Ekstrakcja białek z tkanek nowotworowych wspomagana sonikacją – protokół

Niniejszy protokół opisuje metodę ekstrakcji białek wspomaganej sonikacją dla tkanki nowotworowej, która rozwija standardowy przepływ pracy lizy mocznikowej CPTAC poprzez dodanie kontrolowanego etapu sonikacji sondy podczas rozrywania tkanki. Opierając się na ustalonej strategii przygotowania proteomu i fosfoproteomu CPTAC na głęboką skalę, modyfikacja ta poprawia rozerwanie struktury komórkowej i subkomórkowej, zmniejsza lepkość próbki i zwiększa uwalnianie białek, które są zwykle trudniejsze do odzyskania przy samej lizie mocznika, zwłaszcza białek związanych z błoną i wiążących DNA lub związanych z jądrem. W podstawowym badaniu przepływ pracy wspomagany sonikacją zwiększył wykrywalność zarówno białek, jak i fosfopeptydów, zachowując jednocześnie zgodność z dalszym trawieniem w stylu CPTAC, znakowaniem TMT, frakcjonowaniem, wzbogacaniem fosfopeptydów i potokiem analizy LC-MS/MS.

Wspomagana sonikacją ekstrakcja białek z tkanki nowotworowej do głębokiej analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Obszar zastosowania protokołu

Użyj tej procedury dla:

• świeżo mrożona, kriopulweryzowana tkanka nowotworowa
• granulki komórek lub inne próbki biologiczne, w przypadku których ekstrakcja mocznikiem jest już ustalona
• globalne procesy proteomiki i fosfoproteomiki z wykorzystaniem trawienia tryptycznego i opcjonalnego znakowania TMT

W badaniu Li et al. (2025) stwierdzono, że przepływ pracy ma również zastosowanie do innych rodzajów próbek, takich jak linie komórkowe, krew i mocz, jednak optymalizacja może być wymagana w zależności od rodzaju próbki.

Zoptymalizowany proces przygotowania próbek z zaimplementowanym etapem sonikacji. Zoptymalizowany przepływ pracy i projekt eksperymentalny są oparte na protokole przygotowania próbki CPTAC do globalnej analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej.
Badanie i schemat: ©Li et al., 2025

zasady działania

W oryginalnym badaniu dodano sonikację do standardowego przepływu pracy lizy mocznikowej CPTAC i stwierdzono lepsze wykrywanie białek związanych z błonami i jądrami. Autorzy stwierdzają, że parametry sonikacji muszą być precyzyjnie dostrojone w odniesieniu do wielkości próbki/stężenia – wybierając rozmiar sonotrody, pobór energii i czas impulsu.

Przykładowo, dla Hielscher UP200Ht i UP200St oznacza to:

• używać amplitudy i trybu impulsu jako głównych zmiennych sterujących
• utrzymywać próbki w niskiej temperaturze przez cały czas (np. w lodzie)
• Zacznij od ustawień konserwatywnych
• Optymalizacja pod kątem klarowności próbki, temperatury, wydajności białka i jakości peptydów na dalszych etapach procesu.

 
Oba modele sonikatorów Hielscher UP200Ht i UP200St o mocy 200 W są przeznaczone do małych i średnich objętości próbek, z regulowanymi ustawieniami amplitudy i impulsu; oba homogenizatory ultradźwiękowe zapewniają cyfrowe sterowanie ekranem dotykowym w celu precyzyjnej regulacji parametrów, automatyczną rejestrację danych, podłączany czujnik temperatury, zdalne sterowanie, oświetlenie próbki.
 

Odczynniki do ekstrakcji białek wspomaganej sonikacją

Bufor do lizy z mocznikiem

Przygotować świeży bezpośrednio przed użyciem:

• 8 M mocznik
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/ml aprotyniny
• 10 µg/ml leupeptyny
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Koktajl inhibitora fosfatazy 2, 1:100 (v/v)
• Koktajl inhibitora fosfatazy 3, 1:100 (v/v)

Mocznik musi być całkowicie rozpuszczony przed dodaniem dodatków; inhibitory powinny być dodane bezpośrednio przed użyciem; bufor powinien być przechowywany w lodzie; a po dodaniu dodatków zaleca się raczej wirowanie niż energiczne worteksowanie.
 

Dodatkowe odczynniki:

• Odczynniki do oznaczania białka BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• trypsyna
• Kwas mrówkowy
• Odczynniki TMT, w przypadku stosowania multipleksowej proteomiki ilościowej
• Odczynniki IMAC, w przypadku wzbogacania fosfopeptydów

Sprzęt do ekstrakcji białek wspomaganej sonikacją

Wymagane

Zalecany wybór sondy

W przypadku próbek o objętości około 200-1000 µL należy użyć sonotrody o małej średnicy, odpowiedniej do bezpośredniego przetwarzania małych objętości z dużą intensywnością. Hielscher oferuje wiele średnic sonotrody, a mniejsze średnice końcówek zapewniają większą intensywność na końcówce.

Uwaga praktyczna: Należy używać najmniejszej sondy, która zapewnia skuteczne mieszanie bez nadmiernego pienienia lub kontaktu ze ściankami zbiornika.

Jeśli pracujesz z wieloma próbkami jednocześnie, możesz rozważyć głośnik wielotubowy Sonicator VialTweeter lub Sonikator mikropłytek UIP400MTP!

Instrukcje krok po kroku: Procedura ekstrakcji białek wspomaganej sonikacją

A. Chłodzenie wstępne i przygotowanie

1. Schłodzić wirówkę do temperatury 4°C.
2. Przygotuj świeży bufor lizujący z mocznikiem i przechowuj go w lodzie.
3. Ustaw głośnik UP200Ht lub UP200St na stojaku wewnątrz obudowy dźwiękowej.
4. Przygotuj łaźnię lodową wystarczająco dużą, aby utrzymać probówki z próbkami w pozycji pionowej i stabilnej.

Przygotowanie świeżego buforu i obsługa w niskich temperaturach mają kluczowe znaczenie.

B. Wstępna ekstrakcja mocznika

1. Kriopulweryzowaną tkankę należy przechowywać w lodzie.
2. Dodać 200 µl schłodzonego mocznikowego buforu lizującego na 50 mg mokrej tkanki.
3. Vortex 5-10 s z dużą prędkością.
4. Inkubować 15 minut w temperaturze 4°C.
5. Powtórzyć etap worteksowania i inkubacji jeszcze raz.
6. Wirować z prędkością 20 000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
7. Przenieść lizat/supernatant do czystej probówki o niskim poziomie wiązania.

C. Sonikacja przy użyciu UP200Ht lub UP200St

Warunki początkowe dla sonikacji

• Amplituda: zacznij od 20-30%
• Długość impulsu: 5 s WŁ.
• Chłodzenie: 2 minuty na lodzie pomiędzy impulsami
• Liczba cykli: 4 cykle
• Całkowity czas aktywnej sonikacji: 20 s
• Całkowity czas procesu łącznie z chłodzeniem: około 8-10 min.

