Liza ultradźwiękowa do analizy metodą Western blot

• Western blot to procedura analityczna służąca do wykrywania określonych białek w próbce homogenatu tkankowego lub ekstraktu komórkowego.
• Aby przeprowadzić analizę metodą Western blot lub zmierzyć aktywność enzymatyczną, wiele oznaczeń wymaga dostępu do materiałów (np. białek, DNA, fragmentów subkomórkowych) zamkniętych wewnątrz komórki.
• Sonikacja jest niezawodną i łatwą w stosowaniu metodą kontrolowanego rozbijania komórek i lizy.

Ultradźwiękowe rozbijanie komórek

Ekstrakcja białek z tkanek i komórek hodowlanych stanowi pierwszy etap wielu technik biologicznych, biochemicznych i analitycznych (PAGE, Western blot, ELISA, spektrometria mas itp.) lub oczyszczania białek. Aby uzyskać wysoką wydajność odzysku białek, materiał komórkowy i tkanki muszą zostać skutecznie rozbite/poddane lizie. Zarówno w przypadku komórek roślinnych, jak i tkanek zwierzęcych sonikacja umożliwia łatwe i szybkie przygotowanie lizatu komórkowego.

Zalety sonikacji

• szybka i wydajna
• łatwa obsługa
• wysoka wydajność odzysku białek
• odtwarzalna/powtarzalna
• precyzyjnie kontrolowana
• skalowalna

Protokół immunoprecypitacji do immunoblottingu metodą Western blot

A. Odczynniki

Do przygotowania roztworów należy używać oczyszczonej wody, np. Milli-Q.

• 1X sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
• 1X bufor do lizy komórek: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosforanu sodu, 1 mM β-glicerofosforanu, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptyny
  Ważne: Dodać 1 mM PMSF bezpośrednio przed użyciem.
• 15 μl białka A+15 μl białka G wystarcza do IP, ale może to zależeć od przeciwciała pierwotnego i objętości próbki. Można również użyć gotowej mieszaniny agarozy z białkiem A/G (np. białka A do wychwytywania króliczych IgG i białka G do wychwytywania mysich IgG)
• 3X bufor próbkowy SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 w 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerolu, 150 mM DTT, 0,03% w/v błękitu bromofenolowego

B. Przygotowanie lizatów komórkowych

• Zebrać komórki. Aby zebrać komórki w warunkach niedenaturujących, usunąć pożywkę i jednokrotnie przepłukać komórki lodowato zimnym PBS.
• Usunąć PBS, dodać do każdej płytki (10 cm) 0,5 ml lodowato zimnego buforu do lizy komórek 1X i inkubować płytki na lodzie przez 5 minut.
• Zeskrobać komórki z płytek i przenieść do probówek do mikrowirowania. Przechowywać na lodzie.
• Poddać sonikacji dwukrotnie przez 10 sekund w lodowato zimnym buforze do immunoprecypitacji (bufor IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i mieszanina inhibitorów proteaz). Do sonikacji VialTweeter lub sonikator sondowy, taki jak UP100H lub UP200Ht, nadają się najlepiej.
• Wirować lizaty przy 15 000 g przez 10 minut w 4°C.
• Przenieść supernatant do nowej probówki. (W razie potrzeby lizat można przechowywać w –80°C.)
• Dodać przeciwciało pierwotne do supernatantu. Supernatant z przeciwciałem pierwotnym inkubuje się przez 1 h w 4°C przy delikatnym mieszaniu. Przeciwciało pierwotne zazwyczaj dodaje się w stężeniu 10x wyższym niż stosowane w analizie metodą Western blot. (Można zacząć od 1μg na 100μL.)
• Następnie supernatant inkubuje się przez kolejną 1 h z mieszaniną równych ilości agarozy z białkiem A (Invitrogen) i agarozy z białkiem G.
• Przemyć osady agarozy trzykrotnie buforem IP. Następnie wyekstrahować związane białka za pomocą buforu do nanoszenia próbek na żel SDS-PAGE, ogrzewając przez 5 minut w 95°C.

C. Immunoprecypitacja

• Pobrać 200 μl lizatu komórkowego i dodać przeciwciało pierwotne. Inkubować przez noc w 4°C przy delikatnym kołysaniu.
• Dodać kulki agarozowe z białkiem A lub G (20 μl 50% zawiesiny kulek). Inkubować przez 1–3 godziny w 4°C przy delikatnym kołysaniu.
• Wirować w mikrowirówce przez 30 sekund w 4°C. Przemyć osad pięciokrotnie, używając 500 µl buforu do lizy komórek 1X. Podczas przemywania przechowywać na lodzie.
• Ponownie zawiesić osad w 20 μl buforu próbkowego SDS 3X. Wymieszać na worteksie, a następnie wirować w mikrowirówce przez 30 sekund.
• Ogrzać próbkę do 95–100°C przez 2–5 minut i wirować w mikrowirówce przez 1 minutę przy 14 000 X g.
• Nanieść próbkę (15–30 μl) na żel SDS-PAGE (12–15%).
• Przeanalizować próbkę metodą Western blot.

Analiza metodą Western blot z użyciem sonikatora UP50H

Poniższy protokół z użyciem sonikatora sondowego UP50H zastosowano w badaniu Kriebisch i wsp. (2011):
Białko całkowite wyizolowano z komórek MC3T3-E1 poddanych działaniu 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) lub nośnika. Komórki poddano lizie za pomocą buforu zawierającego 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% deoksycholanu sodu (Merck). Lizat komórkowy poddano sonikacji przez 2 × 10 s przy ustawieniu cyklu 1 i amplitudy 80 za pomocą procesora ultradźwiękowego UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Niemcy). Następnie materiał wirowano przez 10 min przy 14 000 rpm, a supernatant wykorzystano do analizy metodą Western blot. Dwadzieścia pięć μg białka gotowano w buforze próbkowym i środku redukującym (Invitrogen), a następnie rozdzielono metodą SDS-PAGE z użyciem 4–12% żeli poliakrylamidowych (Invitrogen) i przeniesiono na membranę nitrocelulozową (GE health care). Membranę blokowano przez 1 h za pomocą TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) zawierającego 1% kazeiny (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Po blokowaniu membranę inkubowano przez noc w 4°C przy delikatnym mieszaniu z przeciwciałem pierwotnym (króliczym przeciw ludzkiej CBS, 1/500, opracowanym w laboratorium prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubację z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HPR) (Dako) prowadzono przez 1 h w temperaturze pokojowej. Wszystkie bloty wywołano metodą wzmocnionej chemiluminescencji (Perkin Elmer).
 

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej o najlepszych praktykach ultradźwiękowej lizy komórek i ekstrakcji, przygotowaniu lizatów oraz zaleceniach dotyczących usprawniania procesów!
 
Poniższa tabela przedstawia orientacyjną wydajność przetwarzania naszych sonikatorów laboratoryjnych:

Literatura / Źródła

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.