Technologia ultradźwiękowa firmy Hielscher

Ultradźwiękowy DNA Ścinanie

  • Podczas ścinania DNA i RNA, cząsteczki DNA są podzielone na mniejsze kawałki. fragmentację DNA / RNA, jest jednym z najważniejszych etapów przygotowywania próbek niezbędnych do tworzenia bibliotek następnego sekwencjonowania generacji (NGS).
  • Ultradźwiękowy ścinanie DNA wykorzystuje sił kawitacji akustycznej rozbić DNA lub RNA, na kawałki 100 – 5KB BP.
  • Ultradźwiękowy ścinania umożliwia precyzyjne fragmentacji DNA i przystosowania do wymaganej długości DNA.

Ultradźwiękowy DNA Ścinanie

Hielscher Ultradźwięki oferuje różne rozwiązania ultradźwiękowych opartych na DNA, RNA i chromatyny ścinania. Wybór pomiędzy sonda typu ultrasonicators (np UP100H) do bezpośredniego ultradźwiękami stosując mikrokońcówek lub użyć VialTweeeter lub ultradźwiękowego cuphorn do pośredniego wytwarzania DNA z różnych próbek jednocześnie. Hielscher oferuje idealne urządzenie biorąc pod uwagę swoje potrzeby: pogoda masz 1 lub aż 10 próbek, wielkości od mikrolitrów do objętości litrowych – Hielscher ultradźwiękowe procesory są dostępne w celu spełnienia wymagań przygotowanie DNA, RNA i fragmenty chromatyny przy odpowiedniej długości. Powtarzalność, łatwa obsługa i precyzyjne sterowanie pozwala na niezawodne biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji.
W przeciwieństwie do fragmentacji DNA enzymatycznej ultradźwiękowe ścinanie stosuje się czyste siły ścinające mechanicznych bez dodawania jakichkolwiek środków chemicznych. Do dokładnego ustawienia parametrów procesu ultradźwiękowe ścinanie powoduje duże fragmenty DNA o dużym ciężarze cząsteczkowym (plazmid i genomowy DNA).
Oczyszczone kwasy nukleinowe mogą być wzmacniane, przed lub po etapie rozdrabniania.
Parametry sonikacyjne (Power, cykl impulsów / wybuchy, czas i temperatura) może być sterowany za pośrednictwem bezpiecznego ustawień oprogramowania.

Zalety:

  • precyzyjna kontrola
  • cykle sonikacji i razem dokładnie do dostosowania się do pożądanej wielkości DNA
  • Fragmenty DNA o wysokiej masie cząsteczkowej
  • kontrola temperatury
  • Szybki
  • powtarzalne wyniki
  • Sterylizacja w autoklawie
  • różne rozwiązania: Sonda typu, VialTweeter i Kuponik

Protokoły Ultrasonic DNA ścinających

Dla immunoprecypitacja chromatyny Test

W skrócie, komórki wysiewano na płytki o średnicy 60 mm (400 000 na szalkę) i transfekowano siRNA RhoA (jak opisano); po 72 godzinach inkubowano je z formaldehydem (stężenie końcowe, 1%) przez 10 minut w 37 ° C w celu usieciowania białek do DNA. Reakcję sieciowania przerwano przez dodanie jednej dziesiątej objętości 1,25 mola / litr glicyny, co dało końcowe stężenie 125 mmol / l. Komórki przemyto dwukrotnie lodowato zimnym PBS, ponownie zawieszono w buforze do oznaczania radioimmunoprecypitacji [150 mmol / l NaCl, 1% NP40, 0,5% dezoksycholanu, 0,1% SDS, 5 mmol / l EDTA, 50 mmol / l Tris-HCl (pH 8,0). )] zawierające 1 mmol / L fluorku fenylometylosulfonylu, 1 Ag / ml aprotyniny i 1 Ag / ml pepstatyny A i trzymano na lodzie przez 30 minut. Następnie lizaty komórkowe poddano działaniu ultradźwięków na lodzie z użyciem a Hielscher UP200S ultradźwięków ultradźwiękowej (3 x 40 s, amplituda 40%, cykl 1, Hielscher Ultradźwięki GmbH) aż usieciowanych chromatins wycięto z otrzymaniem fragmentów DNA wielkości od 200 do 1000 par zasad. Jedną dziesiątą całej lizatu stosuje się do oceny ilości DNA obecnego w różnych próbkach i uznanych “całkowity DNA wejście”, Supernatanty inkubowano z DNA spermy łososia / agarozą białka 50% zawiesiny w celu zmniejszenia niespecyficznego tła. Immunoprecypitacja zostało następnie wykonane przez noc w temperaturze 4 ° C z 5 Ag przeciw-NF-NB p65 (Upstate) lub bez przeciwciała (kontrola negatywna). Te supernatanty z dodatkiem 5 mola / l NaCl i ogrzewano przez noc w temperaturze 65 ° C do powrotu wiązań sieciujących białko-DNA. W immunologicznych traktowano następnie DNase- i RNaz proteinazy K i DNA oczyszczono za pomocą ekstrakcji fenol / chloroform i wytrącenie etanolem. PCR przeprowadzono za pomocą starterów specyficznych dla odpowiednich sekwencji w regionie promotora ludzkiego genu iNOS (P1 gruntujące 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶ P2 gruntujące GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier i wsp., 2008),

