Ultradźwiękowe ścinanie DNA

Podczas ścinania DNA i RNA długie cząsteczki DNA są fragmentowane na mniejsze części, co stanowi kluczowy etap przygotowania próbek do tworzenia bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Ultradźwiękowe ścinanie DNA wykorzystuje siły kawitacji akustycznej do rozbijania DNA lub RNA na fragmenty o długości od 100 bp do 5 kb. Metoda ta umożliwia precyzyjną kontrolę wielkości fragmentów, ułatwiając dostosowanie ich do pożądanej długości DNA w celu uzyskania optymalnych wyników sekwencjonowania.

Ścinanie DNA za pomocą ultradźwięków

Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania oparte na ultradźwiękach do ścinania DNA, RNA i chromatyny. Wybierz sonikator z sondą (np. UP100H) do bezpośredniej sonikacji przy użyciu mikrokońcówki albo zastosuj VialTweeeter lub ultradźwiękowy cuphorn do pośredniego przygotowania DNA z różnych próbek jednocześnie. Hielscher oferuje idealne urządzenie dostosowane do Twoich potrzeb: niezależnie od tego, czy masz 1 próbkę, czy do 10 próbek, o objętościach od mikrolitrów do litrów – sonikatory Hielscher spełnią Twoje wymagania dotyczące przygotowania fragmentów DNA, RNA i chromatyny o odpowiedniej długości. Powtarzalność, łatwa obsługa i precyzyjna kontrola pozwalają uzyskać wiarygodną bibliotekę do sekwencjonowania nowej generacji.
W przeciwieństwie do enzymatycznej fragmentacji DNA ścinanie ultradźwiękowe wykorzystuje wyłącznie mechaniczne siły ścinające, bez dodawania jakichkolwiek substancji chemicznych. Dzięki precyzyjnemu ustawieniu parametrów procesu ścinanie ultradźwiękowe pozwala uzyskać fragmenty DNA o dużej masie cząsteczkowej (DNA plazmidowe i genomowe).
Oczyszczone kwasy nukleinowe można amplifikować przed etapem fragmentacji lub po nim.
Parametry sonikacji (moc, cykl impulsowy / serie impulsów, czas i temperatura) można bezpiecznie kontrolować za pomocą ustawień oprogramowania.

Protokoły ultradźwiękowego ścinania DNA

Do badania immunoprecypitacji chromatyny

W skrócie, komórki wysiano na szalki o średnicy 60mm (400 000 na szalkę) i transfekowano siRNA RhoA (zgodnie z opisem); po 72 h inkubowano je z formaldehydem (stężenie końcowe 1%) przez 10 min w 37°C w celu usieciowania białek z DNA. Reakcję sieciowania zatrzymano przez dodanie jednej dziesiątej objętości glicyny o stężeniu 1,25 mol/L, uzyskując stężenie końcowe 125 mmol/L. Komórki przemyto dwukrotnie lodowato zimnym PBS, ponownie zawieszono w buforze do radioimmunoprecypitacji [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksycholanu, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] zawierającym 1 mmol/L fluorku fenylometylosulfonylu, 1 Ag/mL aprotyniny i 1 Ag/mL pepstatyny A, a następnie trzymano na lodzie przez 30 min. Następnie lizaty komórkowe poddano sonikacji na lodzie za pomocą sonikatora ultradźwiękowego Hielscher UP200S (3 x 40 s, amplituda 40%, cykl 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), aż usieciowaną chromatynę pocięto, uzyskując fragmenty DNA o długości od 200 do 1 000 bp. Jedną dziesiątą całego lizatu wykorzystano do ilościowego oznaczenia DNA obecnego w różnych próbkach i uznano za „całkowite DNA wejściowe”. Supernatanty inkubowano z 50% zawiesiną DNA plemników łososia / białka na agarozie w celu zmniejszenia nieswoistego tła. Następnie przeprowadzono immunoprecypitację przez noc w 4°C z 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) lub bez przeciwciała (kontrola ujemna). Do tych supernatantów dodano NaCl o stężeniu 5 mol/L i ogrzewano je przez noc w 65°C w celu odwrócenia sieciowania białko–DNA. Kompleksy immunologiczne poddano następnie działaniu proteinazy K wolnej od DNaz i RNaz, a DNA oczyszczono przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolem. PCR przeprowadzono ze swoistymi starterami odpowiadającymi sekwencji w regionie promotorowym ludzkiego genu iNOS (starter p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; starter p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Badania ekspresji EGFP

