Ultraschall zur Zelllyse: Zellaufschluss und Extraktion
Die ultraschallgestützte Zelllyse ist ein weit verbreitetes Verfahren zur Probenvorbereitung in modernen biotechnologischen Laboren. Ihr Hauptzweck besteht darin, Zellmembranen oder ganze Zellen aufzuschließen, um intrazelluläre Bestandteile wie Proteine, Nukleinsäuren oder Organellen freizusetzen. Im Laboralltag ist die Beschallung somit eine Standardmethode für den kontrollierten Zellaufschluss und die effiziente Extraktion von Biomolekülen. Der entscheidende Vorteil von Ultraschallgeräten liegt darin, dass sich kritische Prozessparameter wie Ultraschallintensität, Pulsbetrieb und Temperaturregelung präzise anpassen lassen. Diese Kontrolle ermöglicht es Forschenden, eine zuverlässige Lyse zu erzielen und zugleich thermische oder mechanische Schäden an empfindlichen Biomolekülen zu minimieren. Das Ergebnis ist ein schonendes und dennoch hocheffizientes Extraktionsverfahren.
Zelllyse mit Ultraschallgeräten
Die ultraschallgestützte Zelllyse nutzt akustische Kavitation, um Zellmembranen aufzuschließen und intrazelluläre Moleküle freizusetzen. Hielscher Ultrasonics bietet sowohl klassische Ultraschallgeräte mit Sonotrode als auch Ultraschallgeräte für die sterile Verarbeitung mehrerer Proben an: den VialTweeter für mehrere Röhrchen und Vials sowie das Ultraschallgerät UIP400MTP für 96-Well-Platten zur Behandlung von Standard-Mikroplatten.
Hielscher Ultrasonics liefert leistungsstarke Ultraschallgeräte zur kontaktfreien Probenvorbereitung und klinischen Analytik. Das Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten, der VialTweeter, der CupHorn und das Durchfluss-Ultraschallgerät GDmini2 behandeln die Proben unter sterilen Bedingungen.
Ultraschallhomogenisatoren UP100H (100 Watt) und UP400St (400 Watt): Beschallung zur Zelllyse und Extraktion.
Ultraschallhomogenisatoren zur Zelllyse und Extraktion
| Ultraschallgerätetyp | Anwendungsschwerpunkt | Probenvolumen | Typischer Anwendungsfall | Vorteile | Beispielmodelle |
|---|---|---|---|---|---|
| Ultraschallgeräte mit Sonotrode | Beschallung einzelner Proben | 0,1 mL bis ~1000 mL | Zelllyse, Proteinextraktion, DNA-/RNA-Fragmentierung | Präzise Energiekontrolle; verschiedene Sonotroden; optimal für kleine bis mittlere Probenvolumina | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Parallele Verarbeitung mehrerer verschlossener Vials | 8–10 Vials (jeweils ~1–20 mL) | Standardisierte Lyse mehrerer Zellsuspensionen | Gleichmäßige Beschallung; vermeidet Kreuzkontamination; reproduzierbare Ergebnisse | VialTweeter, CupHorn |
| Ultraschallgerät für 96-Well-Platten | Beschallung von Multiwell- und Mikrotiterplatten | Mikroplattenformat | Hochdurchsatz-Screening, Proteomik, Zellassays | Gleichzeitige, gleichmäßige Beschallung aller Wells; ideal für Arbeitsabläufe mit mehreren Proben | UIP400MTP |
| Durchflusszellenreaktoren | Kontinuierliche Beschallung größerer Volumina | Mehr als 1 L, skalierbar | Zellaufschluss im industriellen Maßstab, Extraktherstellung | Kontinuierliche Verarbeitung; skalierbar; vollständige Prozesskontrolle (Amplitude, Druck, Temperatur) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + Durchflusszelle |
| Systeme zur sterilen / indirekten Beschallung | Kontaminationsfreie Probenverarbeitung | Abhängig von Vial, Röhrchen oder Mikroplatte | Empfindliche Proben, sterile Umgebungen, regulierte Bereiche | Kein Kontakt mit der Sonotrode; vermeidet Verschleppungen; minimaler Reinigungsaufwand | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Vorteile der Beschallung zur Zelllyse
Im Vergleich zu anderen Zelllyse- und Extraktionsverfahren bietet die ultraschallgestützte Zelllyse mehrere Vorteile:
- Geschwindigkeit: Die ultraschallgestützte Zelllyse und Extraktion ist ein schnelles Verfahren, mit dem Zellen innerhalb von Sekunden aufgeschlossen werden können. Dies ist wesentlich schneller als andere Methoden wie Homogenisierung, Einfrieren und Auftauen oder der Aufschluss mit einer Perlmühle.
