Sonikation für die Zelllyse: Aufschluss und Extraktion von Zellen
Die Zelllyse mit Ultraschall ist ein Verfahren zur Probenvorbereitung in Biotech-Labors. Ziel ist es, Zellwände oder ganze Zellen aufzubrechen, um biologische Moleküle freizusetzen. Die Sonikation wird üblicherweise für die Zelllyse, den Zellaufschluss und die Extraktion verwendet. Der Hauptvorteil von Ultraschallgeräten für die Zelllyse liegt in der präzisen Steuerung von Prozessparametern wie Intensität und Temperatur, die einen sanften, aber effizienten Zellaufschluss und eine Extraktion ermöglichen.
Zellaufschluss mit Ultraschall
Bei der Zelllyse mit Ultraschall werden Hochfrequenz-Schallwellen eingesetzt, um Zellen aufzubrechen und ihren Inhalt zu extrahieren. Die Sonikation ist ein bewährtes und zuverlässiges Verfahren zum Aufbrechen von Zellen und zur Extraktion von intrazellulärem Material wie Plasmiden, Rezeptorassays, Proteinen, DNA und RNA. Durch Anpassung der Prozessparameter kann die Ultraschallintensität fein abgestimmt werden, um den spezifischen Anforderungen der Anwendung gerecht zu werden, von sanfter bis zu intensiver Sonikation. Die auf die Lyse folgenden Schritte umfassen die Fraktionierung, die Isolierung von Organellen sowie die Proteinextraktion und -aufreinigung. Das resultierende Lysat muss für weitere Untersuchungen oder Anwendungen, z. B. in der Proteomforschung, aufgetrennt werden.
Wenn Sie mehr über die Beschallung zur Lyse, zum Zellaufschluss und zur Extraktion erfahren möchten, wenden Sie sich bitte an uns. Unser technisches Team arbeitet gerne mit Ihnen an Ihrem Zelllyseprojekt.
Ultraschallhomogenisatoren UP100H (100 Watt) und UP400St (400 Watt): Sonikation für Zelllyse und Extraktion.
Vorteile der Verwendung von Sonikation für die Zelllyse
Im Vergleich zu anderen Methoden der Lyse und Extraktion hat der Zellaufschluss mit Ultraschall mehrere Vorteile:
- Geschwindigkeit: Die Zelllyse und -extraktion mit Ultraschall ist ein schnelles Verfahren, mit dem Zellen innerhalb von Sekunden aufgebrochen werden können. Dies ist viel schneller als andere Methoden wie Homogenisierung, Gefrier-Auftauen oder Bead-Milling.
- Effizienz: Die ultraschall-gestützte Lyse und Extraktion kann zur Behandlung kleiner, großer oder mehrerer Proben auf einmal verwendet werden, was sie effizienter macht als andere Methoden, mit denen jeweils nur kleine einzelne Proben individuell bearbeitet werden können.
- Chemikalien-frei: Die Zelllyse und -extraktion mit Ultraschall ist eine nicht-invasive Methode, die ohne den Einsatz von aggressiven Chemikalien oder Enzymen auskommt. Dies macht sie ideal für Anwendungen, bei denen die Integrität des Zellinhalts erhalten bleiben muss. Unerwünschte Kontaminationen der Proben können dadurch vermieden werden.
- Hohe Ausbeute: Durch den Zellaufschluss mit Ultraschall kann eine hohe Ausbeute an intrazellulären Substanzen, einschließlich DNA, RNA und Proteinen, gewonnen werden. Dies liegt daran, dass die Hochfrequenz-Schallwellen die Zellwände aufbrechen und die Inhalte in die umgebende Lösung freisetzen.
- Temperaturregelung: Hochentwickelte Ultraschallgeräte ermöglichen eine präzise Temperaturkontrolle der Probe. Die digitalen Ultraschallgeräte von Hielscher sind mit einem steckbaren Temperatursensor und Temperaturüberwachungssoftware ausgestattet.
- Reproduzierbar: Protokolle für den Ultraschall-Zellaufschluss lassen sich leicht reproduzieren und durch ein einfaches lineares Scale-up an verschiedene größere oder kleinere Probenvolumina anpassen.