Do badań ekspresji rekombinowany szczep L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Niemcy), z genem EGFP (białka o wzmocnionej zielonej fluorescencji) zintegrowanym w chromosomowym locus ssu, hodowano na różnych podłożach zgodnie z wcześniejszym opisem, dodatkowo uzupełnionych o 100 mg l^-1 nourseotrycyny (Jena Bioscience, Niemcy). Podczas hodowli pobierano próbki o objętości 1 ml, wirowano je (2000 × g, 20°C, 10 min) i przemywano roztworem 0,9% NaCl. Osad ponownie zawieszono w buforze (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i poddano dezintegracji przez sonikację za pomocą procesora ultradźwiękowego UP400S (dostarczona energia ∼ 400 Ws). Resztki komórkowe usunięto przez wirowanie (6000 × g, 4°C, 5 min) i analizowano metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) w warunkach redukujących według metody Laemmliego (1970), stosując żele poliakrylamidowe o stężeniu 12,5%. Ekspresję EGFP badano w hodowli wytrząsanej. (Fritsche et al. 2007)

Immunoprecypitacja chromatyny

Badanie immunoprecypitacji chromatyny przeprowadzono przy użyciu ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta, z pewnymi modyfikacjami. W skrócie, zróżnicowane ludzkie podocyty usieciowano przy użyciu 1% formaldehydu przez 10 min w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto lodowato zimnym PBS, a reakcję utrwalania zatrzymano przez dodanie 0,125 M glicyny na 5 min w temperaturze pokojowej. Komórki ponownie przemyto lodowato zimnym PBS i zeskrobano z szalki. Komórki osadzono przez wirowanie i ponownie zawieszono w buforze do lizy. Po wirowaniu osadzone jądra ponownie zawieszono w buforze do ścinania, inkubowano na lodzie przez 30 min, a chromatynę pocięto przez sonikację, np. przy użyciu UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Niemcy) przy 25% mocy, stosując na lodzie 5 impulsów po 20 s każdy, na fragmenty o długości około 200–600 bp. Pociętą chromatynę następnie odwirowano i zebrano supernatant. W celu immunoprecypitacji 60 μl chromatyny inkubowano z 1 μg przeciwciał przeciwko Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) lub NF-κB p50 (Abcam) albo z króliczą IgG (Zymed Laboratories), stanowiącą kontrolę ujemną, przez noc w 4°C, delikatnie obracając próbki. Kompleksy immunologiczne związane z kulkami magnetycznymi zebrano przy użyciu statywu magnetycznego, dokładnie przemyto, odwrócono sieciowanie białko/DNA i eluowano DNA do analizy metodą PCR w czasie rzeczywistym. (Ristola et al. 2009)

