Przygotowanie plazmidu przy użyciu ultradźwięków

Ultradźwięki to niezawodna technika fragmentacji plazmidowego DNA. Precyzyjnie kontrolowana amplituda, tryb pulsacji i kontrola temperatury są najważniejszymi cechami ultrasonografu do nieuszkadzającej fragmentacji plazmidu. Dodatkowo, stosowanie niektórych środków pomaga chronić przed degradacją plazmidu. Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania do kontrolowanej fragmentacji plazmidów z pojedynczych fiolek, jednocześnie sonikacji wielu próbek, jak również płytek wielodołkowych. Dowiedz się więcej o skutecznej ultradźwiękowej fragmentacji plazmidów!

Ścinanie plazmidu za pomocą ultradźwięków

Gdy próbki DNA są poddawane działaniu fal ultradźwiękowych, generowane ultradźwiękowo wibracje tworzą kawitację akustyczną w cieczy, która ścina lub rozbija cząsteczki DNA o wysokiej masie cząsteczkowej za pomocą sił mechanicznych. Sonikacja jest najczęściej stosowaną metodą do masowych eksperymentów ścinania DNA, w tym zastosowań, takich jak immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), dla których małe rozmiary fragmentów są absolutnie niezbędne do uzyskania wysokiej rozdzielczości. (por. Tseng et al., 2012)
Plazmidowe DNA (pDNA) to specyficzna forma DNA, charakteryzująca się pierścieniowym kształtem i występująca u bakterii i niektórych eukariontów.
Supercoiled pDNA jest pożądaną formą plazmidowego DNA, ponieważ wykazuje najlepsze wyniki w procesach down-stream, takich jak automatyczne sekwencjonowanie i transfekcja. Ultradźwięki są odpowiednie do skutecznej fragmentacji pDNA, w tym superzwiniętego pDNA.
Thompson i wsp. (2008) wykazali, że sonikacja plazmidu, o której wiadomo, że fragmentuje superzwinięte DNA, jest skutecznym sposobem na poprawę długości odczytów sekwencji phred20 do punktu, w którym nie różnią się one znacząco od szablonu kontrolnego Beckman Coulter lub plazmidów linearyzowanych enzymatycznie.

Wykorzystanie wektorów plazmidowych

Plazmidy są często wykorzystywane jako narzędzia do klonowania, przenoszenia i manipulowania genami. Gdy plazmidy są wykorzystywane eksperymentalnie do tych celów, nazywane są wektorami. Fragmenty DNA lub geny mogą być wstawiane do wektora plazmidowego, tworząc tak zwany rekombinowany plazmid. Wektory plazmidowe są wykorzystywane jako nośniki do wprowadzania rekombinowanego DNA do komórki gospodarza i są kluczowym elementem klonowania molekularnego.
“Wektory niewirusowe są intensywnie badane pod kątem ich potencjalnego zastosowania w terapii genowej w leczeniu różnych skomplikowanych chorób. Wektory niewirusowe chronią plazmidowe DNA przed degradacją fizyczną, chemiczną i enzymatyczną oraz dostarczają cząsteczkę DNA do miejsca docelowego. Na przykład, kationowe liposomy, chitozan i inne dodatnio naładowane nanocząsteczki tworzą kompleksy z plazmidowym DNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Jednak łatwo tworzące się kationowe liposomy/kompleksy plazmidowego DNA są stosunkowo duże (tj. 300-400 nm) i niejednorodne, co utrudnia ich wykorzystanie w zastosowaniach farmaceutycznych. Duże i heterogeniczne kompleksy plazmidowe DNA/liposomy, plazmidowe DNA/aerozole i plazmidowe DNA/peptydy można zredukować do mniejszych i jednorodnych cząstek za pomocą ultradźwięków.” (Sarker i in., 2019)
Znanym przykładem zastosowania wektorów plazmidowych jest CRISPR-Cas9. System CRISPR-Cas9 jest zwykle dostarczany do komórek w postaci pojedynczego dużego plazmidu lub wielu mniejszych plazmidów, które kodują sekwencję docelową, prowadnicę CRISPR i Cas9.