- Vielseitig: Die Zelllyse und -extraktion mit Ultraschall kann zur Extraktion zahlreicher Zelltypen und Probenvarianten verwendet werden, darunter Bakterien, Hefe, Pilze, Pflanzen- und Säugetierzellen. Es können zuverlässig verschiedene Arten von Molekülen extrahiert werden, z.B. Proteine, DNA, RNA und Lipide.
- Gleichzeitige Vorbereitung einer Vielzahl von Proben: Hielscher Ultrasonics bietet mehrere Lösungen, um zahlreiche Proben unter exakt gleichen Prozessbedingungen komfortabel zu bearbeiten. Dies macht den Probenvorbereitungsschritt der Lyse und Extraktion höchst effizient und zeitsparend.
- Einfach zu bedienen: Ultraschallgeräte für die Zelllyse und -extraktion sind einfach zu bedienen und erfordern nur minimale Schulung. Die Geräte sind zudem wirtschaftlich, da es sich um eine einmalige Investition handelt, die keine Neuanschaffung von Verbrauchsmaterialien erfordert. Das macht den Ultraschallhomogenisator für eine Vielzahl von Forschern und Labors sehr attraktiv.
Insgesamt ist die Zelllyse und -extraktion mit Ultraschall ein schnelles, effizientes, genau kontrollierbares und vielseitiges Verfahren zur Extraktion von Zellinhalten. Ihre Vorteile gegenüber alternativen Methoden machen sie zu einer attraktiven Wahl für ein breites Spektrum von Forschungs- und Industrieanwendungen.
Funktionsprinzip des Zellaufschlusses mit Ultraschall
Bei dem Zellaufschluss und der Extraktion mittels Ultraschall werden Zellen mit Hilfe von Hochfrequenzschallwellen aufgespalten und ihr Inhalt freigesetzt. Die Schallwellen erzeugen Druckänderungen in der umgebenden Flüssigkeit, wodurch sich kleine Blasen bilden und in einem als Kavitation bezeichneten Prozess implodieren. Diese Blasenimplosion erzeugt lokal hochintensive mechanische Kräfte, die Zellen aufbrechen und ihren Inhalt in die umgebende Lösung freisetzen können.
Der Zellaufschluss mit einem Ultraschallstab umfasst in der Regel die folgenden Schritte:
- Die Probe wird in ein Röhrchen oder Becherglas mit einem flüssigen Puffer gegeben.
- Der Ultraschallstab (Sonotrode) wird in die Probe eingeführt, und es werden hochfrequente Schallwellen mit ca. 20-30 kHz eingekoppelt.
- Die Ultraschallwellen verursachen Schwingungen und Kavitation in der umgebenden Flüssigkeit, wodurch lokalisiert hochintensive Kräfte entstehen, welche die Zellen aufbrechen und ihren Inhalt freisetzen.
- Die Probe wird zentrifugiert oder filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und das extrahierte Lysat wird für die anschließende Analyse gesammelt.
Intensive Ultraschallwellen zerstören die Zellmatrix biologischer Strukturen und setzen die bioaktiven Verbindungen frei. Der Stoffaustausch zwischen dem Pflanzenmaterial und dem Lösungsmittel (z. B. Puffer) wird intensiviert. (Grafik: ©Vilkhu et al., 2006)
Nachteile der gängigen Lyseverfahren
Während Ihrer Arbeit in Labors haben Sie vielleicht schon einmal eine der häufigen Probleme mit herkömmlichen mechanischen oder chemischen Lyseprotokollen erlebt.
- Mechanischer Zellaufschluss: Mechanische Lyseverfahren wie das Zerkleinern mit Mörser und Stößel oder das Homogenisieren mit einer French Press, einer Perlmühle oder einem Rotor-Stator-System verfügen oft nicht über präzise Kontroll- und Einstellmöglichkeiten. Das bedeutet, dass beim Mahlen und Zerkleinern schnell Hitze und Scherkräfte entstehen können, die die Probe schädigen und Proteine denaturieren können. Diese Methoden sind zudem häufig zeitaufwendig und erfordern große Mengen an Probenmaterial.