Badania ekspresji EGFP

Do badań ekspresji, rekombinowanego p10 szczep L. tarentolae :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Niemcy) z genem EGFP (zielone fluorescencyjne białko, Ulepszone) chromosomalne SSU zintegrowane hodowano w różnych mediach, jak opisano wcześniej, i dodatkowo uzupełnione 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Niemcy). Podczas uprawy 1 ml pobierano próbki, odwirowano (2000 x g, 20 ° C, 10 min) i przemyto 0,9% roztworem NaCl. Osad ponownie zawiesza się w buforze (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i rozpadały się sonifikacji z procesorem ultradźwiękowego UP400S (Zastosowanie energii ~ 400 Ws). Pozostałości komórkowe usuwano przez odwirowanie (6000 x g, 4 ° C, 5 min) i analizowano za pomocą siarczanu dodecylu sodu - elektroforezy na żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) w warunkach redukujących, według metody Laemmli (1970), 12,5% żelach polyacralamide , Ekspresję EGFP badano w kulturze mieszanej. (Fritsche i inni, 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Elektroforetyczną analizę genomowego DNA z E. coli EDL933 poddanego 0 - 15 min działaniu ultradźwięków. L oznacza DNA drabinka. (Basselet i wsp., 2008)

Zapytanie o informacje




Zwróć uwagę na nasze Polityka prywatności.


immunoprecypitacja chromatyny

Ultradźwiękowy Disruptor komórek UP100H (100W) do lizy, rozrywania komórek i ścinania DNA.Oznaczenie immunoprecypitacji chromatyny przeprowadzono stosując chip-ITTM Express (aktywny motyw, Carlsbad, CA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta z pewnymi modyfikacjami. W skrócie, ludzkie były zróżnicowane Podocyty usieciowany 1% formaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto lodowatym PBS i reakcję utrwalania zatrzymano dodając 0,125 M glicyny przez 5 min w temperaturze pokojowej. Komórki ponownie płukano lodowatym PBS, zdrapywano z naczynia. Komórki osadzono przez wirowanie i ponownie zawiesza się w buforze do lizy. Po odwirowaniu osad jądra zawieszano w buforze ścinania, inkubowano na lodzie przez 30 minut i chromatyny poddano działaniu sił ścinających, na przykład przez sonikację UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Niemcy) przy 25% mocy 5 pulsów po 20 s na lód na fragmentach o wielkości około 200-600 bp. Ścinaną chromatynę odwirowano i zebrano supernatant. W przypadku immunoprecypitacji 60 μl chromatyny inkubowano z 1 μg przeciwciał Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) lub NF-κB p50 (Abcam) lub królika IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), jako kontrolę ujemną, przez noc w 4 ° C z łagodną rotacją. Immunokompleksy związane z kulkami magnetycznymi zebrano przy użyciu stojaka magnetycznego, dokładnie przemyto, a wiązania poprzeczne białko / DNA odwrócono i DNA wymyto do analizy PCR w czasie rzeczywistym. (Ristola i wsp. 2009)