Ultradźwiękowy preparat nanocząstek PLGA obciążonych DNA przez nanoprecypitację

Jo et al. (2020) wykorzystali poli(kwas mlekowy-co-glikolowy) (PLGA) w celu utworzenia nanocząsteczkowego nośnika do dostarczania modelowego plazmidu CRISPR-Cas9 do pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Do nanoprecypitacji nanocząstek PLGA zastosowano PLGA z dwiema różnymi grupami końcowymi (estrową i aminową) w celu zwiększenia wydajności enkapsulacji i obciążenia przez dodatnio naładowane końcówki aminowe ze względu na interakcje ładunku między nimi a ujemnie naładowanym szkieletem DNA. W polipropylenowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, 100 mg Pluronic F127 rozpuszczono w 20 ml autoklawowanej wody DI przez mieszanie worteksem, a następnie 30 minut delikatnej sonikacji przy użyciu łaźni ultradźwiękowej (zobacz CupHorn). Dodano autoklawowaną mieszarkę magnetyczną i mieszano roztwór z prędkością 600 obrotów na minutę przez 30 minut, podczas gdy inne roztwory były przygotowywane. Aby zminimalizować niespecyficzną adsorpcję DNA, zamiast naczyń szklanych użyto plastikowych naczyń laboratoryjnych. Osobno sporządzono roztwory PLGA rozpuszczonego w DMF (44,48 mg/ml) i pentacenu TIPS rozpuszczonego w THF (0,667 mg/ml). PLGA pozostawiono w spokoju do zwilżenia w DMF przez 30 minut, a następnie poddano sonikacji przez 30 minut (pełny protokół patrz Jo i in., 2020).

Ochrona plazmidowego DNA podczas sonikacji

DNA, w tym plazmidy i superzwinięte plazmidy, są bardzo wrażliwe na degradację. Wszystkie dostępne metody fragmentacji są znane z pewnych wad. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest jedną z preferowanych metod, ponieważ kontrolowana sonikacja w połączeniu ze środkami ochronnymi pozwala zmniejszyć indukowane ścinaniem i ciepłem uszkodzenie nici DNA.
Oprócz ustawień niskiej amplitudy, trybu pulsacji i kontroli temperatury podczas ultradźwiękowego ścinania DNA, zastosowanie niektórych środków wykazało znaczący efekt ochronny przed degradacją DNA. Na przykład różne polimery, peptydy i lipidy chronią plazmidowe DNA podczas ultradźwięków.

Stabilność plazmidowego DNA i nanokompleksów plazmidowego DNA/IL przed ultradźwiękowym naprężeniem ścinającym badano za pomocą testu elektroforezy w żelu agarozowym. Zarówno plazmidowe DNA, jak i nanokompleksy plazmidowe DNA/IL poddano działaniu ultradźwiękowego naprężenia ścinającego w różnych punktach czasowych. Plazmidowe DNA poddano działaniu ultradźwiękowego naprężenia ścinającego przez 0, 10, 20, 30 i 40 minut. Natomiast nanokompleksy plazmidowego DNA/IL poddawano działaniu ultradźwiękowego naprężenia ścinającego przez 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minut.
(badanie i zdjęcie: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) wykazali, że gdy nanostruktury plazmidowego DNA / cieczy jonowej (pDNA/IL) poddawano ultradźwiękowemu naprężeniu ścinającemu przez 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minut i kompleksowano z dostępnym w handlu kationowym środkiem do dostarczania genów lipofektaminą, odsetek fluorescencyjnie dodatnich komórek wynosił odpowiednio 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% i 50% (patrz wykres poniżej). Odsetek fluorescencyjnie pozytywnych komórek wzrósł, gdy nanostruktury poddano ultradźwiękowemu naprężeniu ścinającemu przez 10 i 20 minut, a następnie powoli spadał.

