Ultradźwiękowe cięcie DNA

Podczas ścinania DNA i RNA długie cząsteczki DNA są fragmentowane na mniejsze kawałki, co jest kluczowym krokiem w przygotowaniu próbek do budowy biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Ultradźwiękowe ścinanie DNA wykorzystuje akustyczne siły kawitacji do rozbijania DNA lub RNA na fragmenty o wielkości od 100 bp do 5 kb. Metoda ta umożliwia precyzyjną kontrolę nad rozmiarem fragmentu, ułatwiając dostosowanie do pożądanej długości DNA w celu uzyskania optymalnych wyników sekwencjonowania.

Ścinanie DNA za pomocą ultradźwięków

Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania oparte na ultradźwiękach do ścinania DNA, RNA i chromatyny. Wybierz pomiędzy ultradźwiękami typu sondy (np. UP100H) do bezpośredniej sonikacji za pomocą mikrotipa lub użyj VialTweeeter lub ultradźwiękowego cuphorn do pośredniego przygotowania DNA różnych próbek jednocześnie. Hielscher oferuje idealne urządzenie, biorąc pod uwagę Twoje potrzeby: czy masz 1 lub do 10 próbek, objętości od mikrolitra do litra objętości – Sonikatory Hielscher spełnią Twoje wymagania w zakresie przygotowania fragmentów DNA, RNA i chromatyny o odpowiedniej długości. Powtarzalność, łatwa obsługa i precyzyjna kontrola pozwalają na uzyskanie niezawodnej biblioteki do sekwencjonowania następnej generacji.
W przeciwieństwie do enzymatycznej fragmentacji DNA, ścinanie ultradźwiękowe stosuje czyste mechaniczne siły ścinające bez dodawania jakichkolwiek chemikaliów. Dzięki precyzyjnemu ustawieniu parametrów procesu, ścinanie ultradźwiękowe wytwarza fragmenty DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (plazmid i genomowe DNA).
Oczyszczone kwasy nukleinowe mogą być amplifikowane przed lub po etapie fragmentacji.
Parametry sonikacji (moc, cykl impulsów? serie impulsów, czas i temperatura) można bezpiecznie kontrolować za pomocą ustawień oprogramowania.

Protokoły ultradźwiękowego ścinania DNA

Dla testu immunoprecypitacji chromatyny

W skrócie, komórki umieszczono w naczyniach o średnicy 60 mm (400 000 na naczynie) i transfekowano siRNA RhoA (jak opisano); po 72 godzinach inkubowano je z formaldehydem (stężenie końcowe, 1%) przez 10 minut w temperaturze 37°C w celu usieciowania białek z DNA. Reakcję sieciowania wygaszono przez dodanie jednej dziesiątej objętości 1,25 mol/L glicyny, co dało końcowe stężenie 125 mmol/L. Komórki przemyto dwukrotnie lodowatym PBS, ponownie zawieszono w buforze do testu radioimmunoprecypitacji [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% dezoksycholan, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] zawierającym 1 mmol/L fluorek fenylometylosulfonylu, 1 Ag/ml aprotyniny i 1 Ag/ml pepstatyny A i trzymano na lodzie przez 30 minut. Następnie lizaty komórkowe poddano sonikacji na lodzie za pomocą Hielscher UP200S ultradźwiękowy sonikator (3 x 40 s, amplituda 40%, cykl 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), aż usieciowane chromatyny zostały ścięte w celu uzyskania fragmentów DNA o wielkości od 200 do 1000 bp. Jedna dziesiąta całego lizatu została wykorzystana do ilościowego określenia ilości DNA obecnego w różnych próbkach i uznana za “całkowite wejściowe DNA”. Supernatanty inkubowano z 50% zawiesiną agarozy DNA/białko spermy łososia w celu zmniejszenia niespecyficznego tła. Immunoprecypitację przeprowadzono następnie przez noc w temperaturze 4°C z 5 Ag przeciwciała anty-NF-nB p65 (Upstate) lub bez przeciwciała (kontrola negatywna). Supernatanty te uzupełniono 5 mol/L NaCl i ogrzewano przez noc w temperaturze 65°C w celu odwrócenia wiązań krzyżowych białko-DNA. Immunokompleksy poddano dalszej obróbce wolną od DNazy i RNazy proteinazą K, a DNA oczyszczono przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącenie etanolem. PCR przeprowadzono za pomocą specyficznych starterów odpowiadających sekwencji w regionie promotora ludzkiego genu iNOS (starter p1: 5ś-GAGGGCTTCCCA- GAACCAAG-3ś; starter p2: GCTGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3ś). (Doublier et al., 2008)

Badania nad ekspresją EGFP

Do badań ekspresji, rekombinowany szczep L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Niemcy) z genem dla EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), zintegrowanym chromosomalnym ssu, był hodowany w różnych podłożach, jak opisano wcześniej i dodatkowo uzupełniony 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Niemcy). Podczas hodowli pobierano próbki o objętości 1 ml, odwirowywano je (2000 × g, 20°C, 10 min) i przemywano 0,9% roztworem NaCl. Pelet zawieszono ponownie w buforze (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i rozdrobniono przez sonifikację za pomocą procesora ultradźwiękowego UP400S (zastosowanie energii ∼ 400 Ws). Szczątki komórek usuwano przez wirowanie (6000 × g, 4°C, 5 min) i analizowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylu sodu (SDS-PAGE) w warunkach redukujących zgodnie z metodą Laemmli (1970) z 12,5% żelem poliakryloamidowym. Ekspresję EGFP badano w hodowli mieszanej. (Fritsche et al. 2007)

immunoprecypitacja chromatyny

Test immunoprecypitacji chromatyny przeprowadzono przy użyciu ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) zgodnie z instrukcją producenta z pewnymi modyfikacjami. Krótko mówiąc, zróżnicowane ludzkie podocyty usieciowano 1% formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto lodowatym PBS, a reakcję utrwalania zatrzymano przez dodanie 0,125 M glicyny przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Komórki ponownie przemyto lodowatym PBS i zeskrobano z naczynia. Komórki granulowano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w buforze do lizy. Po odwirowaniu, granulowane jądra zawieszono ponownie w buforze ścinającym, inkubowano na lodzie przez 30 minut, a chromatynę ścinano za pomocą sonikacji, np. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Niemcy) przy 25% mocy 5 impulsów po 20 sekund każdy na lodzie na fragmenty o wielkości około 200-600 bp. Ściętą chromatynę następnie odwirowano i zebrano supernatant. W przypadku immunoprecypitacji, 60 μl chromatyny inkubowano z 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) lub NF-κB p50 (Abcam) lub z króliczym IgG (Zymed Laboratories), jako kontrolą negatywną, przez noc w temperaturze 4°C z delikatnym obrotem. Immunokompleksy związane z kulkami magnetycznymi zebrano za pomocą stojaka magnetycznego, obficie przemyto, a wiązania krzyżowe białko/DNA odwrócono i wymyto DNA do analizy PCR w czasie rzeczywistym. (Ristola et al. 2009)