EHEC preparat DNA do analizy macierzy wiórów

Układ lizatów komórkowych i ekstrahowano DNA
Osady bakterii zawieszonych w PBS z żądanym końcowym stężeniu traktowano USG disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Niemcy) wyposażony w mikroukład MS1 (1 mm średnicy). Częstotliwość robocza wynosiła 30 kHz, a efektywna moc wyjściowa wynosiła 100 W. Podczas operacji próbki ochłodzono w łaźni lodowej, zmieszano i odwirowano. Próbki wykorzystano do badań cytometrii przepływowej, natomiast do późniejszego manipulowania próbki poddano obróbce cieplnej (95 ° C, 5 min). Surowe lizaty komórkowe przetwarzano mieszaniną fenolu: chloroform: alkohol izoamylowy (25: 24: 1). Równą objętość tej mieszaniny dodano do próbki lizatu, roztwór energicznie zworteksowano przez 15 s i odwirowano przy 15000 xg przez 2 min w temperaturze pokojowej (RT) około 22 ° C. Górną fazę wodną zawierającą genomowy DNA ostrożnie oddzielono i zebrano w nowej jałowej probówce Eppendorfa.
Następnie próbki poddano sonikacji w celu fragmentacji DNA. Etap sonikacji zrealizowano w takich samych warunkach, jak opisano powyżej. Aby ocenić wpływ fragmentacji na genomowy DNA, próbki analizowano przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym.
(…) Próbki poddane sonifikacji poprzednio przez 2,5 minuty poddano etapowi ekstrakcji po obróbce cieplnej i wirowaniu. Uwolnione DNA ekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenol: chloroform: alkohol izoamylowy, a następnie poddawano drugiej sonikacji przez 0 - 15 min. Do określenia rozkładu wielkości DNA poddanego fragmentacji ultradźwiękowej po ekstrakcji wykorzystano elektroforezę w żelu agarozowym (ryc. W prawym górnym rogu). Wysoko pofragmentowany DNA był widoczny z obecności rozmazu DNA, a nie z prążków o dużej masie cząsteczkowej, które zostały wyeliminowane z próbek poddanych działaniu ultradźwięków przez 2,5 minuty lub dłużej. Dłuższa sonikacja stopniowo zmniejszała długość fragmentów do około 150-600 bp, a sonikacja przez 15 minut dalej degradowała te fragmenty, co widać głównie w górnej części rozmazu. W związku z tym średnia wielkość fragmentu DNA stopniowo zmniejszała się wraz z czasem ultrasonikacji, a obróbka 5-minutowa pozwalała uzyskać rozmiary fragmentów DNA najbardziej odpowiednich do testów na układy z chipem. W końcu ustalono procedurę otrzymywania analitu DNA obejmującą pierwsze 2 min obróbki ultradźwiękowej, ekstrakcję DNA (2 x), a następnie 5 minutową sonikację. (Basselet i wsp. 2008)

Immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Procesor ultradźwiękowy UP100H do cięcia DNA, RNA i chromatyny. (Kliknij, aby powiększyć!)Komórki HEK293 hodowano jak opisano powyżej i utrwalano 2 mM glutaranu disukcynimidylu przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS. Chromatynę usieciowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej, stosując 1% (v / v) formaldehyd i przemyto dwukrotnie lodowatym PBS. Reakcję sieciowania zatrzymano przez inkubację z glicyną w końcowym stężeniu 0,125 M przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji z trypsyną komórki zdrapano z naczynia do hodowli komórkowej i przemyto dwukrotnie PBS. Osad komórkowy ponownie zawieszono w buforze do lizy (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v / v) Nonidet P-40), inkubowano na lodzie przez 10 min i homogenizowano za pomocą homogenizatora Dounce. Następnie jądra osadzono przez odwirowanie (3500 xg, 5 min, 4 ° C) i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze jądrowym (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA i 1% (wag./obj.) SDS). Jądra zostały zakłócone przez sonikację trzema 20-s impulsami w UP50H terapii ultradźwiękowej (Hielscher Ultraschall Technologie) przy ustawieniu cyklu 0,5 i amplituda 30%, uzyskując fragmenty genomowego DNA o wielkości nasypowej 200 - 1000 bp. Wióra, 50g DNA rozcieńcza się 4-krotnie w buforze do immunoprecypitacji (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 i 0,01% (wagowo / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza modyfikacji histonów przez immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Pokrótce, 6 x 106 Komórki przemyto dwukrotnie PBS i usieciowany na płytce do hodowli na 15 minut w temperaturze pokojowej w obecności 0,5% aldehydu mrówkowego. reakcję sieciowania zatrzymano przez dodanie 0,125 M glicyny. Wszystkie kolejne etapy były przeprowadzane w temperaturze 48 ° C. Wszystkie bufory wstępnie schłodzone i zawierał inhibitorów proteazy (Complete mini, Roche). Komórki przemyto dwukrotnie PBS, a następnie do zgarniania. Uzyskane granulki rozpuszcza się w 1 ml buforu do lizy (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8) i poddano działaniu ultradźwięków na łaźni z zimną etanolu przez 10 cykli przy 100% amplitudy stosując spektrofotometr UP50H terapii ultradźwiękowej (Hielscher, Teltow, Niemcy). Fragmentacja chromatyny uwidoczniono w 1% żelu agarozowym. Otrzymane fragmenty były w 200-500pb zakresu. Rozpuszczalny chromatyny otrzymano przez wirowanie przy 14000 próbki poddano działaniu ultradźwięków przez 10 minut w temperaturze 48 ° C. Frakcję rozpuszczalną w rozcieńczeniu 1/10 w buforze do rozcieńczania (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCI), a następnie dzielono na porcje i przechowywano w temperaturze 80 ° C aż do użycia. (Rodriguez i wsp., 2008)

