Hielscher – Ultraschall-Technologie

Ultraschall-Lyse: Zellaufschluss & Extraktion

Der Zellaufschluss bzw. die Lyse ist eine übliche Tätigkeit der täglichen Probenvorbereitung in Biotech-Labors. Das Ziel der Lyse ist es, Teile der Zellwand oder die komplette Zelle zu zerstören, um biologische Moleküle zu extrahieren. Das sogenannte Lysat besteht z. B. aus Plasmid, Rezeptoren-Assays, Proteinen, DNA, RNA etc. Nachgelagerte Schritte des Zellaufschlusses sind die Fraktionierung, die Isolierung der Organellen oder/und die Proteinextraktion und -aufreinigung. Das extrahierte Material (= Lysat) muss abgetrennt werden und kann dann für weitere Untersuchungen oder Anwendungen, z.B. für die Proteomforschung genutzt werden. Ultraschallhomogenisatoren werden seit langem in Bio-Labors eingesetzt und sind ein zuverlässiges Instrument für den erfolgreichen Zellaufschluss. Da sich die Ultraschallintensität durch die Anpassung der Prozessparameter sehr genau einstellen lässt, kann die notwendige Ultraschallintensität von sehr mild bis sehr hart/ destruktiv individuell für jede Substanz und die Anwendungsanforderung eingestellt werden, um somit das Prozessziel zu erreichen.

Zellstruktur

Zellen weerden von einer semipermeablen Zellmembran umgeben, die aus einer Phospho-Lipid-Doppelschicht (Protein-Lipid-Doppelschicht, die von hydrophoben Lipiden und hydrophilen Phosphor-Molekülen mit eingebetteten Proteinmoleküle gebildet wird) bestehen. Die Zellmembran bildet eine Barriere zwischen dem Zellinneren (Zytoplasma) und der extrazellulären Umwelt. Pflanzenzellen und prokaryotische Zellen sind von einer Zellwand umgeben. Aufgrund ihrer mehrschichtigen, dicken Zellwand aus Zellulose sind Pflanzenzellen schwieriger als tierische Zellen zu lysieren. Das Zellinnere, bestehend aus Organellen, Zellkern, Mitochondrium, wird durch das Zytoskelett stabilisiert.
Ziel der Lyse ist es, die Organellen, Proteine, DNA, mRNA oder andere Biomoleküle zu extrahieren und zu trennen.

Ultraschallhomogenisatoren werden sehr häufig für die Probenvorbereitung von Zellmaterial eingesetzt.

Abb.1: Ultraschall-Zellextraktion: der mikroskopische Querschnitt des apikalen Stengels von Minze (Mentha Piperita) zeigt den Mechanismus während der Ultraschallextraktion von intrazellulärem Material (2000x Vergrößerung) [Quelle: Vilkhu et al. 2011]

Methoden

Es gibt mehrere Methoden, um Zellen aufzuschließen. Die Methoden des Zellauschlusses können in mechanischen und chemischen Verfahren unterteilt werden, dazu gehören z.B. die Verwendung von Detergenzien oder Lösungsmitteln als chemische Verfahren oder z.B. die Anwendung von hohen Drücken, der Einsatz einer Rührwerkskugelmühle oder einer French Press. Das größte Problem dieser Methoden ist die schwierige Kontrolle und Anpassung der Prozessparameter und dadurch die nur schwierig anzupassende Intensität des Lyse-Vorgangs.
Die schwerstwiegenden Nachteile der konventionellen Lyse-Methoden im Überblick:

Verschiedene Lyseverfahren

Tabelle: Konventionelle Methoden der Lyse weisen gravierende Nachteile auf

Im Gegensatz zu den herkömmlichen Lyseverfahren ist die Beschallung ein sehr effizientes und zuverlässiges Werkzeug für den Zellaufschluss, da Ultraschall die vollständige Kontrolle der Prozessparameter ermöglicht. Ultraschall erlaubt eine hohe Selektivität hinsichtlich der Freisetzung des intrazellulären Materials und hohe Produktreinheit. [Balasundaram et al. 2009] Der Ultraschallzellaufschluss ist für alle Zelltypen geeignet und sowohl im kleinen als auch im großen Maßstab problemlos anwendbar. Dabei sind Ultraschallgeräte sind einfach zu reinigen. Hielscher Ultraschalhomogenisatoren verfügt über Clean-in-Place (CIP) und Sterilize-in-Place (SIP) Funktion. Die Sonotrode besteht aus einem massiven Titanhorn, die abgewischt wird oder in Wasser oder Lösungsmittel (abhängig von dem Arbeitsmedium) gespült wird. Die Wartungsmaßnahmen für ein Ultraschallgerät sind aufgrund seiner Robustheit fast vernachlässigbar.

