Ekstrakcja białek z tkanki nowotworowej wspomagana sonikacją – protokół

Ten protokół opisuje metodę ekstrakcji białek z tkanki nowotworowej wspomaganą sonikacją, która udoskonala standardową procedurę lizy mocznikowej CPTAC przez dodanie kontrolowanego etapu sonikacji sondowej podczas rozbijania tkanki. Modyfikacja ta, oparta na uznanej strategii CPTAC przygotowania proteomu i fosfoproteomu do analizy o dużej głębokości, poprawia rozbijanie komórek i struktur subkomórkowych, zmniejsza lepkość próbki i zwiększa uwalnianie białek, które zazwyczaj trudniej odzyskać za pomocą samej lizy mocznikowej, zwłaszcza białek związanych z błonami oraz białek wiążących DNA lub związanych z jądrem komórkowym. W badaniu stanowiącym podstawę protokołu procedura wspomagana sonikacją zwiększyła wykrywanie zarówno białek, jak i fosfopeptydów, zachowując zgodność z dalszym ciągiem procedury analitycznej w stylu CPTAC, obejmującym trawienie, znakowanie TMT, frakcjonowanie, wzbogacanie fosfopeptydów i analizę LC-MS/MS.

Ekstrakcja białek z tkanki nowotworowej wspomagana sonikacją do głębokiej analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Poniższy protokół zoptymalizowano pod kątem ekstrakcji białek z tkanki nowotworowej rozdrobnionej kriogenicznie w buforze do lizy zawierającym 8 M mocznika: dodany etap sonikacji sondowej poprawia odzysk trudnych do wyekstrahowania klas białek, zwłaszcza białek związanych z błonami oraz z DNA/jądrem komórkowym, przed trawieniem i dalszą analizą LC-MS/MS. W badaniu Li et al. (2025), stanowiącym podstawę protokołu, dodanie sonikacji zwiększyło wykrywanie białek związanych z błonami i jądrem komórkowym oraz umożliwiło uzyskanie głębokiego pokrycia obejmującego >12 000 białek i >25 000 fosfopeptydów w ramach zastosowanej przez autorów procedury.

Zakres zastosowania protokołu

Stosuj tę procedurę do:

• świeżo zamrożonej tkanki nowotworowej rozdrobnionej kriogenicznie
• osadów komórkowych lub innych próbek biologicznych, dla których ekstrakcja z użyciem mocznika jest już ustaloną metodą
• procedur proteomiki globalnej i fosfoproteomiki wykorzystujących trawienie trypsyną i opcjonalne znakowanie TMT

W badaniu Li et al. (2025) stwierdzono, że procedura ma również zastosowanie do innych rodzajów próbek, takich jak linie komórkowe, krew i mocz, jednak zależnie od rodzaju próbki może być konieczna optymalizacja.

Zoptymalizowana procedura przygotowania próbek z wprowadzonym etapem sonikacji. Zoptymalizowana procedura i plan eksperymentu opierają się na protokole CPTAC przygotowania próbek do globalnej analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej.
Badanie i schemat: ©Li et al., 2025

Zasada działania

W pierwotnym badaniu dodano sonikację do standardowej procedury lizy mocznikowej CPTAC i stwierdzono poprawę wykrywania białek związanych z błonami i jądrami komórkowymi. Autorzy podkreślają, że parametry sonikacji należy precyzyjnie dostosować do wielkości/stężenia próbki – dobierając rozmiar sonotrody, doprowadzaną energię oraz czas trwania impulsów i przerw między nimi.

Na przykład w przypadku urządzeń Hielscher UP200Ht i UP200St oznacza to:

• stosowanie amplitudy i trybu impulsowego jako głównych zmiennych sterujących
• utrzymywanie próbek w niskiej temperaturze przez cały czas (tj. na lodzie)
• rozpoczynanie od ostrożnie dobranych ustawień
• optymalizację z uwzględnieniem klarowności próbki, temperatury, uzysku białka i jakości peptydów na dalszych etapach

 
Oba modele sonikatorów Hielscher o mocy 200 watów, UP200Ht i UP200St, są przeznaczone do małych i średnich objętości próbek i mają regulowane ustawienia amplitudy oraz impulsów; oba homogenizatory ultradźwiękowe oferują cyfrowe sterowanie za pomocą ekranu dotykowego umożliwiające precyzyjną regulację parametrów, automatyczny zapis danych, podłączany czujnik temperatury, zdalne sterowanie i oświetlenie próbki.
 

