Technologia ultradźwiękowa firmy Hielscher

Ultradźwiękowy Lizę do metody Western Blot

  • Western blot jest postępowanie analityczne do wykrywania konkretnych białek w próbce homogenizatu tkankowego lub ekstraktu komórkowego.
  • Aby uruchomić Western blot lub mierzenia aktywności enzymatycznej, wiele testów wymaga dostępu do materiałów (na przykład białka, DNA, subkomórkowe fragmenty) zamknięty w komórce.
  • Sonikacja jest niezawodne i łatwe w obsłudze sposób kontrolowanego rozerwania komórek i ich liza.

Ultradźwiękowe rozbijanie komórek

ekstrakcji białek z tkanek i hodowane komórki jest pierwszym etapem do wielu biologiczne, biochemiczne i technik analitycznych (PAGE, Western blotting, ELISA, spektrometrii masowej, itd.) lub oczyszczanie białka. W celu uzyskania wysokiej wydajności białka, materiał komórek i tkanek musi być skutecznie przerwany / lizie. Czy komórki tkanki roślinnej lub zwierzęcej, ultradźwiękami jest metoda, aby przygotować swoją lizat komórkowy łatwy i szybki.

Zalety ultradźwiękami

  • Szybki & wydajny
  • łatwa operacja
  • wysoką wydajność białka
  • powtarzalny / powtarzalne
  • precyzyjnie kontrolowane
  • skalowalne

Immunoprecypitacja Protokół dla zachodnich immunoblotting

A. Odczynniki

Dla przygotowania roztworów, wykorzystywać oczyszczoną wodę, taką jak Milli-Q.

  • 1X bufor fosforanowy (PBS)
  • 1X lizy komórek Bufor: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 Pirofosforan mM sodu, 1 mM β-glicerofosforan, 1 mM Na3VO4, 1 ng / ml leupeptyny
    Ważne: Dodaj 1 mM PMSF bezpośrednio przed użyciem.
  • 15 ul białka A + 15 ul Białko G jest wystarczająca dla IP, ale może zależeć od pierwotnej objętości przeciwciała i próbki. Można również użyć wstępnie mieszany białko A / G-agarozę (na przykład białkiem A do IgG królika rozwijane i białko G przez IgG rozwijanego)
  • 3X buforu do próbek SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 w temperaturze 25 ° C), 6% w / v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w / v błękitu bromofenolowego
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter do przygotowania próbki ultradźwiękowej

Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!





Proszę zwrócić uwagę na nasze Polityka prywatności.


Sonikacja jest ważnym etapem w przygotowaniu próbki

UP200St mikro końcówką dla próbki ultradźwiękami

B. Wytwarzanie lizaty komórkowe

  • Zebrania komórek. W celu zebrania komórek w warunkach nondenaturing, usuwanie nośnika i płukania komórek jednokrotnie lodowatym PBS.
  • PBS usunąć i dodać bufor do lizy komórek 0,5 ml lodowatego 1X do każdej płytki (10 cm) i płytki inkubuje się na lodzie przez 5 minut.
  • Zeskrobać komórki z płytek i przenosi do probówek do mikrowirówki. Przechowywać na lodzie.
  • Sonifikowano dwa razy po 10 sekund w buforze do immunoprecypitacji, lodowato zimnego buforu IP (50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i mieszaninę inhibitorów proteazy). Dla ultradźwiękami VialTweeter lub ultrasonicator sondy, jak UP100H lub UP200Ht są najbardziej odpowiednie.
  • Lizaty wiruje się przy 15000 g przez 10 minut w temperaturze 4 ° C.
  • Przeniesiono supernatant do nowej probówki. (W razie potrzeby, lizat może być przechowywany w temperaturze -80 ° C).
  • Dodanie przeciwciała pierwszorzędowego z supernatanta. Supernatant z podstawowym przeciwciałem inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 4 ° C przy lekkim mieszaniu. pierwsze przeciwciało dodaje się zwykle w ilości 10x bardziej stężony niż stosuje western blotting. (Można zacząć od 1 ug na 100 ul).
  • Następnie supernatant dalej inkubuje się z mieszaniną równych ilości białka A-agarozy (Invitrogen) i białka G agarozy przez kolejną 1 godzinę.
  • Umyć pastylek agarozowym trzykrotnie buforem IP. Następnie ekstrakt związanych białek z żelu SDS-PAGE w buforze do nakładania przez ogrzewanie w temperaturze 95 ° C przez 5 minut.

