Ultradźwięki są niezawodną techniką fragmentacji plazmidowego DNA. Precyzyjnie kontrolowana amplituda, tryb pulsacji i kontrola temperatury to najważniejsze cechy ultradźwiękowca do nieuszkadzającej fragmentacji plazmidu. Dodatkowo, zastosowanie określonych środków pomaga w ochronie przed degradacją plazmidu. Firma Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania do kontrolowanej fragmentacji plazmidów z pojedynczych fiolek, jednoczesnej sonikacji wielu próbek, jak również płytek wielodołkowych. Dowiedz się więcej o skutecznej ultradźwiękowej fragmentacji plazmidów!

Ścinanie plazmidu za pomocą ultradźwięków

Kiedy próbki DNA poddawane są działaniu fal ultradźwiękowych, generowane przez nie drgania powodują powstanie w cieczy kawitacji akustycznej, która ścina lub rozbija cząsteczki DNA o dużej masie cząsteczkowej za pomocą sił mechanicznych. Sonikacja jest najszerzej stosowaną metodą w eksperymentach ścinania masowego DNA, w tym w zastosowaniach takich jak immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), w których małe rozmiary fragmentów są absolutnie niezbędne do uzyskania wysokiej rozdzielczości. (por. Tseng i in., 2012)
Plazmidowy DNA (pDNA) jest specyficzną formą DNA, charakteryzującą się kształtem pierścienia i występuje u bakterii i niektórych eukariotów.
Superzwinięte pDNA jest pożądaną formą plazmidowego DNA, ponieważ wykazuje najlepsze wyniki w procesach końcowych, takich jak automatyczne sekwencjonowanie i transfekcja. Ultradźwięki są odpowiednie do skutecznego fragmentowania pDNA, w tym superzwiniętego pDNA.
Thompson i wsp. (2008) wykazali, że sonikacja plazmidów, o której wiadomo, że powoduje fragmentację superzwiniętego DNA, jest skutecznym sposobem poprawy długości odczytu sekwencji phred20 do tego stopnia, że nie różnią się one znacząco od szablonu kontrolnego Beckman Coulter lub enzymatycznie linearyzowanych plazmidów.

Stosowanie wektorów plazmidowych

Plazmidy są często używane jako narzędzia do klonowania, przenoszenia i manipulowania genami. Kiedy plazmidy są używane eksperymentalnie do tych celów, nazywa się je wektorami. Fragmenty DNA lub geny mogą być wprowadzone do wektora plazmidowego, tworząc tak zwany plazmid rekombinowany. Wektory plazmidowe są wykorzystywane jako nośniki rekombinowanego DNA do komórki gospodarza i są kluczowym elementem klonowania molekularnego.
“Wektory niewirusowe są intensywnie badane pod kątem ich potencjalnego zastosowania w terapii genowej w leczeniu różnych skomplikowanych chorób. Wektory niewirusowe chronią plazmidowe DNA przed degradacją fizyczną, chemiczną i enzymatyczną oraz dostarczają cząsteczkę DNA do miejsca docelowego. Na przykład, kationowe liposomy, chitozan i inne dodatnio naładowane nanocząstki tworzą kompleksy z plazmidowym DNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Jednakże, łatwo tworzone kompleksy kationowe liposomy/plazmidowy DNA są stosunkowo duże (tj. 300-400 nm) i niejednorodne, co utrudnia ich wykorzystanie w zastosowaniach farmaceutycznych. Duże i heterogeniczne kompleksy plazmidowy DNA/liposomy, plazmidowy DNA/aerozol oraz plazmidowy DNA/peptydy można zredukować do mniejszych i homogenicznych cząstek stosując ultradźwięki.” (Sarker i in., 2019)
Znamiennym przykładem zastosowania wektorów plazmidowych jest CRISPR-Cas9. System CRISPR-Cas9 jest zwykle dostarczany do komórek jako pojedynczy duży plazmid lub wiele mniejszych plazmidów, które kodują sekwencję docelową, przewodnik CRISPR oraz Cas9.