Odczynniki do ekstrakcji białek wspomaganej sonikacją

Bufor do lizy zawierający mocznik

Przygotuj świeży bufor bezpośrednio przed użyciem:

• 8 M mocznika
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotyniny
• 10 µg/mL leupeptyny
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Mocznik musi zostać całkowicie rozpuszczony przed wprowadzeniem dodatków; inhibitory należy dodać bezpośrednio przed użyciem; bufor należy przechowywać na lodzie; po wprowadzeniu dodatków zaleca się mieszanie przez delikatne ruchy okrężne zamiast intensywnego mieszania na mieszadle wirowym.
 

Dodatkowe odczynniki:

• Odczynniki do oznaczania białka metodą BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• Trypsyna
• Kwas mrówkowy
• Odczynniki TMT, jeśli stosowana jest multipleksowana proteomika ilościowa
• Odczynniki IMAC, jeśli wykonywane jest wzbogacanie fosfopeptydów

Wyposażenie do ekstrakcji białek wspomaganej sonikacją

Wymagane

Zalecany dobór sonotrody

W przypadku próbek o objętości około 200–1000 µL stosuj sonotrodę o małej średnicy, odpowiednią do bezpośredniego przetwarzania małych objętości z dużą intensywnością. Hielscher oferuje sonotrody o różnych średnicach, a mniejsze średnice końcówek zapewniają większą intensywność na końcówce.

Uwaga praktyczna: stosuj najmniejszą sonotrodę, która zapewnia skuteczne mieszanie bez nadmiernego pienienia lub kontaktu ze ścianką naczynia.

Jeśli pracujesz z wieloma próbkami jednocześnie, możesz rozważyć sonikator do wielu probówek VialTweeter lub sonikator do mikropłytek UIP400MTP!

Instrukcje krok po kroku: procedura ekstrakcji białek wspomaganej sonikacją

A. Wstępne chłodzenie i przygotowanie

1. Schłodź wirówkę do 4°C.
2. Przygotuj świeży bufor do lizy zawierający mocznik i przechowuj go na lodzie.
3. Zamontuj UP200Ht lub UP200St na statywie wewnątrz obudowy dźwiękochłonnej.
4. Przygotuj kąpiel lodową wystarczająco dużą, aby utrzymywać probówki z próbkami pionowo i stabilnie.

Przygotowanie świeżego buforu i praca w niskiej temperaturze mają kluczowe znaczenie.

B. Wstępna ekstrakcja z użyciem mocznika

1. Przechowuj tkankę rozdrobnioną kriogenicznie na lodzie.
2. Dodaj 200 µL schłodzonego buforu do lizy zawierającego mocznik na 50 mg mokrej tkanki.
3. Mieszaj na mieszadle wirowym przez 5–10 s z dużą prędkością.
4. Inkubuj przez 15 min w 4°C.
5. Powtórz etap mieszania na mieszadle wirowym i następującej po nim inkubacji jeszcze jeden raz.
6. Wiruj przy 20 000g przez 10 min w 4°C.
7. Przenieś lizat/supernatant do czystej probówki o niskim wiązaniu białek.

C. Sonikacja z użyciem UP200Ht lub UP200St

Warunki początkowe sonikacji

• Amplituda: zacznij od 20–30%
• Długość impulsu: 5 s pracy
• Chłodzenie: 2 min na lodzie między impulsami
• Liczba cykli: 4 cykle
• Całkowity czas aktywnej sonikacji: 20 s
• Całkowity czas procesu z uwzględnieniem chłodzenia: około 8–10 min