C. Immunoprecypitacja

  • Dawki 200 ul lizatu komórek i dodanie pierwszego przeciwciała. Inkubuje z łagodnym kołysania przez noc w temperaturze 4 ° C.
  • Dodać białko A albo perełki agarozowe G (20 ul 50% zawiesiny perełek). Inkubuje z łagodnym kołysania przez 1-3 godziny w temperaturze 4 ° C.
  • Odwirowanie przez 30 sekund w 4 ° C. Mycia osadu pięć razy za pomocą 500 ul 1 x buforu do lizy komórkowej. Przechowywać na lodzie podczas praniach.
  • Ponownie zawiesić osad z 20 jil buforu do próbek z SDS 3X. Vortex, a następnie mikrowirówce przez 30 sekund.
  • Ogrzewać próbkę do temperatury 95-100 ° C w ciągu 2-5 minut, a mikro wirówce przez 1 minutę przy 14000 x g.
  • Załadowania próbki (15-30 ul) w żelu SDS-PAGE (12-15%).
  • Analizować próbki przez Western blot.

Kontakt / Poproś o więcej informacji

Porozmawiaj z nami o swoich wymagań technologicznych. My polecamy najbardziej odpowiednie parametry konfiguracyjne i przetwarzania dla danego projektu.





Proszę zwrócić uwagę na nasze Polityka prywatności.


Więcej Protokoły sonikację

Analiza Western blot z ultrasonicator UP50H

Poniższy protokół zastosowano w badaniu Kriebisch et al. (2011):
Białko całkowite z komórek wyizolowano MC3T3 E1 leczonych 1,25 (OH)2re3 (10-8 K) lub nośnik. Komórki poddano lizie w buforze zawierającym 50 mM Tris HCI, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% siarczan dodecylu sodu (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% deoksycholan sodu (Merck). Lizat komórek poddano działaniu ultradźwięków przez 2 x 10 sekund w cyklu 1 i amplitudzie 80 z Procesor ultradźwiękowy UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Niemcy). Następnie materiał wirowano przez 10 minut przy 14000 obrotów na minutę, a supernatant wykorzystano do analizy Western blotting. Dwadzieścia pięć μg białka gotowano w buforze do próbek i środku redukującym (Invitrogen), a następnie rozdzielano metodą SDS-PAGE, stosując 4-12% żele poliakrylamidowe (Invitrogen) i przenoszono na błonę nitrocelulozową (opieka zdrowotna GE). Membranę blokowano przez 1 godzinę za pomocą TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) zawierającego 1% kazeiny (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Po zablokowaniu membranę inkubowano z lekkim wstrząsaniem przez noc w 4 ° C z pierwszorzędowym przeciwciałem (królicze przeciwludzkie CBS 1/500, opracowane w laboratorium Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubację ze sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HPR) drugorzędowym przeciwciałem (Dako) prowadzono przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wszystkie bloty opracowano przez wzmocnioną chemiluminescencję (Perkin Elmer).

Literatura / Referencje



O metody Western Blot

Bioty są procedury analityczne, w których DNA, RNA i białka przenosi się na nośniku, tak że można je rozdzielić.
Southern biot jest używana do wykrywania DNA, Northern biot dla RNA i Western blot dla białka.
Western biot jest także nazywany immunoblottingu białka, ponieważ przeciwciało jest stosowane do swoistego wykrywania jego antygenu. Western Blotting jest jedną z najważniejszych metod analitycznych do wykrywania specyficznych białek w próbce. W Western blot białka są unieruchomione na błonach je wykryć przy użyciu przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał.
W wyniku elektroforezy na żelu poliakryloamidowym z SDS-PAGE (SDS-PAGE) rozdziela się strukturę 3D lub zdenaturowane białka na długość polipeptydu. Białka są następnie przenoszone na błonę (zazwyczaj nitrocelulozę lub PVDF), gdzie barwione są przeciwciałami swoistymi dla docelowego białka. Etap elektroforezy żelowej włączono do analizy Western błot, aby rozwiązać problem reaktywności krzyżowej przeciwciał.
Następnie oddzielone białka są przenoszone na matrycę (głównie na błonę nitrocelulozową lub PVDF), gdzie są barwione przeciwciałami. Przeciwciała działają jako sonda i są selekcjonowane specyficznie względem docelowego białka. Analiza lokalizacji i intensywności konkretnej reakcji ujawnia szczegóły ekspresji docelowych białek w danej próbce. Western blotting może wykryć docelowe białko, które jest tak niskie jak 1 ng ze względu na wysoką rozdzielczość elektroforezy żelowej i silną specyficzność i wysoką czułość testu immunologicznego. Metodę Western blot stosuje się w biologii molekularnej, biochemii, immunogenetyce i innych dziedzinach badań molekularnych.
Inne pokrewne techniki obejmują dot blot immunohistochemiczna i immunocytochemicznych, gdy przeciwciała są stosowane do wykrywania białek w tkankach i komórkach poprzez barwienie immunologiczne i enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA).