Protokół dla dezaktywacji koronaawirusa SARS-CoV-2 za pomocą soniki

Hielscher VialTweeter jest unikalnym, ultradźwiękowym urządzeniem do przygotowywania wielu próbek, które służy do inaktywacji koronaawirusa SARS-COV-2. VialTweeter pozwala na przygotowanie do 10 fiolek z próbkami jednocześnie, dzięki czemu jest idealnym urządzeniem do masowej obróbki próbek.

Dezaktywacja koronaawirusa SARS-CoV-2 za pomocą VialTweeter'a

Po usunięciu utrwalacza, monowarstwy zostały trzykrotnie przepłukane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie zeskrobane do 1 ml MEM/5% FBS i udźwiękowione (3 × 10 sekund po włączeniu, 10 sekund po wyłączeniu przy 100% mocy i amplitudzie) przy użyciu procesora ultradźwiękowego firmy Hielscher. UP200St z VialTweeter Przywiązanie. Supernatanty były klarowane przez odwirowywanie w temperaturze 3000 × g przez 10 minut. NNastępnie przeczytaj pełny protokół inaktywacji koronaawirusa SARS-CoV-2 przez Welcha i wsp:

Komórki i wirusy

Komórki Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle's minimum essential medium (MEM) uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS). Zastosowanym wirusem był szczep SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, wyizolowany przez PHE z pierwszego skupiska pacjentów w Wielkiej Brytanii w dniu 29/01/2020. Wirus ten został uzyskany przy pasażu 1 i wykorzystany do badań inaktywacji przy pasażu 2 lub 3.
Odczynniki i substancje chemiczne stosowane do inaktywacji SARS-CoV-2, jak również do usuwania cytotoksyczności odczynników, znajdują się w raporcie naukowym Welch et al. (2020).

Inaktywacja wirusa przez detergenty – SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivation protocol by Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 Dezaktywacja

Dla produktów handlowych, preparatów wirusowych (płyn do hodowli tkanek, miana od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) zostały potraktowane w trzech egzemplarzach przy użyciu odczynników w stężeniach i czasie kontaktu zalecanych przez producenta w instrukcji użytkowania, jeżeli są one dostępne, lub w stężeniach i czasie wyraźnie określonych przez laboratoria badawcze. Jeżeli producent podał zakres stężeń, badano najniższy stosunek produktu do próbki (tj. najniższe zalecane stężenie badanego produktu). Stosunek jednej objętości płynu do hodowli tkanek do dziesięciu objętości odczynnika testowano przy użyciu probówki transportowej próbki, chyba że producent określił stosunek objętości płynu do próbki do odczynnika. Detergenty, utrwalacze i rozpuszczalniki były badane we wskazanych stężeniach przez wskazany czas. Wszystkie etapy inaktywacji przeprowadzono w temperaturze pokojowej otoczenia (18 - 25°C). W celu przetestowania alternatywnych typów próbek, wirus został wrzucony do wskazanej matrycy próbki w stosunku 1:9, a następnie poddany działaniu odczynników testowych jak wyżej. Wszystkie eksperymenty obejmowały potrójne próbki kontrolne poddane obróbce próbką próbną z równoważną objętością PBS zamiast odczynnika testowego. Bezpośrednio po wymaganym czasie kontaktu, 1ml poddanej obróbce próbki zostało przetworzone przy użyciu odpowiednio dobranej matrycy filtracyjnej. Usuwanie odczynnika w celu przeprowadzenia testu inaktywacji przeprowadzono w większym formacie kolumn wirowych przy użyciu Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) lub poprzez wypełnienie pustych kolumn wirówkowych o pojemności 10mL Pierce'a (Thermo Fisher) Bio-Beads SM2, Sephacryl S-400HR lub Sephadex LH-20 w celu uzyskania 4mL opakowanych kulek/żywicy. W celu oczyszczenia przy użyciu filtrów Amicon, 2 × 500μl próbki zostały oczyszczone przy użyciu dwóch filtrów odśrodkowych opisaną wcześniej metodą, a następnie połączone razem. W przypadku formaldehydu i formaldehydu z usuwaniem aldehydu glutarowego zastosowano jeden filtr o objętości próbki 1 × 500μl, zawiesinę po przetworzeniu w 500μl PBS, a następnie dodano do 400ul MEM/5% FBS. Do inaktywacji zakażonych jednowarstwowe, 12,5 cm² kolby z komórek Vero E6 (2,5 × 10)⁶ komórki/kolba w 2,5 ml MEM/5% FBS) zostały zainfekowane przy MOI 0,001 i inkubowane w 37°C/5% CO₂ przez 24 godziny. Supernatant został usunięty, a komórki utrwalono za pomocą 5ml formaldehydu lub formaldehydu i glutaraldehydu w temperaturze pokojowej przez 15 lub 60 min. Fiksatywa została usunięta, a monowarstwy przemyte trzykrotnie PBS przed zeskrobaniem komórek do 1mL MEM/5% FBS i udźwiękowione (3 × 10 sekund włączona, 10 sekund wyłączona przy 100% mocy i amplitudzie) przy użyciu UP200St z przystawką VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanty były klarowane przez odwirowywanie przy 3000 × g przez 10 min.".

Szczegóły dotyczące odczynnika stosowanego do inaktywacji koronaawirusa SARS-CoV-2 za pomocą ultradźwiękowego VialTweeter'a zgodnie z protokołem firmy Welch et al. 2020

Pełny protokół, w tym wykorzystanie Hielscher VialTweeter, można znaleźć tutaj:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Wyrafinowane dismbratory ultradźwiękowe i dezruptory komórkowe

Wielopróbkowy ultrasonograf VialTweeter jest tylko jednym z wielu rozwiązań ultradźwiękowych do przygotowywania próbek w laboratoriach biologicznych, biochemicznych i klinicznych. Firma Hielscher Ultrasonics oferuje idealny rozdrabniacz ultradźwiękowy do zastosowań, np. do analizy komórek, ekstrakcji komórek, homogenizacji tkanek, rozpuszczania lizatów, rozpuszczania, odgazowywania próbek itp.
Daj nam znać, ile próbek trzeba przetworzyć w ciągu godziny i dnia, czy wolisz sonicję bezpośrednią czy pośrednią oraz jaki jest cel leczenia próbki ultradźwiękowej. Polecamy Państwu najbardziej odpowiednie urządzenie ultradźwiękowe dla Państwa codziennej pracy!
Cyfrowe procesory ultradźwiękowe firmy Hielscher Ultrasonics są wyposażone w inteligentne oprogramowanie, automatyczny zapis danych, łatwe do zaprogramowania opcje kontroli temperatury, czasu trwania sonacji, trybu cyklu/impulsu oraz oświetlenia próbki i pilota przeglądarki. Dążymy do tego, aby nasze urządzenia ultradźwiękowe były tak inteligentne, jak to tylko możliwe, aby Twoje badania i rutyna pracy stała się tak wygodna i udana, jak to tylko możliwe.
Kliknij tutaj, aby znaleźć więcej aplikacji, w tym protokoły przygotowania próbki ultradźwiękowej za pomocą VialTweeter!