Liza ultradźwiękowa do Western Blotting

• Western blot to procedura analityczna służąca do wykrywania określonych białek w próbce homogenatu tkankowego lub ekstraktu komórkowego.
• Aby przeprowadzić Western blot lub zmierzyć aktywność enzymu, wiele testów wymaga dostępu do materiałów (np. białek, DNA, fragmentów subkomórkowych) uwięzionych w komórce.
• Sonikacja jest niezawodną i łatwą w obsłudze metodą kontrolowanego rozbijania i lizy komórek.

Ultradźwiękowe zakłócanie komórek

Ekstrakcja białek z tkanek i hodowanych komórek jest pierwszym krokiem dla wielu technik biologicznych, biochemicznych i analitycznych (PAGE, Western blotting, ELISA, spektrometria masowa itp.) lub oczyszczania białek. Aby uzyskać wysoką wydajność białka, materiał komórkowy i tkanka muszą być skutecznie rozbite / lizowane. Niezależnie od tego, czy jest to komórka roślinna czy tkanka zwierzęca, sonikacja jest metodą łatwego i szybkiego przygotowania lizatu komórkowego.

Zalety sonikacji

• Szybko & Wydajność
• Łatwa obsługa
• wysoka wydajność białka
• odtwarzalny/ powtarzalny
• precyzyjnie kontrolowany
• skalowalny

Protokół immunoprecypitacji dla immunoblottingu Western

A. Odczynniki

Do przygotowania roztworów należy użyć oczyszczonej wody, takiej jak Milli-Q.

• 1X sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)
• 1X Bufor do lizy komórek: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosforan sodu, 1 mM β-glicerofosforan, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptyna
  Ważne: Dodaj 1 mM PMSF bezpośrednio przed użyciem.
• Do IP wystarczy 15 μl białka A + 15 μl białka G, ale może to zależeć od przeciwciała pierwotnego i objętości próbki. Można również użyć wstępnie zmieszanej agarozy z białkiem A/G (np. białko A do ściągania króliczych IgG i białko G do ściągania mysich IgG).
• 3X SDS Sample Buffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 w 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v błękit bromofenolowy

B. Przygotowanie lizatów komórkowych

• Zbierz komórki. Aby zebrać komórki w warunkach bez denaturacji, usuń pożywkę i przepłucz komórki raz lodowatym PBS.
• Usunąć PBS i dodać 0,5 ml lodowatego 1X buforu do lizy komórek do każdej płytki (10 cm) i inkubować płytki na lodzie przez 5 minut.
• Zeskrob komórki z płytek i przenieś je do probówek mikrowirówki. Przechowywać w lodzie.
• Sonifikować dwukrotnie przez 10 sekund w lodowatym buforze do immunoprecypitacji (bufor IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i mieszanina inhibitorów proteazy). W przypadku sonikacji VialTweeter lub sonda ultradźwiękowa, taka jak UP100H lub UP200Ht są najbardziej odpowiednie.
• Odwirować lizaty z prędkością 15 000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
• Przenieść supernatant do nowej probówki. (W razie potrzeby lizat można przechowywać w temperaturze -80°C).
• Dodać pierwotne przeciwciało do supernatantu. Supernatant z pierwotnym przeciwciałem jest inkubowany przez 1 godzinę w temperaturze 4°C przy lekkim mieszaniu. Pierwotne przeciwciało jest zwykle dodawane w ilości 10 razy bardziej stężonej niż jest używana do western blottingu. (Można zacząć od 1 μg na 100 μl).
• Supernatant jest następnie inkubowany z mieszaniną równych ilości agarozy białkowej A (Invitrogen) i agarozy białkowej G przez kolejną 1 godzinę.
• Trzykrotnie przepłukać granulki agarozy buforem IP. Następnie wyekstrahować związane białka za pomocą buforu obciążającego SDS-PAGE przez ogrzewanie w temperaturze 95°C przez 5 minut.

C. Immunoprecypitacja

• Pobrać 200 μl lizatu komórkowego i dodać pierwotne przeciwciało. Inkubować z delikatnym kołysaniem przez noc w temperaturze 4°C.
• Dodać kulki agarozowe z białkiem A lub G (20 μl 50% zawiesiny kulek). Inkubować z delikatnym kołysaniem przez 1-3 godziny w temperaturze 4°C.
• Mikrowirować przez 30 sekund w temperaturze 4°C. Przemyć osad pięciokrotnie za pomocą 500 µl 1-krotnego buforu do lizy komórek. Przechowywać na lodzie podczas płukania.
• Ponownie zawiesić osad w 20 μl 3-krotnego buforu SDS do próbek. Worteksować, a następnie mikrowirować przez 30 sekund.
• Podgrzewać próbkę do temperatury 95-100°C przez 2-5 minut i mikrowirować przez 1 minutę przy 14 000 X g.
• Załadować próbkę (15-30 μl) na żel SDS-PAGE (12-15%).
• Przeanalizuj próbkę metodą Western blotting.

Analiza Western Blot za pomocą Sonicator UP50H

Poniższy protokół wykorzystujący sonikator typu UP50H został wykorzystany w badaniu Kriebisch et al. (2011):
Białko całkowite wyizolowano z komórek MC3T3-E1 poddanych działaniu 1,25(OH)₂D₃ (10^-8 M) lub nośnik. Komórki lizowano buforem zawierającym 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% dezoksycholanu sodu (Merck). Lizat komórkowy poddano działaniu ultradźwięków przez 2 × 10 s przy cyklu 1 i amplitudzie 80 przy użyciu urządzenia Procesor ultradźwiękowy UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Niemcy). Następnie materiał odwirowano przez 10 minut przy 14 000 obrotów na minutę, a supernatant wykorzystano do Western blotting. Dwadzieścia pięć μg białka gotowano w buforze do próbek i środku redukującym (Invitrogen), a następnie rozdzielono za pomocą SDS-PAGE przy użyciu 4-12% żeli poliakrylamidowych (Invitrogen) i przeniesiono na membranę nitrocelulozową (GE health care). Membranę blokowano przez 1 godzinę za pomocą TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) zawierającego 1% kazeiny (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Po zablokowaniu, membranę inkubowano z lekkim mieszaniem przez noc w temperaturze 4°C z pierwotnym przeciwciałem (królicze anty-ludzkie CBS 1/500, opracowane w laboratorium Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubację z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HPR) (Dako) przeprowadzono przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wszystkie bloty zostały opracowane przez wzmocnioną chemiluminescencję (Perkin Elmer).
 

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej na temat najlepszych praktyk w zakresie ultradźwiękowej lizy i ekstrakcji komórek, przygotowania lizatu i zaleceń dotyczących usprawnień procesu!
 
Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych ultrasonografów laboratoryjnych:

Literatura / Referencje