Wpływ cieczy jonowej [Bmim][PF6] na dostarczanie plazmidowego DNA do komórek COS7. Nanokompleksy plazmidowego DNA/IL (ciecz jonowa) poddano działaniu ultradźwiękowego naprężenia ścinającego przez 120 minut i skompleksowano z LA przed dostarczeniem do komórek COS7. Dane pokazują średnią liczbę (%) pozytywnych komórek HeLa GFP zliczonych w 10 różnych polach mikroskopowych, a eksperyment przeprowadzono wielokrotnie w ciągu trzech różnych dni. (Badanie i wykres: ©Sarker et al., 2019)

Ultradźwiękowe przygotowanie lizatu

Protokół ultradźwiękowej lizy komórek
Rozpocznij od wzbogaconej próbki komórek, która została przygotowana za pomocą metody separacji komórek (np. immunomagnetyczna separacja komórek, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), wirowanie w gradiencie gęstości, izolacja komórek immunodensity).
Próbki komórek muszą wykazywać objętość buforu lizującego, która jest odpowiednia dla celu eksperymentalnego i ultrasonografu typu sondy.
Preferowane są bufory hipotoniczne, ponieważ zwiększają one ultradźwiękową lizę komórek. Ważne jest, aby dodatki i stężenie soli były stosowane w odpowiedni sposób.
Wybierz urządzenie do lizy ultradźwiękowej: Do pośredniej sonikacji fiolek zalecane są VialTweeter lub CupHorn. W przypadku płytek wielodołkowych, UIP400MTP jest idealnym ultrasonicatorem. A klasyczna sonikacja typu sondy, homogenizator ultradźwiękowy jak UP100H lub UP200Ht z mikro-końcówką są najbardziej odpowiednie.
Protokół sonikacji typu sonda: Umieścić sondę ultradźwiękową w objętości próbki w probówce do mikrowirówki i sonifikować przez około 10 sekund. W zależności od próbki DNA, sonikację można powtórzyć jeszcze jeden lub dwa razy. Wymagany wkład energii ultradźwiękowej (Ws / ml) zależy od lepkości próbki i rodzaju DNA. Chłodzenie za pomocą łaźni lodowej i trybu pulsacyjnego ultrasonografu pomaga zapobiegać termicznej degradacji próbki.
Po lizie ultradźwiękowej próbka jest odwirowywana w celu oddzielenia resztek osadu (zawierających nieusunięte komórki, jądra i nieusunięte organelle).
Jeśli próbka nie jest natychmiast poddawana dalszemu przetwarzaniu, może być przechowywana w odpowiedniej temperaturze w celu zachowania jej żywotności.

Ultradźwięki do fragmentacji DNA

Hielscher Ultrasonics oferuje różne platformy oparte na ultradźwiękach do fragmentacji DNA, RNA i chromatyny. Te różne platformy obejmują sondy ultradźwiękowe (sonotrody), pośrednie rozwiązania sonikacyjne do jednoczesnego przygotowywania próbek z wielu probówek lub płytek wielodołkowych (np. płytek 96-dołkowych, płytek do mikromiareczkowania), sonoreaktorów i rogów ultradźwiękowych. Wszystkie platformy do ścinania DNA są zasilane przez dostrojone częstotliwościowo, wysokowydajne procesory ultradźwiękowe, które są precyzyjnie kontrolowane i zapewniają powtarzalne wyniki.

Procesory ultradźwiękowe dla dowolnej liczby i wielkości próbek

Dzięki wielopróbkowym ultrasonikatorom VialTweeter firmy Hielscher (do 10 probówek) i UIP400MTP (do mikropłytek / płytek wielodołkowych) staje się łatwo możliwe skrócenie czasu przetwarzania próbki dzięki intensywnej i precyzyjnie kontrolowanej ultrasonizacji przy jednoczesnym uzyskaniu pożądanego rozkładu wielkości fragmentów DNA i wydajności. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA sprawia, że etapy przygotowania plazmidu są wydajne, niezawodne i skalowalne. Protokoły mogą być liniowo skalowane od jednej do wielu próbek poprzez zastosowanie stałych parametrów ultradźwiękowych.
Ultradźwięki sondy z jednym do pięciu palców są idealne do przygotowania mniejszych ilości próbek. Ultrasonografy laboratoryjne firmy Hielscher są dostępne z różnymi poziomami mocy, dzięki czemu można wybrać idealny ultradźwiękowy zakłócacz do zastosowań związanych z DNA.