enzymatische Lyse-Kits sind oft teuer. Wenn Ihr derzeitiges enzymatisches Lyseverfahren unzureichende Ergebnisse liefert, kann die Beschallung als synergistische Methode eingesetzt werden, um den Zellaufschluss zu intensivieren.
Im Gegensatz zu herkömmlichen mechanischen und chemischen Zelllyseverfahren ist die Beschallung ein sehr effizientes und zuverlässiges Werkzeug für den Zellaufschluss, das eine vollständige Kontrolle über die Beschallungsparameter ermöglicht. Dies gewährleistet eine hohe Selektivität bei der Materialfreisetzung und Produktreinheit. (vgl. Balasundaram et al., 2009)
Der ultraschall-gestützte Zellaufschluss ist für alle Zelltypen geeignet und lässt sich leicht in kleinem und großem Maßstab anwenden. – immer unter kontrollierten Bedingungen. Ultraschallhomogenisatoren sind leicht zu reinigen. Ein Ultraschall-Stabhomogenisator verfügt immer über eine Clean-in-Place (CIP)- und Sterilize-in-Place (SIP)-Funktion. Die Sonotrode besteht aus einem massiven Titanhorn, das mit Ethanol abgewischt oder in Wasser oder Lösungsmittel (je nach Arbeitsmedium) gespült werden kann. Die Wartung von Ultraschallgeräten ist aufgrund ihrer Robustheit nahezu vernachlässigbar.
Ultraschall-gestützte Lyse und Zellaufschluss
Der typische Lyse-Vorgang für eine Laborprobe dauert normalerweise zwischen 15 Sekunden und 2 Minuten. Da die Beschallungsintensität sehr einfach über die Ultraschallamplitude sowie durch die Wahl der richtigen Ultraschallausrüstung regeln lässt, ist es möglich, die Zellmembran sehr sanft oder sehr abrupt zu lysieren. Die gewählte Intensität ist von der Zellstruktur und dem Zweck bzw. Ziel der Lyse abhängig (z.B. erfordert die DNA-Extraktion eine milde Sonorisierung, wohingegen für eine vollständige Proteinextraktion aus Bakterien eine intensivere Ultraschallbehandlung notwendig ist). Die Prozesstemperatur kann durch einen integrierten Temperatursensor permanent überwacht werden und ist durch Kühlung (Eisbad oder Reaktor mit Kühlmantel) oder Sonorisierung im Puls-Modus leicht zu regulieren. Während der Beschallung im Puls-Modus ermöglichen kurze Ultraschallzyklen von 1-15 Sekunden eine bessere Wärmeableitung und Abkühlung der Probe während der Unterbrechungsphasen.
Alle Ultraschall-Prozesse sind vollständig reproduzierbar und linear skalierbar.
Der VialTweeter ist ein Ultraschall-Homogenisator für die gleichzeitige, gleichmäßige und schnelle sterile Aufbereitung zahlreicher Proben.
- Vorbereitung der Zellsuspension: Die Zellpellets müssen vollständig in einer Pufferlösung durch Homogenisieren gelöst werden (Wählen Sie Ihre Pufferlösung so, dass sie zur darauffolgenden Analysemethode, z.B. einer bestimmte Chromatographie-Methode passt). Fügen Sie je nach Bedarf Lysozyme und/ oder andere Zusatzstoffe hinzu. (Achten Sie auch hier darauf, dass diese mit der Trenn- / Reinigungsmethode kompatibel sind.) Mischen/ homogenisieren Sie die Lösung bei milder Beschallungsintensität bis die Probe komplett gelöst ist.
- Ultraschall-Lyse: Legen Sie die Probe in ein Eisbad. Um die Zellen aufzubrechen, beschallen Sie die Suspension in 60-90 Sekunden langen Stößen (verwenden Sie den Impulsmodus Ihres Ultraschallgeräts).