Lyse

Die Lyse ist ein empfindliches Verfahren. Während der Lyse wird die schützende Zellmembran zerstört, jedoch müssen eine Inaktivierung, Denaturierung und Degradierung der extrahierten Proteine durch eine unphysiologische Umgebungsbedingungen (Abweichung des pH-Wertes) verhindert werden. Daher wird die Lyse für gewöhnlich in einer Pufferlösung durchgeführt. Die größte Schwierigkeiten ergeben sich aus einem unkontrollierten Zellaufschluss, was eine ungezielte Freisetzung des gesamten intrazellulären Materials oder/ und die Denaturierung des Zielproduktes zur Folge hat.

Der ultraschall-gestützte Zellaufschluss kann für die Probenvorbereitung im Labor ebenso wie für die Produktion großer Volumina eingesetzt werden. (Zum Vergrößern bitte anklicken!)

Abb.1: 200 Watt leistungsstarker Ultraschallhomogenisator UP200Ht mit digitaler Steuerung und automatische Datenerfassung für zuverlässige und reproduzierbare Lyse und Extraktion.

Ultraschall-Lyse

Der typische Lyse-Vorgang für eine Laborprobe dauert normalerweise zwischen 15 Sekunden und 2 Minuten. Da die Beschallungsintensität sehr einfach über die Ultraschallamplitude sowie durch die Wahl der richtigen Ultraschallausrüstung regeln lässt, ist es möglich, die Zellmembran sehr sanft oder sehr abrupt zu lysieren. Die gewählte Intensität ist von der Zellstruktur und dem Zweck bzw. Ziel der Lyse abhängig (z.B. erfordert die DNA-Extraktion eine milde Sonorisierung, wohingegen für eine vollständige Proteinextraktion aus Bakterien eine intensivere Ultraschallbehandlung notwendig ist). Die Prozesstemperatur kann durch einen integrierten Temperatursensor permanent überwacht werden und ist durch Kühlung (Eisbad oder Reaktor mit Kühlmantel) oder Sonorisierung im Puls-Modus leicht zu regulieren. Während der Beschallung im Puls-Modus ermöglichen kurze Ultraschallzyklen von 1-15 Sekunden eine bessere Wärmeableitung und Abkühlung der Probe während der Unterbrechungsphasen.
Alle Ultraschall-Prozesse sind vollständig reproduzierbar und linear skalierbar.

Ultraschallhomogenisator VialTweeter für die gleichzeitige Probenvorbereitung von bis zu 10 Vials. (Zum Vergrößern anklicken!)

Der Ultraschallprozessor VialTweeter ermöglicht die gleichzeitige Probenvorbereitung von bis zu 10 Testgefäßen unter den gleichen Prozessbedingungen.

Ultraschallhomogenisatoren

Verschiedene Ultraschallgeräte erlauben Sie eine Probenvorbereitung und gewährleisten Bedienerfreundlichkeit und Arbeitskomfort. Ultraschall-Stabschwinger übertragen den Ultraschall über eine Sonotrode und sind die am häufigsten verwendeten Ultraschall-Laborgeräte. Sie eignen sich für die Probenvorberitung von kleinen und mittleren Proben mit Volumina von 0,1 ml bis 1000 ml. Verschiedene Geräteklassen und Sonotrodentypen ermöglichen es, die passende Ultraschallkonfiguration für das jeweilige Probenvolumen und das Probengefäß zu finden und somit eine effektive wie auch effiziente Beschallung zu erreichen. Ein Ultraschallstabschwinger ist das ideale Gerät, wenn einzelne Proben vorbereitet werden müssen.

