Przygotowanie plazmidów z wykorzystaniem ultradźwięków

Ultradźwięki są niezawodną techniką fragmentacji plazmidowego DNA. Precyzyjnie regulowana amplituda, tryb pulsacyjny i kontrola temperatury to najważniejsze cechy sonikatora umożliwiającego fragmentację plazmidów bez ich uszkadzania. Ponadto stosowanie określonych substancji pomaga chronić plazmidy przed degradacją. Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania do kontrolowanej fragmentacji plazmidów w pojedynczych fiolkach, jednoczesnej sonikacji licznych próbek oraz sonikacji płytek wielodołkowych. Dowiedz się więcej o skutecznej ultradźwiękowej fragmentacji plazmidów!

Ścinanie plazmidów z wykorzystaniem ultradźwięków

Gdy próbki DNA są poddawane działaniu fal ultradźwiękowych, drgania generowane przez ultradźwięki wywołują w cieczy kawitację akustyczną, która poprzez działanie sił mechanicznych ścina lub rozrywa cząsteczki DNA o dużej masie cząsteczkowej. Sonikacja jest najczęściej stosowaną metodą w eksperymentach obejmujących ścinanie DNA w dużych ilościach, w tym w zastosowaniach takich jak immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), w których małe rozmiary fragmentów są absolutnie kluczowe dla uzyskania wysokiej rozdzielczości. (por. Tseng et al., 2012)
Plazmidowe DNA (pDNA) jest szczególną formą DNA, charakteryzującą się kolistym kształtem i występującą u bakterii oraz niektórych eukariontów.
Superskręcone pDNA jest pożądaną formą plazmidowego DNA, ponieważ daje najlepsze wyniki w dalszych etapach procesu, takich jak zautomatyzowane sekwencjonowanie i transfekcja. Ultradźwięki nadają się do skutecznej fragmentacji pDNA, w tym superskręconego pDNA.
Thompson et al. (2008) wykazali, że sonikacja plazmidów, o której wiadomo, że powoduje fragmentację superskręconego DNA, jest skutecznym sposobem zwiększenia długości odczytów sekwencji o jakości phred20 do poziomu, na którym nie różnią się one istotnie od odczytów uzyskanych z matrycy kontrolnej Beckman Coulter lub plazmidów zlinearyzowanych enzymatycznie.

Zastosowanie wektorów plazmidowych

Plazmidy są często wykorzystywane jako narzędzia do klonowania, przenoszenia i modyfikowania genów. Gdy plazmidy są stosowane do tych celów w eksperymentach, nazywa się je wektorami. Fragmenty DNA lub geny można wprowadzić do wektora plazmidowego, tworząc tak zwany plazmid rekombinowany. Wektory plazmidowe służą jako nośniki do wprowadzania rekombinowanego DNA do komórki gospodarza i są kluczowym elementem klonowania molekularnego.
„Wektory niewirusowe są intensywnie badane pod kątem ich potencjalnego zastosowania w terapii genowej w leczeniu różnych złożonych chorób. Wektory niewirusowe chronią plazmidowe DNA przed degradacją fizyczną, chemiczną i enzymatyczną oraz dostarczają cząsteczkę DNA do miejsca docelowego. Na przykład liposomy kationowe, chitozan i inne dodatnio naładowane nanocząstki tworzą kompleksy z plazmidowym DNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Jednak łatwo powstające kompleksy liposomów kationowych/plazmidowego DNA są stosunkowo duże (tj. 300–400 nm) i z natury niejednorodne, co utrudnia ich wykorzystanie w zastosowaniach farmaceutycznych. Duże i niejednorodne kompleksy plazmidowego DNA/liposomów, plazmidowego DNA/aerozoli oraz plazmidowego DNA/peptydów można przekształcić w mniejsze, jednorodne cząstki za pomocą ultradźwięków.” (Sarker et al., 2019)
Znaczącym przykładem zastosowania wektorów plazmidowych jest CRISPR–Cas9. System CRISPR–Cas9 jest zazwyczaj dostarczany do komórek w postaci pojedynczego dużego plazmidu lub kilku mniejszych plazmidów, które kodują sekwencję docelową, element przewodnikowy CRISPR i Cas9.