- Trennung: Zentrifugieren Sie das Lysat (z.B. 10 min. 10.000 x g; bei 4degC). Trennen Sie sorgfältig den Überstand von dem Zellpellet. Der Überstand enthält das gesamte Zelllysat. Nach dem Filtrieren des Überstands erhalten Sie eine klare Flüssigkeit des löslichen Zellproteins.
Die häufigsten Anwendungen für Ultraschallgeräte in Biologie und Biotechnologie sind:
- Zellextrakt-Vorbereitung
- Zellaufschluss von Hefe, Bakterien, Pflanzenzellen, weichem oder hartem Zellgewebe, Nukleinmaterial
- Proteingewinnung
- Vorbereitung und Isolation von Enzymen
- Herstellung von Antigenen
- DNA-Extraktion und/ oder gezielte Fragmentierung
- Liposomenherstellung
Der Zellaufschluss mit einem Sonden-Ultraschallgerät ist eine effiziente Methode zur Probenvorbereitung.
Die vielfältigen Anwendungen von Ultraschall reichen in alle Bereiche der Biologie: Biotechnologie, Gentechnik, Mikrobiologie, Molekularbiologie, Biochemie, Immunologie, Bakteriologie, Virologie, Proteomik, Genetik, Physiologie, Zellbiologie, Hämatologie und Botanik.
Lyse: Das Aufbrechen von Zellstrukturen
Zellen weerden von einer semipermeablen Zellmembran umgeben, die aus einer Phospho-Lipid-Doppelschicht (Protein-Lipid-Doppelschicht, die von hydrophoben Lipiden und hydrophilen Phosphor-Molekülen mit eingebetteten Proteinmoleküle gebildet wird) bestehen. Die Zellmembran bildet eine Barriere zwischen dem Zellinneren (Zytoplasma) und der extrazellulären Umwelt. Pflanzenzellen und prokaryotische Zellen sind von einer Zellwand umgeben. Aufgrund ihrer mehrschichtigen, dicken Zellwand aus Zellulose sind Pflanzenzellen schwieriger als tierische Zellen zu lysieren. Das Zellinnere, bestehend aus Organellen, Zellkern, Mitochondrium, wird durch das Zytoskelett stabilisiert.
Ziel der Lyse ist es, die Organellen, Proteine, DNA, mRNA oder andere Biomoleküle zu extrahieren und zu trennen.
Konventionelle Methoden des Zellaufschlusses und ihre Nachteile
Es gibt mehrere Methoden, um Zellen aufzuschließen. Die Methoden des Zellauschlusses können in mechanischen und chemischen Verfahren unterteilt werden, dazu gehören z.B. die Verwendung von Detergenzien oder Lösungsmitteln als chemische Verfahren oder z.B. die Anwendung von hohen Drücken, der Einsatz einer Rührwerkskugelmühle oder einer French Press. Das größte Problem dieser Methoden ist die schwierige Kontrolle und Anpassung der Prozessparameter und dadurch die nur schwierig anzupassende Intensität des Lyse-Vorgangs.
In der nachstehenden Tabelle sind die wichtigsten Nachteile der gängigen Lyseverfahren aufgeführt:
Tabelle: Konventionelle Methoden der Lyse weisen gravierende Nachteile auf
Zellaufschluss - eine Gratwanderung
Die Lyse ist ein empfindliches Verfahren. Während der Lyse wird die schützende Zellmembran zerstört, jedoch müssen eine Inaktivierung, Denaturierung und Degradierung der extrahierten Proteine durch eine unphysiologische Umgebungsbedingungen (Abweichung des pH-Wertes) verhindert werden. Daher wird die Lyse für gewöhnlich in einer Pufferlösung durchgeführt. Die größte Schwierigkeiten ergeben sich aus einem unkontrollierten Zellaufschluss, was eine ungezielte Freisetzung des gesamten intrazellulären Materials oder/ und die Denaturierung des Zielproduktes zur Folge hat.