Przygotowanie DNA EHEC do analizy macierzy chipowej

Rozmieszczenie lizatów komórkowych i wyekstrahowanych DNA
Pelety bakteryjne zawieszone w PBS do pożądanego stężenia końcowego poddano działaniu Zakłócacz ultradźwiękowy UP100H (Hielscher GmbH, Niemcy) wyposażoną w mikrokońcówkę MS1 (o średnicy 1 mm). Częstotliwość robocza wynosiła 30 kHz, a efektywna moc wyjściowa 100 W. Podczas pracy próbki były chłodzone w łaźni wodnej z lodem, mieszane i odwirowywane. Próbki zostały wykorzystane do badań cytometrii przepływowej, natomiast do późniejszej obróbki, próbki zostały poddane obróbce cieplnej (95°C, 5 min). Surowe lizaty komórkowe poddano obróbce mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1). Równą objętość tej mieszaniny dodano do próbki lizatu, roztwór energicznie worteksowano przez 15 s i odwirowano przy 15 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej (RT) około 22°C. Górna faza wodna zawierająca genomowe DNA została ostrożnie oddzielona i zebrana do nowej sterylnej probówki Eppendorf.
Następnie próbki poddano sonikacji w celu fragmentacji DNA. Etap sonikacji przeprowadzono w takich samych warunkach, jak opisano powyżej. Aby ocenić wpływ fragmentacji na genomowe DNA, próbki analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
(…) Próbki poddane uprzednio sonikacji przez 2,5 minuty poddano etapowi ekstrakcji po obróbce cieplnej i odwirowaniu. Uwolnione DNA ekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy, a następnie poddano drugiej sonikacji przez 0 - 15 min. Elektroforeza w żelu agarozowym została wykorzystana do określenia rozkładu wielkości DNA poddanego poekstrakcyjnej fragmentacji ultradźwiękowej (rys. w prawym górnym rogu). Wysoce pofragmentowane DNA było widoczne na podstawie obecności rozmazu DNA, a nie pasm o wysokiej masie cząsteczkowej, które zostały wyeliminowane z próbek poddanych działaniu ultradźwięków przez 2,5 minuty lub dłużej. Dłuższa sonikacja stopniowo zmniejszała długość fragmentów do około 150 - 600 bp, a sonikacja przez 15 minut dodatkowo degradowała te fragmenty, co widać głównie w górnej części rozmazu. W ten sposób średnia wielkość fragmentu DNA stopniowo zmniejszała się wraz z czasem ultradźwięków, a 5-minutowa obróbka pozwoliła uzyskać rozmiary fragmentów DNA najbardziej odpowiednie do testów matrycowych. W końcu ustalono procedurę przygotowania analitu DNA obejmującą pierwsze 2 minuty obróbki ultradźwiękowej, ekstrakcję DNA (2 ×), a następnie 5-minutową sonikację. (Basselet et al. 2008)

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)

Komórki HEK293 hodowano w sposób opisany powyżej i utrwalano za pomocą 2 mM disukcynoimidylo-glutaranu przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS. Chromatynę sieciowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy użyciu 1% (v/v) formaldehydu i przemyto dwukrotnie lodowatym PBS. Reakcję sieciowania zatrzymano przez inkubację z glicyną w końcowym stężeniu 0,125 M przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji z trypsyną, komórki zeskrobano z szalki do hodowli komórkowej i przemyto dwukrotnie PBS. Osad komórek ponownie zawieszono w buforze lizującym (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubowano na lodzie przez 10 minut i homogenizowano za pomocą homogenizatora Dounce. Następnie jądra osuszono przez odwirowanie (3500 x g, 5 min, 4 °C) i ponownie zawieszono w buforze do jąder (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA i 1% (w/v) SDS). Jądra zostały rozbite przez sonikację z trzema 20-sekundowymi impulsami w Sonikator UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) przy ustawieniu cyklu 0,5 i amplitudzie 30%, uzyskując fragmenty genomowego DNA o wielkości 200 - 1000 bp. W przypadku ChIP, 50 g DNA rozcieńczono 4-krotnie w buforze do immunoprecypitacji (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 i 0,01% (w/v) SDS) (Weiske et al. 2006).

Analiza modyfikacji histonów za pomocą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

W skrócie, 6 x 10⁶ Komórki płukano dwukrotnie PBS i sieciowano na płytce hodowlanej przez 15 minut w temperaturze pokojowej w obecności 0,5% formaldehydu. Reakcję sieciowania zatrzymano przez dodanie 0,125 M glicyny. Wszystkie kolejne etapy przeprowadzono w temperaturze 48°C. Wszystkie bufory były wstępnie schłodzone i zawierały inhibitory proteaz (Complete Mini, Roche). Komórki przemyto dwukrotnie PBS, a następnie zeskrobano. Zebrane osady rozpuszczono w 1 ml buforu lizującego (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) i poddano sonikacji w zimnej łaźni etanolowej przez 10 cykli przy 100% amplitudzie przy użyciu Sonikator UP50H (Hielscher, Teltow, Niemcy). Fragmentację chromatyny wizualizowano w 1% żelu agarozowym. Uzyskane fragmenty mieściły się w zakresie 200-500pb. Rozpuszczalną chromatynę uzyskano przez odwirowanie próbek poddanych sonikacji przy 14 000g przez 10 minut w temperaturze 48°C. Rozpuszczalną frakcję rozcieńczono 1/10 w buforze rozcieńczającym (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), a następnie podzielono i przechowywano w temperaturze 80°C do czasu użycia. (Rodriguez et al. 2008)