Przygotowanie plazmidu przy użyciu ultradźwięków

Ultradźwięki są niezawodną techniką fragmentacji plazmidowego DNA. Precyzyjnie kontrolowana amplituda, tryb pulsacji i kontrola temperatury to najważniejsze cechy ultradźwiękowca do nieuszkadzającej fragmentacji plazmidu. Dodatkowo, zastosowanie określonych środków pomaga w ochronie przed degradacją plazmidu. Firma Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania do kontrolowanej fragmentacji plazmidów z pojedynczych fiolek, jednoczesnej sonikacji wielu próbek, jak również płytek wielodołkowych. Dowiedz się więcej o skutecznej ultradźwiękowej fragmentacji plazmidów!

Zapytanie o informacje




Zwróć uwagę na nasze Polityka prywatności.


Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest niezawodną i wydajną techniką powszechnie stosowaną w sekwencjonowaniu następnej generacji (NGS).

UIP400MTP umożliwia precyzyjnie kontrolowaną ultrasonografię płytek wielodołkowych. Jednym z zastosowań UIP400MTP jest fragmentacja plazmidowego DNA w celu uzyskania fragmentów o ściśle określonej długości.

Ścinanie plazmidu za pomocą ultradźwięków

Kiedy próbki DNA poddawane są działaniu fal ultradźwiękowych, generowane przez nie drgania powodują powstanie w cieczy kawitacji akustycznej, która ścina lub rozbija cząsteczki DNA o dużej masie cząsteczkowej za pomocą sił mechanicznych. Sonikacja jest najszerzej stosowaną metodą w eksperymentach ścinania masowego DNA, w tym w zastosowaniach takich jak immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), w których małe rozmiary fragmentów są absolutnie niezbędne do uzyskania wysokiej rozdzielczości. (por. Tseng i in., 2012)
Plazmidowy DNA (pDNA) jest specyficzną formą DNA, charakteryzującą się kształtem pierścienia i występuje u bakterii i niektórych eukariotów.
Superzwinięte pDNA jest pożądaną formą plazmidowego DNA, ponieważ wykazuje najlepsze wyniki w procesach końcowych, takich jak automatyczne sekwencjonowanie i transfekcja. Ultradźwięki są odpowiednie do skutecznego fragmentowania pDNA, w tym superzwiniętego pDNA.
Thompson i wsp. (2008) wykazali, że sonikacja plazmidów, o której wiadomo, że powoduje fragmentację superzwiniętego DNA, jest skutecznym sposobem poprawy długości odczytu sekwencji phred20 do tego stopnia, że nie różnią się one znacząco od szablonu kontrolnego Beckman Coulter lub enzymatycznie linearyzowanych plazmidów.

Zalety ultradźwiękowego rozdrabniania DNA

  • Precyzyjnie sterowane
  • Powtarzalne wyniki
  • Możliwość dostosowania do docelowych długości fragmentów DNA
  • kontrola temperatury
  • Skalowalność do dowolnej wielkości próby
Film przedstawia ultradźwiękowy system przygotowania próbek UIP400MTP, który pozwala na niezawodne przygotowanie próbek z dowolnych standardowych płytek wielodołkowych przy użyciu ultradźwięków o wysokiej intensywności. Typowe zastosowania UIP400MTP obejmują lizę komórek, ścinanie DNA, RNA i chromatyny, a także ekstrakcję białek.