Ultradźwiękowe przygotowanie nanocząstek PLGA zawierających DNA metodą nanoprecypitacji

Jo et al. (2020) zastosowali poli(kwas mlekowy-co-glikolowy) (PLGA) w celu utworzenia nanocząstkowego nośnika do dostarczania modelowego plazmidu CRISPR–Cas9 do pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Do nanoprecypitacji nanocząstek PLGA zastosowano PLGA z dwiema różnymi grupami końcowymi (grupami estrowymi i aminowymi), aby dodatnio naładowane końcowe grupy aminowe zwiększały efektywność enkapsulacji i załadowania dzięki oddziaływaniom ładunków między nimi a ujemnie naładowanym szkieletem DNA. W polipropylenowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mL rozpuszczono 100 mg Pluronic F127 w 20 mL autoklawowanej wody dejonizowanej, mieszając na wytrząsarce typu vortex, a następnie poddając łagodnej sonikacji przez 30 min w łaźni ultradźwiękowej (zob. CupHorn). Dodano autoklawowany mieszalnik magnetyczny i mieszano roztwór przy 600 RPM przez 30 min, podczas gdy przygotowywano pozostałe roztwory. W całej procedurze używano plastikowych naczyń laboratoryjnych zamiast szklanych, aby zminimalizować nieswoistą adsorpcję DNA. Oddzielnie przygotowano roztwory PLGA rozpuszczonego w DMF (44,48 mg/ ml) oraz pentacenu TIPS rozpuszczonego w THF (0,667 mg/ml). PLGA pozostawiono bez mieszania w DMF na 30 min w celu zwilżenia, a następnie poddawano sonikacji przez 30 min. (pełny protokół: zob. Jo et al., 2020)

Ochrona plazmidowego DNA podczas sonikacji

DNA, w tym plazmidy i plazmidy superskręcone, jest bardzo podatne na degradację. Wszystkie dostępne metody fragmentacji mają pewne znane wady. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest jedną z preferowanych metod, ponieważ kontrolowana sonikacja w połączeniu ze środkami ochronnymi pozwala ograniczyć uszkodzenia nici DNA wywołane ścinaniem i ciepłem.
Oprócz ustawień niskiej amplitudy, trybu pulsacyjnego i kontroli temperatury podczas ultradźwiękowego ścinania DNA, stosowanie określonych substancji wykazało znaczące działanie ochronne przed degradacją DNA. Na przykład różne polimery, peptydy i lipidy chronią plazmidowe DNA podczas sonikacji.

Stabilność plazmidowego DNA oraz nanokompleksów plazmidowego DNA/IL wobec ultradźwiękowych naprężeń ścinających badano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Zarówno plazmidowe DNA, jak i nanokompleksy plazmidowego DNA/IL poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez różne okresy. Plazmidowe DNA poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez 0, 10, 20, 30 i 40 minut. Natomiast nanokompleksy plazmidowego DNA/IL poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minut.
(badanie i ilustracja: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) wykazali, że gdy nanostruktury plazmidowego DNA / cieczy jonowej (pDNA/IL) poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 min oraz kompleksowano z dostępną na rynku lipofektaminą, kationowym odczynnikiem do dostarczania genów, odsetek komórek wykazujących fluorescencję wynosił odpowiednio 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% i 50% (zob. wykres poniżej). Odsetek komórek wykazujących fluorescencję wzrastał, gdy nanostruktury poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez 10 i 20 min, a następnie powoli malał.