- Effizienz: Mit der ultraschallgestützten Zelllyse und Extraktion lassen sich kleine, große oder mehrere Proben gleichzeitig behandeln. Dadurch ist sie effizienter als andere Verfahren, bei denen kleine Proben einzeln verarbeitet werden müssen.
- Chemikalienfrei: Die ultraschallgestützte Zelllyse und Extraktion ist ein nichtinvasives Verfahren, das ohne aggressive Chemikalien oder Enzyme auskommt. Damit eignet es sich ideal für Anwendungen, bei denen die Integrität der Zellinhalte erhalten bleiben muss. Unerwünschte Verunreinigungen der Proben lassen sich vermeiden.
- Hohe Ausbeute: Die ultraschallgestützte Zelllyse und Extraktion ermöglicht eine hohe Ausbeute an Zellinhalten, darunter DNA, RNA und Proteine. Dies liegt daran, dass die hochfrequenten Schallwellen die Zellwände aufbrechen und die Inhalte in die umgebende Lösung freisetzen.
- Temperaturregelung: Moderne Ultraschallgeräte ermöglichen eine präzise Regelung der Probentemperatur. Digitale Ultraschallgeräte von Hielscher sind mit einem anschließbaren Temperatursensor und einer Software zur Temperaturüberwachung ausgestattet.
- Reproduzierbar: Protokolle für die ultraschallgestützte Zelllyse lassen sich leicht reproduzieren und durch eine einfache lineare Skalierung sogar an unterschiedliche größere oder kleinere Probenvolumina anpassen.
- Vielseitig: Die ultraschallgestützte Zelllyse und Extraktion lässt sich zur Extraktion von Inhaltsstoffen aus zahlreichen Zelltypen einsetzen, darunter Bakterien, Hefen, Pilze sowie Pflanzen- und Säugetierzellen. Sie eignet sich auch zur Extraktion verschiedener Molekülarten, darunter Proteine, DNA, RNA und Lipide.
- Gleichzeitige Vorbereitung zahlreicher Proben: Hielscher Ultrasonics bietet mehrere Lösungen, um zahlreiche Proben bequem unter exakt denselben Prozessbedingungen zu verarbeiten. Dadurch wird der Probenvorbereitungsschritt der Lyse und Extraktion hocheffizient und zeitsparend.
- Einfache Bedienung: Geräte zur ultraschallgestützten Zelllyse und Extraktion sind einfach zu bedienen und erfordern nur eine minimale Einarbeitung. Die Geräte sind zudem wirtschaftlich, da es sich um eine einmalige Investition handelt und keine Einwegmaterialien nachgekauft werden müssen. Das macht sie für zahlreiche Forschende und Labore attraktiv.
Insgesamt ist die ultraschallgestützte Zelllyse und Extraktion ein schnelles, effizientes, präzise kontrollierbares und vielseitiges Verfahren zur Gewinnung von Zellinhalten. Ihre Vorteile gegenüber alternativen Methoden machen sie zu einer attraktiven Wahl für zahlreiche Anwendungen in Forschung und Industrie.
Funktionsprinzip der ultraschallgestützten Zelllyse
Die ultraschallgestützte Zelllyse und Extraktion nutzt hochfrequente Schallwellen, um Zellen aufzuschließen und ihre Inhalte zu extrahieren. Die Schallwellen erzeugen Druckänderungen in der umgebenden Flüssigkeit. Dadurch bilden sich kleine Blasen, die wieder kollabieren. Dieser Vorgang wird als Kavitation bezeichnet. Diese Blasen erzeugen lokal sehr starke mechanische Kräfte, die Zellen aufbrechen und ihre Inhalte in die umgebende Lösung freisetzen können.
Die Zelllyse mit einem Ultraschallgerät umfasst üblicherweise die folgenden Schritte:
- Die Probe wird in ein Röhrchen oder einen Behälter mit einer flüssigen Pufferlösung gegeben.
- Eine Sonotrode wird in die Probe eingetaucht, und hochfrequente Schallwellen mit etwa 20–30 kHz werden eingeleitet.
- Die Ultraschallwellen verursachen Schwingungen und Kavitation in der umgebenden Flüssigkeit. Dabei entstehen lokale Kräfte, die Zellen aufbrechen und ihre Inhalte freisetzen.
- Die Probe wird zentrifugiert oder filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die extrahierten Inhalte werden für die anschließende Analyse gesammelt.