- Chemischer Zellaufschluss: Chemische Lyseverfahren, z. B. auf der Basis von Detergenzien, können die Probe schädigen, indem sie die Lipiddoppelschicht zerstören und Proteine denaturieren. Die chemische Lyse erfordert häufig auch mehrere Durchgänge und hinterlässt Restverunreinigungen, welche nachgelagerte Analyseschritte beeinträchtigen können. Die optimale Dosierung des Detergens zu finden, ist eine zusätzliche Herausforderung.
- Frost-Tau-Zyklen: Gefrier-Tau-Zyklen können bewirken, dass Zellmembranen aufgeschlossen werden. Allerdings können wiederholte Zyklen zur Denaturierung und zur Zersetzung von Proteinen führen. Die Frost-Tau-Methode erfordert meist mehrere Zyklen, was zeitaufwändig ist und oftmals nur geringere Erträge bringt.
- Enzymatische Lyse: Enzymatische Lyseverfahren werden spezifisch für bestimmte Zelltypen entwickelt und erfordern mehrere Schritte, was sie zeitaufwändig macht. Beim enzymatischen Zellaufschluss fällen Abfallprodukte an. Der Prozess der enzymatischen Lyse muss sorgfältig optimiert werden, um eine Denaturierung der Probe zu vermeiden. Enzymatische Lyse-Kits sind oft teuer. Wenn Ihr derzeitiges enzymatisches Lyseverfahren unzureichende Ergebnisse liefert, kann die Beschallung als synergistische Methode eingesetzt werden, um den Zellaufschluss zu intensivieren.
Im Gegensatz zu herkömmlichen mechanischen und chemischen Zelllyseverfahren ist die Beschallung ein sehr effizientes und zuverlässiges Werkzeug für den Zellaufschluss, das eine vollständige Kontrolle über die Beschallungsparameter ermöglicht. Dies gewährleistet eine hohe Selektivität bei der Materialfreisetzung und Produktreinheit. (vgl. Balasundaram et al., 2009)
Der ultraschall-gestützte Zellaufschluss ist für alle Zelltypen geeignet und lässt sich leicht in kleinem und großem Maßstab anwenden. – immer unter kontrollierten Bedingungen. Ultraschallhomogenisatoren sind leicht zu reinigen. Ein Ultraschall-Stabhomogenisator verfügt immer über eine Clean-in-Place (CIP)- und Sterilize-in-Place (SIP)-Funktion. Die Sonotrode besteht aus einem massiven Titanhorn, das mit Ethanol abgewischt oder in Wasser oder Lösungsmittel (je nach Arbeitsmedium) gespült werden kann. Die Wartung von Ultraschallgeräten ist aufgrund ihrer Robustheit nahezu vernachlässigbar.
Ultraschall-gestützte Lyse und Zellaufschluss
Der typische Lyse-Vorgang für eine Laborprobe dauert normalerweise zwischen 15 Sekunden und 2 Minuten. Da die Beschallungsintensität sehr einfach über die Ultraschallamplitude sowie durch die Wahl der richtigen Ultraschallausrüstung regeln lässt, ist es möglich, die Zellmembran sehr sanft oder sehr abrupt zu lysieren. Die gewählte Intensität ist von der Zellstruktur und dem Zweck bzw. Ziel der Lyse abhängig (z.B. erfordert die DNA-Extraktion eine milde Sonorisierung, wohingegen für eine vollständige Proteinextraktion aus Bakterien eine intensivere Ultraschallbehandlung notwendig ist). Die Prozesstemperatur kann durch einen integrierten Temperatursensor permanent überwacht werden und ist durch Kühlung (Eisbad oder Reaktor mit Kühlmantel) oder Sonorisierung im Puls-Modus leicht zu regulieren. Während der Beschallung im Puls-Modus ermöglichen kurze Ultraschallzyklen von 1-15 Sekunden eine bessere Wärmeableitung und Abkühlung der Probe während der Unterbrechungsphasen.
Alle Ultraschall-Prozesse sind vollständig reproduzierbar und linear skalierbar.