Urządzenie Moc [W] Rodzaj Objętość [ml]
VialTweeter 200 samodzielny 00,5 1.5
UP50H 50 ręczny lub wolnostojące kolumny 00,01 250
UP100H 100 ręczny lub wolnostojące kolumny 00,01 Processor ultradźwiękowe 500
UP200Ht 200 ręczny lub wolnostojące kolumny 00,1 1000
UP200St 200 wolnostojące kolumny 00,1 1000
UP400St 400 wolnostojące kolumny 5.0 2000
Kuponik 200 CupHorn, sonoreaktor. 10 200
GDmini2 200 kontaminacji kuweta przepływowa

Zapytanie o informacje




Zwróć uwagę na nasze Polityka prywatności.


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter do przygotowania próbki ultradźwiękowej

Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!

Poproś o więcej informacji

Skorzystaj z formularza poniżej, jeśli chcesz zażądać dodatkowych informacji na temat ultradźwiękowej homogenizacji. Chętnie zaoferujemy Państwu system ultradźwiękowy, spełniający Państwa wymagań.









Proszę zwrócić uwagę na nasze Polityka prywatności.


Literatura / Referencje

  • Basselet P. Węgrzyn G. Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008) do przetwarzania próbek do analizy chipy DNA z użyciem macierzy z enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC). Mikrobiologiczne Fabryki komórkowe 7:29. 2008.
  • . Doublier S. Riganti Ch, Voena C Costamagna C Aldieri E. Pescarmona G. Ghigo D. Bosia A. (008) RhoA tłumiący Cofa odporność na doksorubicyny w komórkach ludzkiego raka jelita grubego. Cząsteczkowej Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E. Gidlund A. Olsen M. Börjesson T. Spliid NHH, Simonsson, M. (2008): Ocena metody ekstrakcji DNA z grzybni Fusarium i pszenicy na dół strumienia w czasie rzeczywistym i oznaczania ilościowego PCR korelacji poziomów mikotoksyn , Journal of Mikrobiologiczne metody 2008.
  • Fritsche C Sitz M., Weiland N., Breitling R. Pohl H.-D. (2007) Characterization zachowania wzrostu Leishmania tarentolae - nowego systemu ekspresji dla rekombinowanych białek. Journal of Microbiology 47 Podstawowy 2007. 384-393.
  • Ristola M. Arpiainen S. Salim M. A. Mathieson P. W. G. I. Welsh, Lehtonen S. Holthöfer H. (2009): Regulacja Neph3 genu podocytów - kluczowe role czynników transkrypcyjnych NF-kB i SP1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Rodriguez J. Vives L. Jorda M. Morales C Munoz M. Vendrell E. Peinado M. A. (2008): Genome, szeroki śledzenia niemetylowanego DNA Alu powtarzany w warunkach normalnych i nowotworowych komórek. Acids Cz. 36, nr 3, 2008 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): His Triad Protein Hint1 wyzwalacze apoptozy niezależna od jej aktywności enzymatycznej. The Journal of Biological Chemistry. Cz. 281, nr 37, 2006 27356-27366.


Fakty Warto wiedzieć

Ultradźwiękowy / kawitacja akustyczna tworzy bardzo intensywne siły, które promuje procesy krystalizacji i wytrącanie (kliknij aby powiększyć!)

Ultradźwiękowy ścinanie DNA jest oparta na kawitacji akustycznej i jego hydrodynamicznych sił ścinających