• Podczas ścinania DNA i RNA, cząsteczki DNA są rozbijane na mniejsze kawałki. Fragmentacja DNA / RNA jest jednym z ważnych etapów przygotowania próbki wymaganym do tworzenia bibliotek do sekwencjonowania następnej generacji (NGS).
• Ultradźwiękowy ścinanie DNA wykorzystuje sił kawitacji akustycznej rozbić DNA lub RNA, na kawałki 100 – 5KB BP.
• Ultradźwiękowy ścinania umożliwia precyzyjne fragmentacji DNA i przystosowania do wymaganej długości DNA.

Ścinanie DNA za pomocą ultradźwięków

Hielscher Ultradźwięki oferuje różne rozwiązania ultradźwiękowych opartych na DNA, RNA i chromatyny ścinania. Wybór pomiędzy sonda typu ultrasonicators (np UP100H) do bezpośredniego ultradźwiękami stosując mikrokońcówek lub użyć VialTweeeter lub ultradźwiękowego cuphorn do pośredniego wytwarzania DNA z różnych próbek jednocześnie. Hielscher oferuje idealne urządzenie biorąc pod uwagę swoje potrzeby: pogoda masz 1 lub aż 10 próbek, wielkości od mikrolitrów do objętości litrowych – Hielscher ultradźwiękowe procesory są dostępne w celu spełnienia wymagań przygotowanie DNA, RNA i fragmenty chromatyny przy odpowiedniej długości. Powtarzalność, łatwa obsługa i precyzyjne sterowanie pozwala na niezawodne biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji.
W przeciwieństwie do fragmentacji DNA enzymatycznej ultradźwiękowe ścinanie stosuje się czyste siły ścinające mechanicznych bez dodawania jakichkolwiek środków chemicznych. Do dokładnego ustawienia parametrów procesu ultradźwiękowe ścinanie powoduje duże fragmenty DNA o dużym ciężarze cząsteczkowym (plazmid i genomowy DNA).
Oczyszczone kwasy nukleinowe mogą być wzmacniane, przed lub po etapie rozdrabniania.
Parametry sonikacyjne (Power, cykl impulsów / wybuchy, czas i temperatura) może być sterowany za pośrednictwem bezpiecznego ustawień oprogramowania.

Protokoły Ultrasonic DNA ścinających

Dla immunoprecypitacja chromatyny Test

W skrócie, komórki wysiewano na płytki o średnicy 60 mm (400 000 na szalkę) i transfekowano siRNA RhoA (jak opisano); po 72 godzinach inkubowano je z formaldehydem (stężenie końcowe, 1%) przez 10 minut w 37 ° C w celu usieciowania białek do DNA. Reakcję sieciowania przerwano przez dodanie jednej dziesiątej objętości 1,25 mola / litr glicyny, co dało końcowe stężenie 125 mmol / l. Komórki przemyto dwukrotnie lodowato zimnym PBS, ponownie zawieszono w buforze do oznaczania radioimmunoprecypitacji [150 mmol / l NaCl, 1% NP40, 0,5% dezoksycholanu, 0,1% SDS, 5 mmol / l EDTA, 50 mmol / l Tris-HCl (pH 8,0). )] zawierające 1 mmol / L fluorku fenylometylosulfonylu, 1 Ag / ml aprotyniny i 1 Ag / ml pepstatyny A i trzymano na lodzie przez 30 minut. Następnie lizaty komórkowe poddano działaniu ultradźwięków na lodzie z użyciem a Hielscher UP200S ultradźwięków ultradźwiękowej (3 x 40 s, amplituda 40%, cykl 1, Hielscher Ultradźwięki GmbH) aż usieciowanych chromatins wycięto z otrzymaniem fragmentów DNA wielkości od 200 do 1000 par zasad. Jedną dziesiątą całej lizatu stosuje się do oceny ilości DNA obecnego w różnych próbkach i uznanych “całkowity DNA wejście”, Supernatanty inkubowano z DNA spermy łososia / agarozą białka 50% zawiesiny w celu zmniejszenia niespecyficznego tła. Immunoprecypitacja zostało następnie wykonane przez noc w temperaturze 4 ° C z 5 Ag przeciw-NF-NB p65 (Upstate) lub bez przeciwciała (kontrola negatywna). Te supernatanty z dodatkiem 5 mola / l NaCl i ogrzewano przez noc w temperaturze 65 ° C do powrotu wiązań sieciujących białko-DNA. W immunologicznych traktowano następnie DNase- i RNaz proteinazy K i DNA oczyszczono za pomocą ekstrakcji fenol / chloroform i wytrącenie etanolem. PCR przeprowadzono za pomocą starterów specyficznych dla odpowiednich sekwencji w regionie promotora ludzkiego genu iNOS (P1 gruntujące 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶ P2 gruntujące GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier i wsp., 2008),