Wpływ cieczy jonowej [Bmim][PF6] na dostarczanie plazmidowego DNA do komórek COS7. Nanokompleksy plazmidowego DNA/IL (cieczy jonowej) poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez maksymalnie 120 minut i kompleksowano z LA przed dostarczeniem do komórek COS7. Dane przedstawiają średnią liczbę (%) komórek HeLa dodatnich pod względem GFP, zliczonych w 10 różnych polach widzenia mikroskopu, a eksperyment wykonywano wielokrotnie w trzech różnych dniach. (Badanie i wykres: ©Sarker et al., 2019)

Ultradźwiękowe przygotowanie lizatu

Protokół ultradźwiękowej lizy komórek
Rozpocznij od wzbogaconej próbki komórek przygotowanej metodą separacji komórek (np. immunomagnetycznej separacji komórek, sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), wirowania w gradiencie gęstości, izolacji komórek metodą immunogęstościową).
Próbki komórek muszą zawierać objętość buforu do lizy odpowiednią dla celu eksperymentu i sonikatora z sonotrodą.
Preferowane są bufory hipotoniczne, ponieważ wspomagają ultradźwiękową lizę komórek. Ważne jest odpowiednie stosowanie dodatków i odpowiednie stężenie soli.
Wybierz urządzenie do lizy ultradźwiękowej: do pośredniej sonikacji fiolek zaleca się VialTweeter lub CupHorn. Do płytek wielodołkowych idealnym sonikatorem jest UIP400MTP. Do klasycznej sonikacji z użyciem sonotrody najlepiej nadają się homogenizatory ultradźwiękowe, takie jak UP100H lub UP200Ht z mikrokońcówką.
Protokół sonikacji z użyciem sonotrody: Umieść sonotrodę sonikatora w objętości próbki w probówce mikrowirówkowej i poddawaj sonikacji przez ok. 10 sekund. W zależności od próbki DNA sonikację można powtórzyć jeszcze jeden lub dwa razy. Wymagana energia ultradźwiękowa dostarczona do próbki (Ws/mL) zależy od lepkości próbki i rodzaju DNA. Chłodzenie w łaźni lodowej i tryb pulsacyjny sonikatora pomagają zapobiegać termicznej degradacji próbki.
Po lizie ultradźwiękowej próbkę wiruje się w celu oddzielenia pozostałości w osadzie (zawierających niezlizowane komórki, jądra komórkowe i niezlizowane organelle)
Jeśli próbka nie jest natychmiast poddawana dalszej obróbce, można ją, można ją przechowywać w odpowiedniej temperaturze, aby zachować jej żywotność.

Sonikatory do fragmentacji DNA

Hielscher Ultrasonics oferuje różne platformy wykorzystujące ultradźwięki do fragmentacji DNA, RNA i chromatyny. Platformy te obejmują sondy ultradźwiękowe (sonotrody), rozwiązania do pośredniej sonikacji umożliwiające jednoczesne przygotowanie próbek w wielu probówkach lub płytkach wielodołkowych (np. płytkach 96-dołkowych, płytkach mikrotitracyjnych), sonoreaktory oraz ultradźwiękowe sonotrody kielichowe. Wszystkie platformy do ścinania DNA są zasilane przez wysokowydajne procesory ultradźwiękowe o dostrojonej częstotliwości, które umożliwiają precyzyjną kontrolę i zapewniają powtarzalne wyniki.

Procesory ultradźwiękowe do dowolnej liczby i wielkości próbek

Dzięki sonikatorom Hielscher do wielu próbek, VialTweeter (do maksymalnie 10 probówek) i UIP400MTP (do mikropłytek/ płytek wielodołkowych), można łatwo skrócić czas przetwarzania próbek dzięki intensywnej, precyzyjnie kontrolowanej sonikacji, uzyskując jednocześnie pożądany rozkład wielkości fragmentów DNA i pożądany uzysk. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA sprawia, że etapy przygotowania plazmidów są wydajne, niezawodne i skalowalne. Protokoły można skalować liniowo od jednej do wielu próbek, stosując stałe parametry ultradźwięków.
Sonikatory z sonotrodami wyposażonymi w od jednego do pięciu palców są idealne do przygotowania mniejszej liczby próbek. Sonikatory laboratoryjne Hielscher są dostępne z różnymi poziomami mocy, dzięki czemu można wybrać idealny dezintegrator ultradźwiękowy do danego zastosowania związanego z DNA.