Ultrasonikator UIP400MTP do sonikacji płytek wieloigłowych

Stosowanie wektorów plazmidowych

Plazmidy są często używane jako narzędzia do klonowania, przenoszenia i manipulowania genami. Kiedy plazmidy są używane eksperymentalnie do tych celów, nazywa się je wektorami. Fragmenty DNA lub geny mogą być wprowadzone do wektora plazmidowego, tworząc tak zwany plazmid rekombinowany. Wektory plazmidowe są wykorzystywane jako nośniki rekombinowanego DNA do komórki gospodarza i są kluczowym elementem klonowania molekularnego.
“Wektory niewirusowe są intensywnie badane pod kątem ich potencjalnego zastosowania w terapii genowej w leczeniu różnych skomplikowanych chorób. Wektory niewirusowe chronią plazmidowe DNA przed degradacją fizyczną, chemiczną i enzymatyczną oraz dostarczają cząsteczkę DNA do miejsca docelowego. Na przykład, kationowe liposomy, chitozan i inne dodatnio naładowane nanocząstki tworzą kompleksy z plazmidowym DNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Jednakże, łatwo tworzone kompleksy kationowe liposomy/plazmidowy DNA są stosunkowo duże (tj. 300-400 nm) i niejednorodne, co utrudnia ich wykorzystanie w zastosowaniach farmaceutycznych. Duże i heterogeniczne kompleksy plazmidowy DNA/liposomy, plazmidowy DNA/aerozol oraz plazmidowy DNA/peptydy można zredukować do mniejszych i homogenicznych cząstek stosując ultradźwięki.” (Sarker i in., 2019)
Znamiennym przykładem zastosowania wektorów plazmidowych jest CRISPR-Cas9. System CRISPR-Cas9 jest zwykle dostarczany do komórek jako pojedynczy duży plazmid lub wiele mniejszych plazmidów, które kodują sekwencję docelową, przewodnik CRISPR oraz Cas9.

Ultradźwiękowe przygotowanie nanocząstek PLGA obciążonych DNA metodą nanoprecypitacji

Jo i wsp. (2020) wykorzystali kwas poli(mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) w celu utworzenia nośnika nanocząstek do dostarczania modelowego plazmidu CRISPR-Cas9 do pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Do nanocząstek PLGA użyto PLGA z dwiema różnymi grupami końcowymi (grupy estrowe i aminowe) z założeniem, że dodatnio naładowane aminowe grupy końcowe zwiększają wydajność enkapsulacji i ładunek ze względu na interakcje ładunkowe między nimi a ujemnie naładowanym szkieletem DNA. W 50 mL polipropylenowej stożkowej probówce wirówkowej 100 mg Pluronic F127 rozpuszczono w 20 mL autoklawowanej wody DI poprzez mieszanie wirowe, a następnie 30 min delikatnej sonikacji przy użyciu łaźni ultradźwiękowej (patrz CupHorn). Dodano autoklawowane mieszadło magnetyczne i mieszano roztwór przy 600 RPM przez 30 minut, podczas gdy inne roztwory były wykonywane. W celu zminimalizowania niespecyficznej adsorpcji DNA zamiast szkła stosowano przez cały czas plastikowe naczynia laboratoryjne. Roztwory PLGA rozpuszczonego w DMF (44,48 mg/ml) i pentacenu TIPS rozpuszczonego w THF (0,667 mg/ml) sporządzono oddzielnie. PLGA pozostawiono w spokoju do namoczenia w DMF przez 30 min, a następnie poddano sonikacji przez 30 min. (pełny protokół patrz Jo et al., 2020)

Powiązane aplikacje:

  • Ekstrakcja DNA
  • Enkapsulacja DNA
  • Dyspersja DNA pokrytego nanocząstkami
  • Dostarczanie plazmidowego DNA do komórek
UP200St TD_CupHorn do pośredniego sondowania próbek

UP200St CupHorn do pośredniej sonikacji próbek, np. do ekstrakcji i fragmentacji DNA.

Zapytanie o informacje




Zwróć uwagę na nasze Polityka prywatności.


Ochrona plazmidowego DNA podczas sonikacji

DNA w tym plazmidy i superzwinięte plazmidy są bardzo wrażliwe na degradację. Wszystkie dostępne metody fragmentacji są znane z pewnych wad. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest jedną z preferowanych metod, ponieważ kontrolowana sonikacja w połączeniu ze środkami ochronnymi pozwala na zmniejszenie uszkodzeń nici DNA wywołanych przez ścinanie i ciepło.
Oprócz ustawienia niskiej amplitudy, trybu pulsacji i kontroli temperatury podczas ultradźwiękowego ścinania DNA, zastosowanie pewnych czynników wykazało znaczący efekt ochronny przed degradacją DNA. Na przykład, różne polimery, peptydy i lipidy chronią plazmidowe DNA podczas ultradźwięków.