Etapy sonikacji

1. Przenieś lizat do probówki odpowiedniej do sonikacji. Użyj wąskiej probówki o cienkich ściankach, która umożliwia dobrą wymianę ciepła i bezpieczne zanurzenie sonotrody.
2. Umieść probówkę w kąpieli lodowej. W publikacji wskazano, że chłodzenie podczas sonikacji ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania uszkodzeniom termicznym.
3. Zanurz końcówkę sonotrody w próbce. Utrzymuj końcówkę zanurzoną wystarczająco głęboko, aby zapewnić stabilną kawitację, ale nie dopuszczaj do jej kontaktu ze ścianką ani dnem probówki.
4. Zastosuj jeden impuls o długości 5 s przy amplitudzie początkowej.
5. Natychmiast ponownie umieść całą próbkę na lodzie na 2 min.
6. Powtarzaj do zakończenia 4 cykli.
7. Sprawdź lizat po cyklu.
8. Kontynuuj tylko w razie potrzeby, stosując po jednym dodatkowym impulsie o długości 5 s, zawsze z następującym po nim pełnym schłodzeniem.
9. Zakończ, gdy lizat stanie się bardziej jednorodny i mniej ciągliwy/lepki.
   Punktem końcowym jest bardziej przejrzysty lizat, który tworzy krople zamiast ciągłego, lepkiego strumienia.
10. Wiruj przy około 16 000g przez 15 min w 4°C.
11. Przenieś sklarowany supernatant do nowej probówki i zmierz stężenie białka.

Porównanie proteomiki globalnej i fosfoproteomiki próbek poddanych sonikacji i próbek niepoddanych sonikacji.
a. Liczba zidentyfikowanych białek (proteomika globalna) we wszystkich tkankach nowotworowych PDX poddanych sonikacji lub bez sonikacji. b. Liczba zidentyfikowanych fosfopeptydów (wzbogacanie IMAC) we wszystkich tkankach nowotworowych PDX poddanych sonikacji lub bez sonikacji. Zliczano tylko białka i fosfopeptydy ze stosunkiem obfitości większym lub równym 25. percentylowi. Stosunek obfitości obliczano między próbkami tego samego rodzaju.
Badanie i wykresy: ©Li et al., 2025

Dalsze trawienie i analiza

Po sonikacji i klarowaniu postępuj zgodnie z opisem w pierwotnej procedurze w stylu CPTAC:

1. Rozcieńcz lizat w stosunku 1:3 (v/v) buforem 50 mM Tris-HCl o pH 8,0, aby zmniejszyć stężenie mocznika do <2 M.
2. Dodaj LysC w ilości 1 mAU na 50 µg białka i inkubuj przez 2 h w 25°C.
3. Dodaj trypsynę w stosunku enzym:substrat wynoszącym 1:49 (w/w) i prowadź trawienie przez noc w 25°C.
4. Zatrzymaj reakcję, dodając kwas mrówkowy do końcowego stężenia 1%.
5. Następnie wykonaj odsalanie, znakowanie TMT, frakcjonowanie, wzbogacanie fosfopeptydów i analizę LC-MS/MS zgodnie z potrzebami.

Różnicowa ekspresja fosfopeptydów w analizie MS ze znakowaniem TMT.
a. Podtyp bazalny, z wyróżnieniem wybranych ludzkich fosfopeptydów (początek i koniec sekwencji białkowej) o zwiększonej ekspresji w próbkach poddanych sonikacji w porównaniu z próbkami niepoddanymi sonikacji. b. Podtyp luminalny, z wyróżnieniem wybranych ludzkich fosfopeptydów (początek i koniec sekwencji białkowej) o zwiększonej ekspresji w próbkach poddanych sonikacji w porównaniu z próbkami niepoddanymi sonikacji. c. Wzbogacone szlaki KEGG na podstawie białek odpowiadających fosfopeptydom o zwiększonej ekspresji w poddanym sonikacji bazalnym podtypie nowotworów. d. Wzbogacone szlaki KEGG na podstawie białek odpowiadających fosfopeptydom o zwiększonej ekspresji w poddanym sonikacji luminalnym podtypie nowotworów.
Badanie i wykresy: ©Li et al., 2025

Projektowanie, produkcja i doradztwo – jakość wyprodukowana w Niemczech

Sonikatory Hielscher są dobrze znane z najwyższych standardów jakości i projektowania. Wytrzymałość i łatwa obsługa umożliwiają płynną integrację naszych sonikatorów z instalacjami przemysłowymi. Sonikatory Hielscher z łatwością radzą sobie w trudnych warunkach i wymagających środowiskach.

Hielscher Ultrasonics jest firmą z certyfikatem ISO i kładzie szczególny nacisk na sonikatory o wysokiej wydajności, wykorzystujące najnowocześniejszą technologię i przyjazne dla użytkownika. Oczywiście sonikatory Hielscher są zgodne z wymogami CE i spełniają wymagania UL, CSA oraz RoHs.

Literatura / źródła

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.