Wenn mehrere Proben gleichzeitig vorbereitet werden müssen (z.B. 8 Testtubes oder Vials mit einer Zelllösung), sind Ultraschallgeräte wie die VialTweeter oder ein Ultraschall-Cuphorn die geeignetsten Homogenisator für die Lyse und Extraktion. Mehrere Vials können gleichzeitig mit derselben Intensität beschallt werden. Dadurch sparen Sie nicht nur Zeit, sondern sichern auch die gleiche Behandlung aller Proben, wodurch die Probenergebnisse zuverlässig und vergleichbar sind. Darüber hinaus wird die Kreuzkontamination durch das Eintauchen der Ultraschallsonotrode (auch bekannt als Ultraschallsonde, -horn, -spitze oder -finger) vermieden. Da Vials verwendet werden, fallen zeitaufwendige Reinigung und Probenverluste durch Umfüllen weg.
Für größere Mengen - z.B. für die kommerzielle Produktion von Zellextrakten - eignen sich kontinuierliche Ultraschallsysteme mit einem Durchfluss-Reaktor am besten. Eine kontinuierliche und gleichmäßige Fließgeschwindigkeit des zu verarbeitenden Materials sichern eine gleichmäßige Beschallung. Alle Prozessparameter der Ultraschall-Lyse können optimiert und an die Anwendung und das spezifische Zellmaterial angepasst werden.

Exemplarische Verfahren für die Ultraschall-Lyse von Bakterienzellen:

  1. Vorbereitung der Zellsuspension: Die Zellpellets müssen vollständig in einer Pufferlösung durch Homogenisieren gelöst werden (Wählen Sie Ihre Pufferlösung so, dass sie zur darauffolgenden Analysemethode, z.B. einer bestimmte Chromatographie-Methode passt). Fügen Sie je nach Bedarf Lysozyme und/ oder andere Zusatzstoffe hinzu. (Achten Sie auch hier darauf, dass diese mit der Trenn- / Reinigungsmethode kompatibel sind.) Mischen/ homogenisieren Sie die Lösung bei milder Beschallungsintensität bis die Probe komplett gelöst ist.
  2. Ultraschall-Lyse: Plazieren Sie die Probe in einem Eisbad. Nutzen Sie Ihren Ultraschallhomogenisator im Puls-Modus. Für den Zellaufschluss von Bakterien beschallen Sie die Probe mit einer Ultraschall-Pulsdauer von 60-90 Sekunden.
  3. Trennung: Zentrifugieren Sie das Lysat (z.B. 10 min. 10.000 x g; bei 4degC). Trennen Sie sorgfältig den Überstand von dem Zellpellet. Der Überstand enthält das gesamte Zelllysat. Nach dem Filtrieren des Überstands erhalten Sie eine klare Flüssigkeit des löslichen Zellproteins.



Die häufigsten Anwendungen für Ultraschallgeräte in Biologie und Biotechnologie sind:

  • Zellextrakt-Vorbereitung
  • Zellaufschluss von Hefen, Bakterien, Pflanzenzellen, weichem & hartem Zellgewebe, Nukleinsäure
  • Proteingewinnung
  • Vorbereitung und Isolation von Enzymen
  • Herstellung von Antigenen
  • DNA-Extraktion und/ oder gezielte Fragmentierung
  • Liposomenherstellung
Hochleistungs-Ultraschallhomogenisatoren wie der UIP1000hdT werden für den Zeltaufschluss und die Extraktion in Batch und im kontinuierlichen Durchfluss eingesetzt. (Zum Vergrößern anklicken!)

Ultraschall Technikumsanlagen wie z.B. der UIP1000hd (1kW) können größere Mengen von biologischem Material verarbeiten.

Die vielfältigen Anwendungen von Ultraschall reichen in alle Bereiche der Biologie: Biotechnologie, Gentechnik, Mikrobiologie, Molekularbiologie, Biochemie, Immunologie, Bakteriologie, Virologie, Proteomik, Genetik, Physiologie, Zellbiologie, Hämatologie und Botanik.

Für die Erprobung und Optimierung kundenspezifischer Anwendungen bietet Hielscher Ultrasonics ein komplett ausgestattetes Ultraschall-Prozesslabor. Bitte kontaktieren Sie uns für weitere Informationen!

Literatur

  • Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
  • Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.

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