Ciecze jonowe mogą chronić plazmidowe DNA przed uszkodzeniami podczas sonikacji.

Stabilność plazmidowego DNA i nanokompleksów plazmidowego DNA/IL wobec ultradźwiękowych naprężeń ścinających badano metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Zarówno plazmidowe DNA, jak i nanokompleksy plazmidowe DNA/IL poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez różne punkty czasowe. Plazmidowe DNA poddawano działaniu ultradźwiękowego stresu ścinającego przez 0, 10, 20, 30 i 40 minut. Natomiast nanokompleksy plazmidowego DNA/IL poddano działaniu ultradźwiękowego stresu ścinającego przez 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minut.
(opracowanie i zdjęcie: ©Sarker et al., 2019)

Sarker i in. (2019) wykazali, że gdy nanostruktury plazmidowego DNA / cieczy jonowej (pDNA/IL) poddano ultradźwiękowym naprężeniom ścinającym przez 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 min i skompleksowano z komercyjnie dostępnym kationowym środkiem do dostarczania genów lipofektaminą, procent komórek fluorescencyjnie pozytywnych wynosił odpowiednio 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% i 50% (patrz wykres poniżej). Odsetek komórek fluorescencyjnie pozytywnych wzrastał, gdy nanostruktury poddawano działaniu ultradźwiękowych naprężeń ścinających przez 10 i 20 minut, a następnie powoli malał.

Ultradźwiękowa fragmentacja plazmidowego DNA

Wpływ cieczy jonowej [Bmim][PF6] na dostarczanie plazmidowego DNA do komórek COS7. Nanokompleksy plazmidowego DNA/IL (ciecz jonowa) poddawano ultradźwiękowym naprężeniom ścinającym przez okres do 120 minut i kompleksowano z LA przed dostarczeniem do komórek COS7. Dane pokazują średnią liczbę (%) komórek HeLa pozytywnych pod względem GFP policzonych w 10 różnych polach mikroskopowych, a eksperyment przeprowadzono wielokrotnie w trzech różnych dniach. (Badanie i wykres: ©Sarker et al., 2019)

Plazmidowe DNA można zabezpieczyć dodając środek przed fragmentacją ultradźwiękową.

Plazmidowe DNA może być chronione przez dodanie środka przed fragmentacją ultradźwiękową: Degradacja wywołana sonikacją nagiego pDNA (A) oraz pDNA sformułowanego z 1,5 mM CaCl2 i 20% (v/v) t-butanolu (B)
Próbki były sonikowane sondą 20W przez maksymalnie 120s, jak wskazano na górze każdego pasa. Pasek H odpowiada znacznikowi Hyperladder I ™️. Wskazane są pasma plazmidów OC i SC.
(opracowanie i zdjęcia: ©Wu et al., 2009)