Häufig gestellte Fragen zu Sonikation und Zelllyse
- Kann man Zellen mit Sonikation lysieren? Ja, bei der Beschallung werden die Zellen mit Hilfe von Hochfrequenz-Ultraschallwellen, die eine Kavitation auslösen, effektiv lysiert. Die daraus resultierenden mechanischen Kräfte zerstören die Zellmembranen und erleichtern die Freisetzung von intrazellulären Bestandteilen in die Flüssigkeit.
- Wie verwendet man einen Sonicator für die Zelllyse? Bei der Verwendung eines Sonicators für die Zelllyse wird die Sonicator-Sonde in eine Zellsuspension getaucht und Parameter wie Amplitude und Impulsdauer eingestellt. Der Prozess sollte genau überwacht werden, um den Zellaufschluss zu optimieren und gleichzeitig die Denaturierung von Proteinen und die Inaktivierung von Enzymen zu minimieren.
- Was ist das Prinzip der Beschallung zur Zelllyse? Die Beschallung funktioniert nach dem Prinzip der akustischen Kavitation. Ultraschallenergie wird in das flüssige Medium übertragen und verursacht rasche Druckschwankungen, die zur Bildung und Implosion von Mikrobläschen führen. Diese Implosionen erzeugen starke Scherkräfte und lokal hohe Temperaturen, die die Zellstrukturen zerstören und die Homogenität des Lysats verbessern.
- Wie lange dauert die Beschallung der Zelllyse? Die Dauer der Beschallung zur Zelllyse kann je nach Faktoren wie Zelltyp, Zelldichte, Leistung des Beschallungsgeräts und spezifischem Protokoll erheblich variieren. Typische Verfahren reichen von einigen Sekunden bis zu einigen Minuten und werden oft in Zyklen durchgeführt, um die Wärmeentwicklung zu steuern und einen gleichmäßigen Zellaufschluss zu gewährleisten.
- Welchen Zweck erfüllt die Sonikation bei der Proteinextraktion? Bei der Proteinextraktion dient die Beschallung dazu, die Zellmembranen effizient zu zerreißen und die Proteine zu solubilisieren. Diese Methode ist besonders nützlich, um Proteine aus zellulären Kompartimenten freizusetzen, was sie für die Vorbereitung von Lysaten, aus denen Proteine gereinigt oder analysiert werden sollen, unerlässlich macht.
- Warum wird die Beschallung zur Extraktion verwendet? Die Beschallung wird für die Extraktion bevorzugt, da sie schnell wirkt und gezielt Energie einsetzt, um Zellstrukturen aufzubrechen und bioaktive Moleküle freizusetzen, ohne dass scharfe chemische Behandlungen erforderlich sind, wodurch die funktionelle Integrität der extrahierten Verbindungen erhalten bleibt.
- Stört die Beschallung Protein-Protein-Wechselwirkungen? Die Beschallung kann zwar Zellmembranen wirksam zerstören, aber auch Protein-Protein-Wechselwirkungen stören. Das Ausmaß der Störung hängt von der Intensität der Beschallung und der Dauer der Einwirkung ab und kann zu einer Denaturierung oder Dissoziation von Proteinkomplexen führen, was sich auf nachfolgende analytische oder funktionelle Untersuchungen auswirken kann.
- Kann man E. coli mit Hilfe von Ultraschall lysieren? Hielscher-Sonicatoren sind besonders effektiv für die Lyse von Bakterienzellen wie E. coli, die robuste Zellwände haben. Die Technik bietet eine physikalische Methode zum Abscheren der Zellwand und der Membran, was sie zu einer bevorzugten Methode zur Herstellung von Bakterienlysaten in molekularbiologischen und biochemischen Labors macht.
- Was sind die Folgeprozesse nach der Beschallung?
Zu den nachgeschalteten Schritten nach der Ultraschalllyse gehören in der Regel die Fraktionierung des Lysats, die gezielte Isolierung von Organellen und die weitere Proteinextraktion oder -aufreinigung.
Das aufbereitete Lysat wird dann getrennt und für analytische oder funktionelle Anwendungen aufbereitet, z. B. für hochauflösende Proteomik, Transkriptomik oder Rezeptorbindungsstudien.
Literatur
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.