Der VialTweeter ist ein Ultraschall-Homogenisator für die gleichzeitige, gleichmäßige und schnelle sterile Aufbereitung zahlreicher Proben.
Ultraschallhomogenisatoren für Zell-Lyse und Extraktion
Verschiedene Varianten des Ultraschallhomogenisators ermöglichen eine ideale Anpassung die Probenvorbereitung und gewährleisten Benutzerfreundlichkeit und Bedienungskomfort. Ultraschallstabschwinger sind die im Labor am häufigsten verwendeten Geräte. Sie eignen sich am besten für die Vorbereitung kleiner und mittelgroßer Proben mit Volumina von 0,1 ml bis zu 1000 ml. Verschiedene Leistungsklassen sowie Sonotroden ermöglichen die Anpassung des Ultraschallgeräts an das Probenvolumen und den Reaktor, um möglichst effektive und effiziente Beschallungsergebnisse zu erzielen. Der Ultraschallstabschwinger ist das ideale Gerät, wenn einzelne Proben vorbereitet werden müssen.
Wenn mehrere Proben gleichzeitig vorbereitet werden müssen, z.B. 8-10 Vials mit einer Zellsuspension, ist eine intensive indirekte Beschallung mit Ultraschallsystemen wie dem VialTweeter oder einem Ultraschall-Cuphorn die effizienteste Homogenisierungsmethode der Lyse. Dabei werden mehrere Vials gleichzeitig und mit gleicher Intensität beschallt. Dies spart nicht nur Zeit, sondern gewährleistet auch die gleiche Behandlung aller Proben, was die Ergebnisse zwischen den Proben zuverlässig und vergleichbar macht. Außerdem wird bei der indirekten Beschallung eine Kreuzkontamination durch Eintauchen der Ultraschallsonotrode (auch Ultraschallsonde, -horn, -spitze oder -finger genannt) vermieden. Da individuelle auf die Probengröße abgestimmte Vials verwendet werden, entfallen zeitaufwändiges Abmessen von Probenvolumina und Probenverluste durch Umfüllen von Gefäßen. Für die gleichmäßige Beschallung von Multiwell- bzw. Mikrotiterplatten bietet Hielscher den UIP400MTP an.
Für größere Mengen - z.B. für die kommerzielle Produktion von Zellextrakten - eignen sich kontinuierliche Ultraschallsysteme mit einem Durchfluss-Reaktor am besten. Eine kontinuierliche und gleichmäßige Fließgeschwindigkeit des zu verarbeitenden Materials sichern eine gleichmäßige Beschallung. Alle Prozessparameter der Ultraschall-Lyse können optimiert und an die Anwendung und das spezifische Zellmaterial angepasst werden.
Exemplarische Verfahren für die Ultraschall-Lyse von Bakterienzellen:
- Vorbereitung der Zellsuspension: Die Zellpellets müssen vollständig in einer Pufferlösung durch Homogenisieren gelöst werden (Wählen Sie Ihre Pufferlösung so, dass sie zur darauffolgenden Analysemethode, z.B. einer bestimmte Chromatographie-Methode passt). Fügen Sie je nach Bedarf Lysozyme und/ oder andere Zusatzstoffe hinzu. (Achten Sie auch hier darauf, dass diese mit der Trenn- / Reinigungsmethode kompatibel sind.) Mischen/ homogenisieren Sie die Lösung bei milder Beschallungsintensität bis die Probe komplett gelöst ist.
- Ultraschall-Lyse: Legen Sie die Probe in ein Eisbad. Um die Zellen aufzubrechen, beschallen Sie die Suspension in 60-90 Sekunden langen Stößen (verwenden Sie den Impulsmodus Ihres Ultraschallgeräts).
- Trennung: Zentrifugieren Sie das Lysat (z.B. 10 min. 10.000 x g; bei 4degC). Trennen Sie sorgfältig den Überstand von dem Zellpellet. Der Überstand enthält das gesamte Zelllysat. Nach dem Filtrieren des Überstands erhalten Sie eine klare Flüssigkeit des löslichen Zellproteins.