Ultradźwiękowe przygotowanie lizatu

Protokół ultradźwiękowej lizy komórek
Ultradźwiękowiec UP200Ht z końcówką mikrotip S26d2 do ultradźwiękowej lizy próbek biologicznychRozpocząć od wzbogaconej próbki komórek, która została przygotowana za pomocą metody separacji komórek (np. immunomagnetyczna separacja komórek, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), wirowanie z gradientem gęstości, izolacja komórek metodą immunodensity).
Próbki komórek muszą wykazywać objętość buforu lizującego odpowiednią dla celu doświadczalnego i ultradźwiękowca typu sonda.
Preferowane są bufory hipotoniczne, ponieważ zwiększają one ultradźwiękową lizę komórek. Ważne jest, aby dodatki i stężenie soli były stosowane w odpowiedni sposób.
Wybrać urządzenie do lizy ultradźwiękowej: Do pośredniej sonikacji fiolek zalecane są VialTweeter lub CupHorn. W przypadku płytek wielokomorowych idealnym urządzeniem ultradźwiękowym jest UIP400MTP. Do klasycznej sonikacji typu sonda najbardziej odpowiedni jest homogenizator ultradźwiękowy UP100H lub UP200Ht z mikro końcówką.
Protokół sonikacji typu sonda: Umieścić sondę ultradźwiękową w objętości próbki w probówce mikrowirówki i sonikować przez ok. 10 sekund. W zależności od próbki DNA, sonikacja może być powtórzona jeszcze jeden lub dwa razy. Wymagany nakład energii ultradźwiękowej (Ws/mL) zależy od lepkości próbki i rodzaju DNA. Chłodzenie za pomocą kąpieli lodowej i tryb pulsacyjny ultradźwiękowy pomagają zapobiec degradacji termicznej próbki.
Po zakończeniu lizy ultradźwiękowej, próbka jest odwirowywana w celu oddzielenia pozostałości granulatu (zawierającego niezlizane komórki, jądra i niezlizane organelle).
Jeżeli próbka nie jest natychmiast poddawana dalszemu przetwarzaniu, można ją przechowywać w odpowiedniej temperaturze, aby zachować jej żywotność.

Ultradźwiękowce do fragmentacji DNA

Firma Hielscher Ultrasonics oferuje różne platformy ultradźwiękowe do fragmentacji DNA, RNA i chromatyny. Do tych różnych platform należą sondy ultradźwiękowe (sonotrody), rozwiązania sonikacji pośredniej do jednoczesnego przygotowywania próbek w wielu probówkach lub płytkach wielodołkowych (np. 96-dołkowych, mikropłytkach), sonoreaktory i kopułki ultradźwiękowe. Wszystkie platformy do ścinania DNA są napędzane przez dostrojone częstotliwościowo, wysokowydajne procesory ultradźwiękowe, które są precyzyjnie sterowane i zapewniają powtarzalne wyniki.

Procesory ultradźwiękowe dla dowolnej liczby i wielkości próbek

Dzięki wielopróbkowym ultradźwiękowym urządzeniom firmy Hielscher: VialTweeter (do 10 probówek) i UIP400MTP (do mikropłytek/płytek wielokomorowych) możliwe jest skrócenie czasu obróbki próbki dzięki intensywnej i precyzyjnie kontrolowanej ultradźwiękowej obróbce, przy jednoczesnym uzyskaniu pożądanego rozkładu wielkości fragmentów DNA i wydajności. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA sprawia, że etapy przygotowania plazmidów są wydajne, niezawodne i skalowalne. Protokoły mogą być liniowo skalowane od jednej do wielu próbek poprzez zastosowanie stałych parametrów ultradźwiękowych.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Ultradźwiękowe urządzenie do przygotowywania wielu próbek VialTweeter pozwala na jednoczesną sonizację do 10 fiolek. Za pomocą urządzenia zaciskowego VialPress można wcisnąć do 4 dodatkowych rurek do przodu w celu uzyskania intensywnej echosondykacji.

dokładne sterowanie procesem

Ultradźwiękowe urządzenia firmy Hielscher mogą być zdalnie sterowane za pomocą przeglądarki internetowej. Parametry sonikacji mogą być monitorowane i precyzyjnie dopasowywane do wymagań procesu.Precyzyjna kontrola ustawień sonikacji ma decydujące znaczenie, ponieważ wyczerpująca sonikacja może zniszczyć DNA, RNA i chromatynę, natomiast nieodpowiednie ścinanie ultradźwiękami powoduje powstawanie zbyt długich fragmentów DNA i chromatyny. Cyfrowe ultradźwięki firmy Hielscher mogą być łatwo ustawione na precyzyjne parametry sonikacji. Konkretne ustawienia sonikacji mogą być również zapisane jako ustawienia programowane w celu szybkiego powtórzenia tej samej procedury.
Wszystkie sonikacje są automatycznie protokołowane i zapisywane jako plik CSV na wbudowanej karcie SD. Pozwala to na dokładną dokumentację przeprowadzonych prób i umożliwia łatwą korektę przebiegu sonikacji.
Dzięki zdalnemu sterowaniu przez przeglądarkę wszystkie cyfrowe ultradźwięki mogą być obsługiwane i nadzorowane przez każdą standardową przeglądarkę. Instalacja dodatkowego oprogramowania nie jest konieczna, ponieważ połączenie LAN jest bardzo prostą konfiguracją plug-n-play.