Ultradźwiękowe przygotowanie nanocząstek PLGA obciążonych DNA metodą nanoprecypitacji

Jo i wsp. (2020) wykorzystali kwas poli(mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) w celu utworzenia nośnika nanocząstek do dostarczania modelowego plazmidu CRISPR-Cas9 do pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Do nanocząstek PLGA użyto PLGA z dwiema różnymi grupami końcowymi (grupy estrowe i aminowe) z założeniem, że dodatnio naładowane aminowe grupy końcowe zwiększają wydajność enkapsulacji i ładunek ze względu na interakcje ładunkowe między nimi a ujemnie naładowanym szkieletem DNA. W 50 mL polipropylenowej stożkowej probówce wirówkowej 100 mg Pluronic F127 rozpuszczono w 20 mL autoklawowanej wody DI poprzez mieszanie wirowe, a następnie 30 min delikatnej sonikacji przy użyciu łaźni ultradźwiękowej (patrz CupHorn). Dodano autoklawowane mieszadło magnetyczne i mieszano roztwór przy 600 RPM przez 30 minut, podczas gdy inne roztwory były wykonywane. W celu zminimalizowania niespecyficznej adsorpcji DNA zamiast szkła stosowano przez cały czas plastikowe naczynia laboratoryjne. Roztwory PLGA rozpuszczonego w DMF (44,48 mg/ml) i pentacenu TIPS rozpuszczonego w THF (0,667 mg/ml) sporządzono oddzielnie. PLGA pozostawiono w spokoju do namoczenia w DMF przez 30 min, a następnie poddano sonikacji przez 30 min. (pełny protokół patrz Jo et al., 2020)

Ochrona plazmidowego DNA podczas sonikacji

DNA w tym plazmidy i superzwinięte plazmidy są bardzo wrażliwe na degradację. Wszystkie dostępne metody fragmentacji są znane z pewnych wad. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest jedną z preferowanych metod, ponieważ kontrolowana sonikacja w połączeniu ze środkami ochronnymi pozwala na zmniejszenie uszkodzeń nici DNA wywołanych przez ścinanie i ciepło.
Oprócz ustawienia niskiej amplitudy, trybu pulsacji i kontroli temperatury podczas ultradźwiękowego ścinania DNA, zastosowanie pewnych czynników wykazało znaczący efekt ochronny przed degradacją DNA. Na przykład, różne polimery, peptydy i lipidy chronią plazmidowe DNA podczas ultradźwięków.

Stabilność plazmidowego DNA i nanokompleksów plazmidowego DNA/IL wobec ultradźwiękowych naprężeń ścinających badano metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Zarówno plazmidowe DNA, jak i nanokompleksy plazmidowe DNA/IL poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez różne punkty czasowe. Plazmidowe DNA poddawano działaniu ultradźwiękowego stresu ścinającego przez 0, 10, 20, 30 i 40 minut. Natomiast nanokompleksy plazmidowego DNA/IL poddano działaniu ultradźwiękowego stresu ścinającego przez 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minut.
(opracowanie i zdjęcie: ©Sarker et al., 2019)

Sarker i in. (2019) wykazali, że gdy nanostruktury plazmidowego DNA / cieczy jonowej (pDNA/IL) poddano ultradźwiękowym naprężeniom ścinającym przez 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 min i skompleksowano z komercyjnie dostępnym kationowym środkiem do dostarczania genów lipofektaminą, procent komórek fluorescencyjnie pozytywnych wynosił odpowiednio 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% i 50% (patrz wykres poniżej). Odsetek komórek fluorescencyjnie pozytywnych wzrastał, gdy nanostruktury poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez 10 i 20 minut, a następnie powoli malał.