Die häufigsten Anwendungen für Ultraschallgeräte in Biologie und Biotechnologie sind:
- Zellextrakt-Vorbereitung
- Zellaufschluss von Hefe, Bakterien, Pflanzenzellen, weichem oder hartem Zellgewebe, Nukleinmaterial
- Proteingewinnung
- Vorbereitung und Isolation von Enzymen
- Herstellung von Antigenen
- DNA-Extraktion und/ oder gezielte Fragmentierung
- Liposomenherstellung
Der Zellaufschluss mit einem Sonden-Ultraschallgerät ist eine effiziente Methode zur Probenvorbereitung.
Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über unsere Ultraschallgeräte für Zellaufschluss und Extraktion. Klicken Sie auf den Gerätetyp, um weitere Informationen zu den einzelnen Ultraschallhomogenisatoren zu erhalten. Unser gut ausgebildetes und langjährig erfahrenes technisches Personal hilft Ihnen gerne bei der Auswahl des für Ihre Proben am besten geeigneten Ultraschallgerätes!
| Batch-Volumen | Durchfluss | Empfohlenes Ultraschallgerät |
|---|---|---|
| bis zu 10 Vials bzw. Röhrchen | n.a. | VialTweeter |
| Multiwell-/Mikrotiterplatten | n.a. | UIP400MTP |
| mehrere Vials/Gefäße | n.a. | CupHorn |
| 1 bis 500ml | 10 bis 200ml/min | UP100H |
| 10 bis 1000mL | 20 bis 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 bis 2000ml | 20 bis 400ml/min | UP400St |
Die vielfältigen Anwendungen von Ultraschall reichen in alle Bereiche der Biologie: Biotechnologie, Gentechnik, Mikrobiologie, Molekularbiologie, Biochemie, Immunologie, Bakteriologie, Virologie, Proteomik, Genetik, Physiologie, Zellbiologie, Hämatologie und Botanik.
Lyse: Das Aufbrechen von Zellstrukturen
Zellen weerden von einer semipermeablen Zellmembran umgeben, die aus einer Phospho-Lipid-Doppelschicht (Protein-Lipid-Doppelschicht, die von hydrophoben Lipiden und hydrophilen Phosphor-Molekülen mit eingebetteten Proteinmoleküle gebildet wird) bestehen. Die Zellmembran bildet eine Barriere zwischen dem Zellinneren (Zytoplasma) und der extrazellulären Umwelt. Pflanzenzellen und prokaryotische Zellen sind von einer Zellwand umgeben. Aufgrund ihrer mehrschichtigen, dicken Zellwand aus Zellulose sind Pflanzenzellen schwieriger als tierische Zellen zu lysieren. Das Zellinnere, bestehend aus Organellen, Zellkern, Mitochondrium, wird durch das Zytoskelett stabilisiert.
Ziel der Lyse ist es, die Organellen, Proteine, DNA, mRNA oder andere Biomoleküle zu extrahieren und zu trennen.
Konventionelle Methoden des Zellaufschlusses und ihre Nachteile
Es gibt mehrere Methoden, um Zellen aufzuschließen. Die Methoden des Zellauschlusses können in mechanischen und chemischen Verfahren unterteilt werden, dazu gehören z.B. die Verwendung von Detergenzien oder Lösungsmitteln als chemische Verfahren oder z.B. die Anwendung von hohen Drücken, der Einsatz einer Rührwerkskugelmühle oder einer French Press. Das größte Problem dieser Methoden ist die schwierige Kontrolle und Anpassung der Prozessparameter und dadurch die nur schwierig anzupassende Intensität des Lyse-Vorgangs.
In der nachstehenden Tabelle sind die wichtigsten Nachteile der gängigen Lyseverfahren aufgeführt:
Tabelle: Konventionelle Methoden der Lyse weisen gravierende Nachteile auf
Zellaufschluss - eine Gratwanderung
Die Lyse ist ein empfindliches Verfahren. Während der Lyse wird die schützende Zellmembran zerstört, jedoch müssen eine Inaktivierung, Denaturierung und Degradierung der extrahierten Proteine durch eine unphysiologische Umgebungsbedingungen (Abweichung des pH-Wertes) verhindert werden. Daher wird die Lyse für gewöhnlich in einer Pufferlösung durchgeführt. Die größte Schwierigkeiten ergeben sich aus einem unkontrollierten Zellaufschluss, was eine ungezielte Freisetzung des gesamten intrazellulären Materials oder/ und die Denaturierung des Zielproduktes zur Folge hat.