Najwyższa przyjazność dla użytkownika podczas ultradźwiękowego przygotowywania DNA

Wszystkie ultradźwięki firmy Hielscher zostały zaprojektowane tak, aby zapewnić wysoką wydajność ultradźwięków, a jednocześnie zawsze być bardzo przyjazne dla użytkownika i łatwe w obsłudze. Wszystkie ustawienia są uporządkowane w przejrzystym menu, do którego można łatwo dotrzeć za pomocą kolorowego wyświetlacza dotykowego lub pilota przeglądarki. Inteligentne oprogramowanie z programowalnymi ustawieniami i automatycznym zapisem danych zapewnia optymalne ustawienia sonikacji dla wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Przejrzysty i łatwy w obsłudze interfejs menu czyni z ultradźwiękowców Hielscher przyjazne dla użytkownika i wydajne urządzenia.
Poniższa tabela przedstawia przybliżoną zdolność przetwarzania naszych ultradźwięków laboratoryjnych do lizy komórek i fragmentacji DNA:

Wielkość partii natężenie przepływu Polecane urządzenia
płytki wielokrotnego użytku nie dotyczy UIP400MTP
fiolki, mała zlewka nie dotyczy ultradźwiękowy cuphorn
do 10 fiolek nie dotyczy VialTweeter
1 do 500mL 10-200mL/min UP100H
10 do 2000mL 20-400mL/min UP200Ht, UP400St

Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!

Poproś o więcej informacji

Prosimy o skorzystanie z poniższego formularza w celu uzyskania dodatkowych informacji o homogenizatorach ultradźwiękowych do ekstrakcji i fragmentacji DNA, protokołach zastosowań i cenach. Z przyjemnością omówimy z Państwem Państwa proces i zaoferujemy system ultradźwiękowy spełniający Państwa wymagania!









Proszę zwrócić uwagę na nasze Polityka prywatności.




Literatura / materiały źródłowe

Fakty Warto wiedzieć

Co to są plazmidy?
Plazmid to mała kolista cząsteczka DNA, która jest fizycznie oddzielona od chromosomalnego DNA i replikuje się niezależnie. Plazmidy są często związane z genami, które przyczyniają się do przetrwania organizmu i dają specyficzne korzyści, np. odporność na antybiotyki. Plazmidy najczęściej występują jako małe, koliste, dwuniciowe cząsteczki DNA u bakterii, jednak zdarza się, że są obecne u archaii i organizmów eukariotycznych. Plazmidy są ważnym narzędziem w biologii molekularnej, genetyce, biochemii i naukach przyrodniczych. Znane jako wektory w inżynierii genetycznej, plazmidy są wykorzystywane do replikacji lub ekspresji określonych genów. Celowa zmiana wektora nazywana jest projektowaniem wektora.

Analiza GFP w badaniach nad komórkami
Białko zielonej fluorescencji (GFP) jest uniwersalnym markerem biologicznym służącym do monitorowania procesów fizjologicznych, wizualizacji lokalizacji białek i wykrywania ekspresji transgenicznej in vivo. GFP może być wzbudzane przez linię laserową 488 nm i jest optymalnie wykrywane przy 510 nm.


Ultradźwięki o wysokiej wydajności! Paleta produktów firmy Hielscher obejmuje pełne spektrum od kompaktowych ultradźwięków laboratoryjnych, poprzez urządzenia stołowe, aż po przemysłowe systemy ultradźwiękowe.

Firma Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe od laboratorium do wielkość przemysłowa.