Nachteile gängiger Lyseverfahren
Bei Ihrer Arbeit im Labor haben Sie möglicherweise bereits erlebt, wie aufwendig die Zelllyse mit herkömmlichen mechanischen oder chemischen Lyseprotokollen sein kann.
- Mechanische Lyse: Mechanische Lyseverfahren wie das Zerreiben mit Mörser und Pistill oder die Homogenisierung mit einer French Press, einer Perlmühle oder einem Rotor-Stator-System bieten häufig keine präzisen Kontroll- und Einstellmöglichkeiten. Beim Mahlen und Zerreiben können daher schnell Wärme und Scherkräfte entstehen, die die Probe schädigen und Proteine denaturieren können. Diese Verfahren können außerdem zeitaufwendig sein und große Mengen an Ausgangsmaterial erfordern.
- Chemische Lyse: Chemische Lyseverfahren, etwa die Lyse mit Detergenzien, können die Probe schädigen, indem sie die Lipiddoppelschicht zerstören und Proteine denaturieren. Sie können außerdem mehrere Schritte erfordern und Verunreinigungen hinterlassen, die nachfolgende Anwendungen beeinträchtigen. Die optimale Dosierung des Detergens zu finden, ist eine zusätzliche Herausforderung.
- Einfrier-Auftau-Zyklen: Einfrier-Auftau-Zyklen können Zellmembranen zum Aufreißen bringen. Wiederholte Zyklen können jedoch auch zur Denaturierung und zum Abbau von Proteinen führen. Dieses Verfahren kann zudem mehrere Zyklen erfordern, was zeitaufwendig sein kann und häufig zu geringeren Ausbeuten führt.
- Enzymatische Lyse: Enzymatische Lyseverfahren können auf bestimmte Zelltypen beschränkt sein und mehrere Schritte erfordern, was sie zeitaufwendig macht. Außerdem erzeugen sie Abfall und müssen sorgfältig optimiert werden, um einen Abbau der Probe zu vermeiden. Kits für die enzymatische Lyse sind häufig teuer. Wenn Ihr derzeitiges enzymatisches Lyseverfahren unzureichende Ergebnisse liefert, kann die Beschallung als synergistisches Verfahren eingesetzt werden, um den Zellaufschluss zu intensivieren.
Im Gegensatz zu herkömmlichen mechanischen und chemischen Zelllyseverfahren ist die Beschallung ein sehr effizientes und zuverlässiges Verfahren zum Zellaufschluss, das eine vollständige Kontrolle der Beschallungsparameter ermöglicht. Dies gewährleistet eine hohe Selektivität bei der Stofffreisetzung und eine hohe Produktreinheit. [vgl. Balasundaram et al., 2009]
Sie eignet sich für alle Zelltypen und lässt sich sowohl im kleinen als auch im großen Maßstab problemlos anwenden – stets unter kontrollierten Bedingungen. Ultraschallgeräte sind leicht zu reinigen. Ein Ultraschallhomogenisator verfügt stets über eine Clean-in-Place (CIP)- und Sterilize-in-Place (SIP)-Funktion. Die Sonotrode besteht aus einem massiven Titanhorn, das abgewischt oder mit Wasser beziehungsweise einem Lösungsmittel gespült werden kann (abhängig vom Arbeitsmedium). Aufgrund ihrer Robustheit ist der Wartungsaufwand für Ultraschallgeräte nahezu vernachlässigbar.
Ultraschallgestützte Lyse und Zellaufschluss
Im Allgemeinen dauert die Lyse von Proben im Labor zwischen 15 Sekunden und 2 Minuten. Da sich die Beschallungsintensität durch die Einstellung der Amplitude und der Beschallungsdauer sowie durch die Wahl des richtigen Geräts sehr einfach anpassen lässt, können Zellmembranen je nach Zellstruktur und Zweck der Lyse sehr schonend oder sehr abrupt aufgeschlossen werden (z.B. erfordert die DNA-Extraktion eine schonendere Beschallung, während die vollständige Proteinextraktion aus Bakterien eine intensivere Ultraschallbehandlung erfordert). Die Temperatur während des Prozesses lässt sich mit einem integrierten Temperatursensor überwachen und durch Kühlung (Eisbad oder Durchflusszellen mit Kühlmantel) oder durch Beschallung im Pulsbetrieb einfach regeln. Bei der Beschallung im Pulsbetrieb ermöglichen kurze Beschallungsimpulse von 1–15 Sekunden Dauer eine Wärmeabfuhr und Abkühlung während der längeren Pausen dazwischen.
Alle ultraschallgestützten Prozesse sind vollständig reproduzierbar und linear skalierbar.