Häufig gestellte Fragen zu Sonikation und Zelllyse
- Kann man Zellen mit Sonikation lysieren? Ja, bei der Beschallung werden die Zellen mit Hilfe von Hochfrequenz-Ultraschallwellen, die eine Kavitation auslösen, effektiv lysiert. Die daraus resultierenden mechanischen Kräfte zerstören die Zellmembranen und erleichtern die Freisetzung von intrazellulären Bestandteilen in die Flüssigkeit.
- Wie verwendet man einen Sonicator für die Zelllyse? Bei der Verwendung eines Sonicators für die Zelllyse wird die Sonicator-Sonde in eine Zellsuspension getaucht und Parameter wie Amplitude und Impulsdauer eingestellt. Der Prozess sollte genau überwacht werden, um den Zellaufschluss zu optimieren und gleichzeitig die Denaturierung von Proteinen und die Inaktivierung von Enzymen zu minimieren.
- Was ist das Prinzip der Beschallung zur Zelllyse? Die Beschallung funktioniert nach dem Prinzip der akustischen Kavitation. Ultraschallenergie wird in das flüssige Medium übertragen und verursacht rasche Druckschwankungen, die zur Bildung und Implosion von Mikrobläschen führen. Diese Implosionen erzeugen starke Scherkräfte und lokal hohe Temperaturen, die die Zellstrukturen zerstören und die Homogenität des Lysats verbessern.
- Wie lange dauert die Beschallung der Zelllyse? Die Dauer der Beschallung zur Zelllyse kann je nach Faktoren wie Zelltyp, Zelldichte, Leistung des Beschallungsgeräts und spezifischem Protokoll erheblich variieren. Typische Verfahren reichen von einigen Sekunden bis zu einigen Minuten und werden häufig in Zyklen durchgeführt, um die Wärmeentwicklung zu steuern und einen gleichmäßigen Zellaufschluss zu gewährleisten.
- Welchen Zweck erfüllt die Beschallung bei der Proteinextraktion? Bei der Proteinextraktion dient die Beschallung dazu, die Zellmembranen effizient zu zerreißen und die Proteine zu solubilisieren. Diese Methode ist besonders nützlich, um Proteine aus zellulären Kompartimenten freizusetzen, was sie für die Vorbereitung von Lysaten, aus denen Proteine gereinigt oder analysiert werden sollen, unerlässlich macht.
- Warum wird die Beschallung zur Extraktion verwendet? Die Sonikation wird für die Extraktion bevorzugt, da sie schnell wirkt und gezielt Energie einsetzt, die Zellstrukturen aufbricht, um bioaktive Moleküle freizusetzen, ohne dass scharfe chemische Behandlungen zum Einsatz kommen, wodurch die funktionelle Integrität der extrahierten Verbindungen erhalten bleibt.
- Stört die Beschallung Protein-Protein-Wechselwirkungen? Die Beschallung kann zwar Zellmembranen wirksam zerstören, aber auch Protein-Protein-Wechselwirkungen stören. Das Ausmaß der Störung hängt von der Intensität der Beschallung und der Dauer der Einwirkung ab und kann zu einer Denaturierung oder Dissoziation von Proteinkomplexen führen, was sich auf nachfolgende analytische oder funktionelle Untersuchungen auswirken kann.
- Kann man E. coli mit Hilfe von Ultraschall lysieren? Hielscher-Sonicatoren sind besonders effektiv für die Lyse von Bakterienzellen wie E. coli, die robuste Zellwände haben. Die Technik bietet eine physikalische Methode zum Abscheren der Zellwand und der Membran, was sie zu einer bevorzugten Methode zur Herstellung von Bakterienlysaten in molekularbiologischen und biochemischen Labors macht.
Literatur
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