Przygotowanie DNA EHEC do analizy mikromacierzowej

Przygotowanie lizatów komórkowych i wyekstrahowanego DNA
Osady bakteryjne zawieszone w PBS do pożądanego stężenia końcowego poddano działaniu ultradźwiękowego urządzenia do rozbijania komórek UP100H (Hielscher GmbH, Niemcy) wyposażonego w mikrokońcówkę MS1 (o średnicy 1mm). Częstotliwość robocza wynosiła 30 kHz, a efektywna moc wyjściowa 100 W. Podczas pracy próbki chłodzono w kąpieli lodowo-wodnej, mieszano i wirowano. Próbki wykorzystano do badań cytometrii przepływowej, natomiast do dalszego przetwarzania poddano je obróbce cieplnej (95°C, 5 min). Surowe lizaty komórkowe poddano działaniu mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1). Do próbki lizatu dodano równą objętość tej mieszaniny, roztwór intensywnie mieszano na worteksie przez 15 s i wirowano przy 15 000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej (RT), około 22°C. Górną fazę wodną zawierającą genomowe DNA ostrożnie oddzielono i zebrano w nowej, sterylnej probówce Eppendorf.
Następnie próbki poddano sonikacji w celu fragmentacji DNA. Etap sonikacji przeprowadzono w takich samych warunkach, jak opisano powyżej. Aby ocenić wpływ fragmentacji na genomowe DNA, próbki analizowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym.
(…) Próbki poddane wcześniej sonikacji przez 2,5 min poddano etapowi ekstrakcji po obróbce cieplnej i wirowaniu. Uwolnione DNA ekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy, a następnie poddano drugiej sonikacji przez 0 – 15 min. Elektroforezę w żelu agarozowym wykorzystano do określenia rozkładu wielkości DNA poddanego ultradźwiękowej fragmentacji po ekstrakcji (rys. w prawym górnym rogu). O silnej fragmentacji DNA świadczyła obecność smugi DNA zamiast prążków o dużej masie cząsteczkowej, które zanikały w próbkach poddanych sonikacji przez 2,5 min lub dłużej. Dłuższa sonikacja stopniowo zmniejszała długość fragmentów do około 150 – 600 bp, a sonikacja przez 15 min powodowała dalszą degradację tych fragmentów, co widać głównie w górnej części smugi. Zatem średnia wielkość fragmentów DNA stopniowo malała wraz z czasem działania ultradźwięków, a obróbka przez 5 min pozwoliła uzyskać wielkości fragmentów DNA najbardziej odpowiednie do badań mikromacierzowych. Ostatecznie ustalono procedurę przygotowania analitu DNA obejmującą najpierw 2 min obróbki ultradźwiękowej, ekstrakcję DNA (2×), a następnie sonikację przez 5 min. (Basselet et al. 2008)

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)

Komórki HEK293 hodowano zgodnie z powyższym opisem i utrwalano przy użyciu 2 mM glutaranu disukcynimidylu przez 45 min w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS. Chromatynę usieciowano przez 10 min w temperaturze pokojowej przy użyciu 1% (v/v) formaldehydu i przemyto dwukrotnie lodowato zimnym PBS. Reakcję sieciowania zatrzymano przez inkubację z glicyną o stężeniu końcowym 0,125 M przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji z trypsyną komórki zeskrobano z szalki hodowlanej i przemyto dwukrotnie PBS. Osad komórkowy ponownie zawieszono w buforze do lizy (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubowano na lodzie przez 10 min i homogenizowano za pomocą homogenizatora Dounce’a. Następnie jądra osadzono przez wirowanie (3500 x g, 5 min, 4 °C) i ponownie zawieszono w buforze do jąder (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA i 1% (w/v) SDS). Jądra rozbito przez sonikację z zastosowaniem trzech impulsów po 20 s w sonikatorze UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) przy ustawieniu cyklu 0,5 i amplitudy 30%, uzyskując fragmenty genomowego DNA o długości przeważnie 200 – 1000 bp. Do ChIP 50g DNA rozcieńczono 4-krotnie w buforze do immunoprecypitacji (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 i 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza modyfikacji histonów metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

W skrócie, 6 x 10⁶ komórek przemyto dwukrotnie PBS i usieciowano na płytce hodowlanej przez 15 min w temperaturze pokojowej w obecności 0,5% formaldehydu. Reakcję sieciowania zatrzymano przez dodanie 0,125 M glicyny. Wszystkie kolejne etapy przeprowadzono w 48°C. Wszystkie bufory były wstępnie schłodzone i zawierały inhibitory proteaz (Complete Mini, Roche). Komórki przemyto dwukrotnie PBS, a następnie zeskrobano. Zebrane osady rozpuszczono w 1 ml buforu do lizy (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) i poddano sonikacji w zimnej kąpieli etanolowej przez 10 cykli przy 100% amplitudy, używając sonikatora UP50H (Hielscher, Teltow, Niemcy). Fragmentację chromatyny uwidoczniono w 1% żelu agarozowym. Uzyskane fragmenty mieściły się w zakresie 200–500pb. Rozpuszczalną chromatynę uzyskano przez wirowanie próbek poddanych sonikacji przy 14 000g przez 10 min w 48°C. Frakcję rozpuszczalną rozcieńczono w stosunku 1/10 w buforze do rozcieńczania (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), następnie podzielono na porcje i przechowywano w 80°C do użycia. (Rodriguez et al. 2008)