Der VialTweeter ist ein Ultraschallhomogenisator zur gleichzeitigen, gleichmäßigen und schnellen sterilen Vorbereitung zahlreicher Proben.
- Vorbereitung der Zellsuspension: Zellpellets müssen durch Homogenisieren vollständig in einer Pufferlösung suspendiert werden (wählen Sie eine Pufferlösung, die mit der anschließenden Analyse kompatibel ist, z.B. mit einer bestimmten Chromatographiemethode). Geben Sie bei Bedarf Lysozyme und/oder andere Zusätze hinzu (auch diese müssen mit den Trenn- und Reinigungsverfahren kompatibel sein). Mischen beziehungsweise homogenisieren Sie die Lösung schonend unter milder Beschallung, bis eine vollständige Suspendierung erreicht ist.
Erfahren Sie mehr über die Synergien von Lysozymen in Kombination mit Beschallung! - Ultraschallgestützte Lyse: Stellen Sie die Probe in ein Eisbad. Beschallen Sie die Suspension zum Zellaufschluss in Impulsen von 60–90 Sekunden (im Pulsbetrieb Ihres Ultraschallgeräts).
- Trennung: Zentrifugieren Sie das Lysat (z.B. 10 min. bei 10.000 x g; bei 4degC). Trennen Sie den Überstand vorsichtig vom Zellpellet. Der Überstand ist das Gesamtzelllysat. Nach der Filtration des Überstands erhalten Sie eine geklärte Flüssigkeit mit den löslichen Zellproteinen.
Die häufigsten Anwendungen von Ultraschallgeräten in der Biologie und Biotechnologie sind:
- Herstellung von Zellextrakten
- Aufschluss von Hefen, Bakterien, Pflanzenzellen, weichem oder hartem Zellgewebe und Zellkernmaterial
- Proteinextraktion
- Gewinnung und Isolierung von Enzymen
- Herstellung von Antigenen
- DNA-Extraktion und/oder gezielte Fragmentierung
- Herstellung von Liposomen
Der Zellaufschluss mit einem Ultraschallgerät mit Sonotrode ist ein effizientes Verfahren zur Probenvorbereitung.
Die vielfältigen Anwendungen von Ultraschall erstrecken sich auf die Bereiche Biotechnologie, Bioengineering, Mikrobiologie, Molekularbiologie, Biochemie, Immunologie, Bakteriologie, Virologie, Proteomik, Genetik, Physiologie, Zellbiologie, Hämatologie und Botanik.
Lyse: Aufbrechen von Zellstrukturen
Zellen werden durch eine semipermeable Plasmamembran geschützt, die aus einer Phospholipid-Doppelschicht besteht (auch Protein-Lipid-Doppelschicht; gebildet aus hydrophoben Lipiden und hydrophilen Phosphormolekülen mit eingelagerten Proteinmolekülen). Sie bildet eine Barriere zwischen dem Zellinneren (Zytoplasma) und der extrazellulären Umgebung. Pflanzenzellen und prokaryotische Zellen sind von einer Zellwand umgeben. Aufgrund ihrer mehrschichtigen Zellwand aus Zellulose lassen sich Pflanzenzellen schwerer lysieren als tierische Zellen. Die Bestandteile im Zellinneren wie Organellen, Zellkern und Mitochondrien werden durch das Zytoskelett stabilisiert.
Die Zelllyse dient dazu, Organellen, Proteine, DNA, mRNA oder andere Biomoleküle zu extrahieren und abzutrennen.
Herkömmliche Zelllyseverfahren und ihre Nachteile
Es gibt verschiedene Verfahren zur Zelllyse, die sich in mechanische und chemische Methoden unterteilen lassen. Dazu gehören der Einsatz von Detergenzien oder Lösungsmitteln, die Anwendung von Hochdruck sowie der Einsatz einer Perlmühle oder einer French Press. Der problematischste Nachteil dieser Verfahren ist die schwierige Kontrolle und Einstellung der Prozessparameter und damit ihrer Wirkung.
Die folgende Tabelle zeigt die wesentlichen Nachteile gängiger Lyseverfahren:
Tabelle: Herkömmliche Zelllyseverfahren haben erhebliche Nachteile
Ablauf der Lyse
Die Lyse ist ein empfindlicher Prozess. Während der Lyse wird die Schutzfunktion der Zellmembran zerstört. Eine Inaktivierung, Denaturierung und ein Abbau der extrahierten Proteine durch eine unphysiologische Umgebung (Abweichung vom pH-Wert) müssen jedoch verhindert werden. Daher wird die Lyse im Allgemeinen in einer Pufferlösung durchgeführt. Die meisten Schwierigkeiten entstehen durch einen unkontrollierten Zellaufschluss, der zu einer ungezielten Freisetzung des gesamten intrazellulären Materials und/oder zur Denaturierung des Zielprodukts führt.