Badania ekspresji EGFP

Do badań ekspresji, rekombinowanego p10 szczep L. tarentolae :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Niemcy) z genem EGFP (zielone fluorescencyjne białko, Ulepszone) chromosomalne SSU zintegrowane hodowano w różnych mediach, jak opisano wcześniej, i dodatkowo uzupełnione 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Niemcy). Podczas uprawy 1 ml pobierano próbki, odwirowano (2000 x g, 20 ° C, 10 min) i przemyto 0,9% roztworem NaCl. Osad ponownie zawiesza się w buforze (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i rozpadały się sonifikacji z procesorem ultradźwiękowego UP400S (Zastosowanie energii ~ 400 Ws). Pozostałości komórkowe usuwano przez odwirowanie (6000 x g, 4 ° C, 5 min) i analizowano za pomocą siarczanu dodecylu sodu - elektroforezy na żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) w warunkach redukujących, według metody Laemmli (1970), 12,5% żelach polyacralamide , Ekspresję EGFP badano w kulturze mieszanej. (Fritsche i inni, 2007)

immunoprecypitacja chromatyny

Oznaczenie immunoprecypitacji chromatyny przeprowadzono stosując chip-IT^TM Express (aktywny motyw, Carlsbad, CA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta z pewnymi modyfikacjami. W skrócie, ludzkie były zróżnicowane Podocyty usieciowany 1% formaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto lodowatym PBS i reakcję utrwalania zatrzymano dodając 0,125 M glicyny przez 5 min w temperaturze pokojowej. Komórki ponownie płukano lodowatym PBS, zdrapywano z naczynia. Komórki osadzono przez wirowanie i ponownie zawiesza się w buforze do lizy. Po odwirowaniu osad jądra zawieszano w buforze ścinania, inkubowano na lodzie przez 30 minut i chromatyny poddano działaniu sił ścinających, na przykład przez sonikację UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Niemcy) przy 25% mocy 5 pulsów po 20 s na lód na fragmentach o wielkości około 200-600 bp. Ścinaną chromatynę odwirowano i zebrano supernatant. W przypadku immunoprecypitacji 60 μl chromatyny inkubowano z 1 μg przeciwciał Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) lub NF-κB p50 (Abcam) lub królika IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), jako kontrolę ujemną, przez noc w 4 ° C z łagodną rotacją. Immunokompleksy związane z kulkami magnetycznymi zebrano przy użyciu stojaka magnetycznego, dokładnie przemyto, a wiązania poprzeczne białko / DNA odwrócono i DNA wymyto do analizy PCR w czasie rzeczywistym. (Ristola i wsp. 2009)