Wpływ cieczy jonowej [Bmim][PF6] na dostarczanie plazmidowego DNA do komórek COS7. Nanokompleksy plazmidowego DNA/IL (ciecz jonowa) poddawano ultradźwiękowym naprężeniom ścinającym przez okres do 120 minut i kompleksowano z LA przed dostarczeniem do komórek COS7. Dane pokazują średnią liczbę (%) komórek HeLa pozytywnych pod względem GFP policzonych w 10 różnych polach mikroskopowych, a eksperyment przeprowadzono wielokrotnie w trzech różnych dniach. (Badanie i wykres: ©Sarker et al., 2019)

Ultradźwiękowe przygotowanie lizatu

Protokół ultradźwiękowej lizy komórek
Rozpocząć od wzbogaconej próbki komórek, która została przygotowana za pomocą metody separacji komórek (np. immunomagnetyczna separacja komórek, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), wirowanie z gradientem gęstości, izolacja komórek metodą immunodensity).
Próbki komórek muszą wykazywać objętość buforu lizującego odpowiednią dla celu doświadczalnego i ultradźwiękowca typu sonda.
Preferowane są bufory hipotoniczne, ponieważ zwiększają one ultradźwiękową lizę komórek. Ważne jest, aby dodatki i stężenie soli były stosowane w odpowiedni sposób.
Wybrać urządzenie do lizy ultradźwiękowej: Do pośredniej sonikacji fiolek zalecane są VialTweeter lub CupHorn. W przypadku płytek wielokomorowych idealnym urządzeniem ultradźwiękowym jest UIP400MTP. Do klasycznej sonikacji typu sonda najbardziej odpowiedni jest homogenizator ultradźwiękowy UP100H lub UP200Ht z mikro końcówką.
Protokół sonikacji typu sonda: Umieścić sondę ultradźwiękową w objętości próbki w probówce mikrowirówki i sonikować przez ok. 10 sekund. W zależności od próbki DNA, sonikacja może być powtórzona jeszcze jeden lub dwa razy. Wymagany nakład energii ultradźwiękowej (Ws/mL) zależy od lepkości próbki i rodzaju DNA. Chłodzenie za pomocą kąpieli lodowej i tryb pulsacyjny ultradźwiękowy pomagają zapobiec degradacji termicznej próbki.
Po zakończeniu lizy ultradźwiękowej, próbka jest odwirowywana w celu oddzielenia pozostałości granulatu (zawierającego niezlizane komórki, jądra i niezlizane organelle).
Jeżeli próbka nie jest natychmiast poddawana dalszemu przetwarzaniu, można ją przechowywać w odpowiedniej temperaturze, aby zachować jej żywotność.

Ultradźwiękowce do fragmentacji DNA

Firma Hielscher Ultrasonics oferuje różne platformy ultradźwiękowe do fragmentacji DNA, RNA i chromatyny. Do tych różnych platform należą sondy ultradźwiękowe (sonotrody), rozwiązania sonikacji pośredniej do jednoczesnego przygotowywania próbek w wielu probówkach lub płytkach wielodołkowych (np. 96-dołkowych, mikropłytkach), sonoreaktory i kopułki ultradźwiękowe. Wszystkie platformy do ścinania DNA są napędzane przez dostrojone częstotliwościowo, wysokowydajne procesory ultradźwiękowe, które są precyzyjnie sterowane i zapewniają powtarzalne wyniki.

Procesory ultradźwiękowe dla dowolnej liczby i wielkości próbek

Dzięki wielopróbkowym ultradźwiękowym urządzeniom firmy Hielscher: VialTweeter (do 10 probówek) i UIP400MTP (do mikropłytek/płytek wielokomorowych) możliwe jest skrócenie czasu obróbki próbki dzięki intensywnej i precyzyjnie kontrolowanej ultradźwiękowej obróbce, przy jednoczesnym uzyskaniu pożądanego rozkładu wielkości fragmentów DNA i wydajności. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA sprawia, że etapy przygotowania plazmidów są wydajne, niezawodne i skalowalne. Protokoły mogą być liniowo skalowane od jednej do wielu próbek poprzez zastosowanie stałych parametrów ultradźwiękowych.
Ultradźwięki sondowe z jednym do pięciu palców są idealne do przygotowania mniejszych ilości próbek. Laboratoryjne ultradźwięki firmy Hielscher są dostępne z różnymi poziomami mocy, dzięki czemu można wybrać idealny ultradźwiękowy disruptor do aplikacji związanej z DNA.