Protokół inaktywacji koronawirusa SARS-CoV-2 za pomocą sonikacji

Hielscher VialTweeter to wyjątkowe urządzenie ultradźwiękowe do przygotowywania wielu próbek, stosowane do inaktywacji koronawirusa SARS-COV-2. VialTweeter umożliwia jednoczesne przygotowywanie do 10 fiolek z próbkami i dlatego jest idealnym urządzeniem do masowego przetwarzania próbek.

Inaktywacja koronawirusa SARS-CoV-2 za pomocą VialTweeter

Po usunięciu utrwalacza monowarstwy przemywano trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), a następnie zeskrobywano komórki do 1mL MEM/5% FBS i poddawano sonikacji (3 × 10 sekund pracy, 10 sekund przerwy przy mocy i amplitudzie wynoszących 100%) za pomocą procesora ultradźwiękowego Hielscher UP200St z VialTweeter jako przystawką. Supernatanty klarowano przez wirowanie przy 3000 × g przez 10 min. Poniżej przedstawiono pełny protokół inaktywacji koronawirusa SARS-CoV-2 opracowany przez Welch i wsp. (2020):

Komórki i wirus

Komórki Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) hodowano w zmodyfikowanej minimalnej pożywce podstawowej Eagle’a (MEM) z dodatkiem 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS). Użyto wirusa SARS-CoV-2, szczepu hCOV-19/England/2/2020, wyizolowanego przez PHE z pierwszego ogniska zachorowań w Wielkiej Brytanii w dniu 29/01/2020. Wirus ten uzyskano podczas pasażu 1 i wykorzystano do badań inaktywacji podczas pasażu 2 lub 3.
Informacje o odczynnikach i substancjach chemicznych stosowanych do inaktywacji SARS-CoV-2 oraz o eliminowaniu cytotoksyczności odczynników można znaleźć w raporcie naukowym Welch i wsp. (2020).

Inaktywacja wirusa za pomocą detergentów – protokół inaktywacji koronawirusa SARS-CoV-2 opracowany przez Welch i wsp. 2020

Inaktywacja SARS-CoV-2


W przypadku produktów komercyjnych preparaty wirusa (płyn z hodowli tkankowej, miana w zakresie od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) poddawano w trzech powtórzeniach działaniu odczynników w stężeniach i przez czas kontaktu, które zalecano w instrukcjach użytkowania producenta, o ile były dostępne, lub w stężeniach i przez czas, które wskazały specjalnie laboratoria wykonujące badania. Jeżeli producent podawał zakres stężeń, badano najniższy stosunek produktu do próbki (tj. najniższe zalecane stężenie badanego produktu). Odczynniki do probówek transportowych na materiał do badań testowano przy stosunku jednej objętości płynu z hodowli tkankowej do dziesięciu objętości odczynnika, chyba że producent określił stosunek objętości płynu próbki do odczynnika. Detergenty, utrwalacze i rozpuszczalniki testowano w podanych stężeniach przez wskazany czas. Wszystkie etapy inaktywacji przeprowadzano w temperaturze pokojowej otoczenia (18 – 25°C). W celu zbadania alternatywnych typów próbek dodawano wirusa do wskazanej matrycy próbki w stosunku 1:9, a następnie poddawano ją działaniu badanych odczynników w sposób opisany powyżej. Wszystkie eksperymenty obejmowały próbki kontrolne w trzech powtórzeniach, poddawane pozorowanej obróbce z równoważną objętością PBS zamiast badanego odczynnika. Bezpośrednio po upływie wymaganego czasu kontaktu 1mL próbki poddanej obróbce przetwarzano z użyciem odpowiednio dobranej matrycy filtracyjnej. Usuwanie odczynników na potrzeby badań inaktywacji prowadzono w większym formacie kolumn wirówkowych, używając Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) lub wypełniając puste kolumny wirówkowe Pierce o pojemności 10mL (Thermo Fisher) materiałem SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR lub Sephadex LH-20, tak aby uzyskać 4mL upakowanych kulek/żywicy. W przypadku oczyszczania za pomocą filtrów Amicon próbki 2 × 500μl oczyszczano przy użyciu dwóch filtrów wirówkowych metodą opisaną wcześniej, a następnie łączono. W celu usunięcia formaldehydu oraz formaldehydu z aldehydem glutarowym stosowano jeden filtr z próbką o objętości 1× 500μl, którą po przetworzeniu ponownie zawieszano w 500μl PBS i dodawano do 400ul MEM/5% FBS. Do inaktywacji zakażonych monowarstw użyto kolb o powierzchni 12,5 cm² z komórkami Vero E6 (2,5 × 10⁶ komórek/kolbę w 2,5mL MEM/5% FBS), które zakażano przy MOI 0,001 i inkubowano w 37°C/5% CO₂ przez 24 godziny. Usuwano supernatant, a komórki utrwalano przy użyciu 5mL formaldehydu lub formaldehydu i aldehydu glutarowego w temperaturze pokojowej przez 15 lub 60 min. Usuwano utrwalacz i przemywano monowarstwy trzykrotnie PBS, a następnie zeskrobywano komórki do 1mL MEM/5% FBS i poddawano sonikacji (3 × 10 sekund pracy, 10 sekund przerwy przy mocy i amplitudzie wynoszących 100%) za pomocą UP200St z przystawką VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanty klarowano przez wirowanie przy 3000 × g przez 10 min.


Szczegółowe informacje o odczynniku stosowanym do inaktywacji koronawirusa SARS-CoV-2 za pomocą ultradźwiękowego VialTweeter zgodnie z protokołem Welch i wsp. 2020

Pełny protokół obejmujący zastosowanie Hielscher VialTweeter można znaleźć tutaj:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Zaawansowane dezintegratory ultradźwiękowe i urządzenia do rozbijania komórek

Sonikator VialTweeter do wielu próbek to tylko jedno z wielu rozwiązań ultradźwiękowych do przygotowywania próbek w laboratoriach biologicznych, biochemicznych i klinicznych. Hielscher Ultrasonics oferuje idealny dezintegrator ultradźwiękowy do danego zastosowania, np. lizy komórek, ekstrakcji komórkowej, homogenizacji tkanek, solubilizacji lizatu, rozpuszczania, odgazowywania próbek itp.
Poinformuj nas, ile próbek musisz przetwarzać w ciągu godziny i dnia, czy preferujesz sonikację bezpośrednią czy pośrednią oraz jaki jest cel ultradźwiękowej obróbki próbek. Polecimy Ci urządzenie ultradźwiękowe najlepiej dopasowane do Twojej codziennej pracy!
Cyfrowe procesory ultradźwiękowe Hielscher Ultrasonics są wyposażone w inteligentne oprogramowanie, automatyczne rejestrowanie danych, łatwe opcje wstępnego ustawiania kontroli temperatury, czasu sonikacji i trybu cyklicznego/impulsowego, a także oświetlenie próbek i zdalne sterowanie przez przeglądarkę. Dążymy do tego, aby nasze urządzenia ultradźwiękowe były jak najbardziej inteligentne, dzięki czemu Twoje badania i codzienna praca będą jak najwygodniejsze i przyniosą jak najlepsze rezultaty.
Kliknij tutaj, aby poznać więcej zastosowań, w tym protokoły ultradźwiękowego przygotowywania próbek za pomocą VialTweeter!