EHEC preparat DNA do analizy macierzy wiórów

Układ lizatów komórkowych i ekstrahowano DNA
Osady bakterii zawieszonych w PBS z żądanym końcowym stężeniu traktowano USG disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Niemcy) wyposażony w mikroukład MS1 (1 mm średnicy). Częstotliwość robocza wynosiła 30 kHz, a efektywna moc wyjściowa wynosiła 100 W. Podczas operacji próbki ochłodzono w łaźni lodowej, zmieszano i odwirowano. Próbki wykorzystano do badań cytometrii przepływowej, natomiast do późniejszego manipulowania próbki poddano obróbce cieplnej (95 ° C, 5 min). Surowe lizaty komórkowe przetwarzano mieszaniną fenolu: chloroform: alkohol izoamylowy (25: 24: 1). Równą objętość tej mieszaniny dodano do próbki lizatu, roztwór energicznie zworteksowano przez 15 s i odwirowano przy 15000 xg przez 2 min w temperaturze pokojowej (RT) około 22 ° C. Górną fazę wodną zawierającą genomowy DNA ostrożnie oddzielono i zebrano w nowej jałowej probówce Eppendorfa.
Następnie próbki poddano sonikacji w celu fragmentacji DNA. Etap sonikacji zrealizowano w takich samych warunkach, jak opisano powyżej. Aby ocenić wpływ fragmentacji na genomowy DNA, próbki analizowano przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym.
(…) Próbki poddane sonifikacji poprzednio przez 2,5 minuty poddano etapowi ekstrakcji po obróbce cieplnej i wirowaniu. Uwolnione DNA ekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenol: chloroform: alkohol izoamylowy, a następnie poddawano drugiej sonikacji przez 0 - 15 min. Do określenia rozkładu wielkości DNA poddanego fragmentacji ultradźwiękowej po ekstrakcji wykorzystano elektroforezę w żelu agarozowym (ryc. W prawym górnym rogu). Wysoko pofragmentowany DNA był widoczny z obecności rozmazu DNA, a nie z prążków o dużej masie cząsteczkowej, które zostały wyeliminowane z próbek poddanych działaniu ultradźwięków przez 2,5 minuty lub dłużej. Dłuższa sonikacja stopniowo zmniejszała długość fragmentów do około 150-600 bp, a sonikacja przez 15 minut dalej degradowała te fragmenty, co widać głównie w górnej części rozmazu. W związku z tym średnia wielkość fragmentu DNA stopniowo zmniejszała się wraz z czasem ultrasonikacji, a obróbka 5-minutowa pozwalała uzyskać rozmiary fragmentów DNA najbardziej odpowiednich do testów na układy z chipem. W końcu ustalono procedurę otrzymywania analitu DNA obejmującą pierwsze 2 min obróbki ultradźwiękowej, ekstrakcję DNA (2 x), a następnie 5 minutową sonikację. (Basselet i wsp. 2008)

Immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Komórki HEK293 hodowano jak opisano powyżej i utrwalano 2 mM glutaranu disukcynimidylu przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS. Chromatynę usieciowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej, stosując 1% (v / v) formaldehyd i przemyto dwukrotnie lodowatym PBS. Reakcję sieciowania zatrzymano przez inkubację z glicyną w końcowym stężeniu 0,125 M przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji z trypsyną komórki zdrapano z naczynia do hodowli komórkowej i przemyto dwukrotnie PBS. Osad komórkowy ponownie zawieszono w buforze do lizy (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v / v) Nonidet P-40), inkubowano na lodzie przez 10 min i homogenizowano za pomocą homogenizatora Dounce. Następnie jądra osadzono przez odwirowanie (3500 xg, 5 min, 4 ° C) i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze jądrowym (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA i 1% (wag./obj.) SDS). Jądra zostały zakłócone przez sonikację trzema 20-s impulsami w UP50H terapii ultradźwiękowej (Hielscher Ultraschall Technologie) przy ustawieniu cyklu 0,5 i amplituda 30%, uzyskując fragmenty genomowego DNA o wielkości nasypowej 200 - 1000 bp. Wióra, 50g DNA rozcieńcza się 4-krotnie w buforze do immunoprecypitacji (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 i 0,01% (wagowo / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza modyfikacji histonów przez immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Pokrótce, 6 x 10⁶ Komórki przemyto dwukrotnie PBS i usieciowany na płytce do hodowli na 15 minut w temperaturze pokojowej w obecności 0,5% aldehydu mrówkowego. reakcję sieciowania zatrzymano przez dodanie 0,125 M glicyny. Wszystkie kolejne etapy były przeprowadzane w temperaturze 48 ° C. Wszystkie bufory wstępnie schłodzone i zawierał inhibitorów proteazy (Complete mini, Roche). Komórki przemyto dwukrotnie PBS, a następnie do zgarniania. Uzyskane granulki rozpuszcza się w 1 ml buforu do lizy (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8) i poddano działaniu ultradźwięków na łaźni z zimną etanolu przez 10 cykli przy 100% amplitudy stosując spektrofotometr UP50H terapii ultradźwiękowej (Hielscher, Teltow, Niemcy). Fragmentacja chromatyny uwidoczniono w 1% żelu agarozowym. Otrzymane fragmenty były w 200-500pb zakresu. Rozpuszczalny chromatyny otrzymano przez wirowanie przy 14000 próbki poddano działaniu ultradźwięków przez 10 minut w temperaturze 48 ° C. Frakcję rozpuszczalną w rozcieńczeniu 1/10 w buforze do rozcieńczania (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCI), a następnie dzielono na porcje i przechowywano w temperaturze 80 ° C aż do użycia. (Rodriguez i wsp., 2008)