Etapy sonikacji

1. Przenieść lizat do probówki przystosowanej do sonikacji. Należy użyć wąskiej, cienkościennej probówki, która umożliwia dobrą wymianę ciepła i bezpieczne zanurzenie sondy.
2. Umieścić probówkę w łaźni lodowej. W artykule określono chłodzenie podczas sonikacji jako krytyczne dla zapobiegania uszkodzeniom termicznym.
3. Zanurzyć końcówkę sondy w próbce. Utrzymuj końcówkę zanurzoną wystarczająco, aby zapewnić stabilną kawitację, ale nie pozwól jej dotknąć ścianki lub dna rurki.
4. Wykonaj jeden 5-sekundowy impuls przy amplitudzie początkowej.
5. Natychmiast umieścić próbkę w całości w lodzie na 2 minuty.
6. Powtarzać do zakończenia 4 cykli.
7. Sprawdzić lizat po zakończeniu cyklu.
8. Kontynuować tylko w razie potrzeby, stosując jeden dodatkowy 5-sekundowy impuls na raz, po którym zawsze następuje pełne schłodzenie.
9. Zatrzymać, gdy lizat stanie się bardziej jednolity i mniej żylasty/lepki.
   Punktem końcowym jest bardziej półprzezroczysty lizat, który tworzy krople, a nie ciągły lepki przepływ.
10. Wirować z prędkością około 16 000g przez 15 minut w temperaturze 4°C.
11. Przenieść sklarowany supernatant do świeżej probówki i zmierzyć stężenie białka.

Porównanie globalnej proteomiki i fosfoproteomiki między próbkami sonikowanymi i niesonikowanymi.
a. Liczba zidentyfikowanych białek (globalna proteomika) we wszystkich tkankach guza PDX z lub bez sonikacji. b. Liczba zidentyfikowanych fosfopeptydów (wzbogacanie IMAC) we wszystkich tkankach guza PDX z lub bez sonikacji. Zliczono tylko białka i fosfopeptydy o stosunku liczebności większym lub równym 25 percentylowi. Stosunek liczebności obliczono między tymi samymi typami próbek.
Badanie i wykresy: ©Li et al., 2025

Dalsza fermentacja i analiza

Po sonikacji i klarowaniu należy postępować zgodnie z opisem w oryginalnym przepływie pracy w stylu CPTAC:

1. Rozcieńczyć lizat 1:3 (v/v) za pomocą 50 mM Tris-HCl pH 8.0, aby zredukować mocznik do <2 M.
2. Dodać LysC w ilości 1 mAU na 50 µg białka i inkubować 2 godziny w temperaturze 25°C.
3. Dodać trypsynę w stosunku 1:49 enzym:substrat (w/w) i trawić przez noc w temperaturze 25°C.
4. Schłodzić kwasem mrówkowym do 1% końcowego.
5. Kontynuować odsalanie, etykietowanie TMT, frakcjonowanie, wzbogacanie fosfopeptydów i LC-MS/MS zgodnie z wymaganiami.

Różnicowa ekspresja fosfopeptydów z MS znakowanych TMT.
a. Podtyp podstawowy, podkreślający niektóre ludzkie fosfopeptydy (początek i koniec sekwencji białkowej) regulowane w górę w sonikowanych próbkach w porównaniu z próbkami nie poddanymi sonikacji. b. Podtyp luminalny, podkreślający niektóre ludzkie fosfopeptydy (początek i koniec sekwencji białkowej) regulowane w górę w sonikowanych próbkach w porównaniu z próbkami nie poddanymi sonikacji. c. Wzbogacone szlaki KEGG oparte na białkach fosfopeptydów regulowanych w górę w sonikowanym podtypie podstawowym nowotworów. d. Wzbogacone szlaki KEGG oparte na białkach regulowanych w górę fosfopeptydów w sonikowanym podtypie luminalnym nowotworów.
Badanie i wykresy: ©Li et al., 2025

Projektowanie, produkcja i doradztwo – Jakość Made in Germany

Ultradźwięki Hielscher są dobrze znane z najwyższej jakości i standardów projektowych. Solidność i łatwa obsługa pozwalają na płynną integrację naszych ultradźwiękowców z obiektami przemysłowymi. Trudne warunki i wymagające środowiska są łatwo obsługiwane przez ultradźwięki Hielscher.

Hielscher Ultrasonics jest firmą posiadającą certyfikat ISO i kładzie szczególny nacisk na wysokowydajne ultradźwięki z najnowocześniejszą technologią i łatwością obsługi. Oczywiście ultradźwięki Hielscher są zgodne z CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.

Literatura / Referencje