Häufig gestellte Fragen zur Beschallung und Zelllyse
- Kann man Zellen durch Beschallung lysieren? Ja, durch Beschallung lassen sich Zellen mithilfe hochfrequenter Ultraschallwellen wirksam lysieren. Diese erzeugen Kavitation, ein Phänomen, bei dem sich winzige Dampfblasen innerhalb der Zellsuspension bilden und heftig kollabieren. Die dabei entstehenden mechanischen Kräfte brechen Zellmembranen auf und erleichtern die Freisetzung intrazellulärer Bestandteile in die Flüssigkeit.
- Wie verwendet man ein Ultraschallgerät zur Zelllyse? Bei der Verwendung eines Ultraschallgeräts zur Zelllyse wird die Sonotrode in eine Zellsuspension eingetaucht, und Parameter wie Amplitude und Pulsdauer werden eingestellt. Der Prozess sollte engmaschig überwacht werden, um den Zellaufschluss zu optimieren und gleichzeitig die Denaturierung von Proteinen sowie die Inaktivierung von Enzymen zu minimieren.
- Auf welchem Prinzip beruht die Beschallung zur Zelllyse? Die Beschallung beruht auf dem Prinzip der akustischen Kavitation. Ultraschallenergie wird in das flüssige Medium übertragen und verursacht schnelle Druckschwankungen, die zur Bildung und Implosion von Mikroblasen führen. Diese Implosionen erzeugen starke Scherkräfte und lokal hohe Temperaturen, wodurch Zellstrukturen aufgebrochen werden und die Homogenität des Lysats verbessert wird.
- Wie lange dauert die Beschallung zur Zelllyse? Die Dauer der Beschallung zur Zelllyse kann je nach Zelltyp, Zelldichte, Leistung des Ultraschallgeräts und verwendetem Protokoll erheblich variieren. Typische Verfahren dauern einige Sekunden bis wenige Minuten und werden häufig in Zyklen durchgeführt, um die Wärmeentwicklung zu kontrollieren und einen gleichmäßigen Zellaufschluss sicherzustellen.
- Welchen Zweck hat die Beschallung bei der Proteinextraktion? Bei der Proteinextraktion dient die Beschallung dazu, Zellmembranen effizient aufzubrechen und Proteine zu solubilisieren. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, um Proteine aus Zellkompartimenten freizusetzen. Daher ist es für die Herstellung von Lysaten, aus denen Proteine aufgereinigt oder analysiert werden sollen, unverzichtbar.
- Warum wird Beschallung zur Extraktion eingesetzt? Die Beschallung wird aufgrund ihrer schnellen Wirkung und der Möglichkeit eines gezielten Energieeintrags bevorzugt zur Extraktion eingesetzt. Sie bricht Zellstrukturen auf, um bioaktive Moleküle ohne aggressive chemische Behandlungen freizusetzen, und erhält dadurch die funktionelle Integrität der extrahierten Verbindungen.
- Stört die Beschallung Protein-Protein-Wechselwirkungen? Die Beschallung kann Zellmembranen wirksam aufbrechen, aber auch Protein-Protein-Wechselwirkungen stören. Das Ausmaß dieser Störung hängt von der Beschallungsintensität und der Einwirkdauer ab. Sie kann zur Denaturierung oder Dissoziation von Proteinkomplexen führen und dadurch nachfolgende analytische oder funktionelle Untersuchungen beeinflussen.
- Kann E. coli durch Beschallung lysiert werden? Ultraschallgeräte von Hielscher sind besonders wirksam bei der Lyse von Bakterienzellen wie E. coli, die robuste Zellwände besitzen. Die Technik bietet eine physikalische Methode, um Zellwand und Zellmembran durch Scherung aufzubrechen. Dadurch ist sie ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung bakterieller Lysate in molekularbiologischen und biochemischen Laboren.
- Welche Prozesse folgen auf den Beschallungsschritt?
Zu den nachgelagerten Schritten nach der ultraschallgestützten Lyse gehören typischerweise die Fraktionierung des Lysats, die gezielte Isolierung von Organellen sowie die weitere Proteinextraktion oder -aufreinigung.
Das behandelte Lysat wird anschließend aufgetrennt und für analytische oder funktionelle Anwendungen vorbereitet, etwa für hochauflösende Proteomik, Transkriptomik oder Rezeptorbindungsstudien.
Literatur/Referenzen
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.