Drosophila melanogaster jest szeroko stosowany w laboratoriach jako modelowy organizm. Dlatego też przedanalityczne etapy przygotowania, takie jak liza, rozerwanie komórek, ekstrakcja białka i ścinanie DNA próbek Drosophila melanogaster muszą być często przeprowadzane. Rozdrabniacze ultradźwiękowe są niezawodne i wydajne i mogą być wykorzystywane do wykonywania różnych zadań, takich jak liza, ekstrakcja białka lub fragmentacja DNA, z łatwością dostosowując jedynie parametry procesu ultradźwiękowego. Homogenizatory ultradźwiękowe są zatem elastycznymi narzędziami o szerokim zakresie zastosowań.

Analiza ultradźwiękowa i ekstrakcja białek

Liza, rozpuszczanie komórek, homogenizacja tkanek i ekstrakcja białek są typowymi zadaniami dla dysmonderów ultradźwiękowych w laboratoriach biologicznych. Dysmbratory ultradźwiękowe i dezruptory komórkowe dobrze nadają się do homogenizacji tkanek zwierzęcych, owadów (np. Drosophila melanogaster, C. elegans) lub okazów roślinnych. Kolejne zastosowania ultrasonografii to liza zawiesin komórkowych i granulatów oraz ekstrakcja białek wewnątrzkomórkowych.
Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja białek to wysoce niezawodne i powtarzalne procesy, które mogą być wykonywane na podstawie ustalonych protokołów. Ponieważ intensywność procesu ultradźwiękowego może być dokładnie regulowana za pomocą parametrów sonacji, takich jak amplituda, tryb cyklu / pulsu, temperatura i objętość próbki, raz sprawdzone protokoły mogą być powtarzane z tym samym wynikiem w kółko.

Fragmentacja DNA ultradźwiękowego i RNA

Po przeprowadzeniu lizy komórek oraz ekstrakcji białka, wspólnym wymaganym etapem przygotowania próbki jest ścinanie oraz fragmentacja DNA, RNA oraz chromatyny, np. przed immunoprecypitacją chromatyny (ChIP). Fragmentacja DNA oraz RNA może zostać w sposób wiarygodny osiągnięta poprzez przerwanie wiązań kowalencyjnych, które utrzymują DNA razem przez siły fizyczne. Za pomocą fizycznego ścinania, takiego jak sonizacja, najpierw rozbija się nici DNA, a następnie rozbija się je na mniejsze kawałki.
Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest niezawodna i skuteczna w ścinaniu DNA do docelowej długości, np. 500bp (pary zasadowe). Do głównych zalet ultrasonograficznej fragmentacji DNA należy precyzyjna kontrola parametrów i intensywności procesu ultrasonograficznego. Parametry procesu ultrasonograficznego mogą być regulowane poprzez precyzyjne dostrojenie intensywności, cykli i czasu trwania sondy. Dzięki temu możliwe jest tworzenie pożądanych rozmiarów DNA, a docelowa długość DNA może być niezawodnie wytwarzana i odtwarzana. Ścinanie ultradźwiękowe DNA jest również idealne do tworzenia fragmentów DNA o dużej masie cząsteczkowej.

Protokoły dotyczące analizy ultradźwiękowej Drosophila melanogaster

Poniżej znajdują się różne protokoły do wspomaganej ultradźwiękowo lizania, ekstrakcji białek oraz fragmentacji DNA lub chromatyny w próbkach Drosophila.

Analiza ultradźwiękowa metodą immunoprecypitacji metodą sieciowania (CLIP)

Badanie CLIP zostało przeprowadzone zgodnie z wcześniejszymi zgłoszeniami, z pewnymi modyfikacjami. Około 20 mg jajników od 0- do 1-dniowych samic typu dzikiego było usieciowanych UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizowanych na lodzie w 1 mL buforu RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacharoza, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitory, 1 mM PMSF) uzupełnione 300 U RNAseOUT i umieszczone na lodzie na 30 min. Homogenat był sonikowany na lodzie, przy 80% mocy, pięć razy w 20 s wybuchów, z 60 s przerwy pomiędzy kolejnymi użyciami procesora ultradźwiękowego Hielscher. UP100H (100 W, 30 kHz) i odwirowany (16000 × g przez 5 minut w temperaturze 4°C). Rozpuszczalny ekstrakt poddano preklearyzacji 20 μl dynabelek proteinowych G przez 20 min w temperaturze 4°C. Po usunięciu próbek do znakowania immunologicznego i kwantyfikacji wejścia RNA (1%) HP1 został poddany immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciała anty-HP1 9A9 z 450 μl wstępnie oczyszczonego ekstraktu poprzez inkubację przez 4 h z 50 μl dynabead białkowych G. Immunoprecypitaty zostały 4-krotnie przepłukane za pomocą RCB. W celu wymycia immunoprecypitowanych RNA, granulowane kulki gotowano w 100 μl wody poddanej działaniu UltraPure DEPC przez 5 min. 900 μl Odczynnika Qiazol dodawano do supernatantu odzyskanego do przygotowania RNA. Oczyszczone RNA wykorzystano jako wzorzec do syntezy cDNA przy użyciu oligo dT, heksamerów losowych i odwróconej transkryptazy SuperScript III zgodnie z protokołem producenta.
(Cassale et al. 2019)

Test immunoprecypitacji chromatyny metodą ultradźwiękową

Immunoprecypitację chromatynową wykonano metodą opisaną przez Meneta z niewielkimi modyfikacjami. Około 20 mg jajników od 0- do 1-dniowej samicy typu dzikiego homogenizowano w 1 mL buforu NEB (10 mM HEPES-Na przy pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na przy pH 8, 0.5 mM EDTA-Na przy pH 8, 1 mM DTTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidyna, 0,15 mM Spermina, 1× Inhibitory Proteazy Kompletnej wolne od EDTA-Na) z homogenizatorem / dyspergatorem zanurzeniowym 1 min (przy 3000 obr/min). Homogenat został przeniesiony do uprzednio schłodzonego dna szklanego, a 15 pełnych pociągnięć wykonano za pomocą szczelnego tłuczka. Następnie wolne jądra odwirowywano w temperaturze 6000xg przez 10 min. w temperaturze 4°C. Granulki zawierające jądra zawieszono ponownie w 1 mL NEB i odwirowywano w temperaturze 20000 × g przez 20 min na gradiencie sacharozy (0,65 mL sacharozy 1,6 M w NEB, 0,35 mL sacharozy 0,8 M w NEB). Pellet zawieszono w 1 mL NEB i formaldehydzie do ostatecznego stężenia 1%. Jądra sieciowano przez 10 min w temperaturze pokojowej i schładzano dodając 1/10 obj. 1,375 M glicyny. Jądra pobierano przez wirowanie w temperaturze 6000 × g przez 5 min. Jądra zostały dwukrotnie wypłukane w 1 mL NEB i powtórnie zawieszone w 1 mL Buforu do Lizy (15 mM HEPES-Na przy pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA przy pH 8, 1% Tryton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoksycholan, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilosarkozyny i 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitory). Jądra były sonikowane przy użyciu procesora ultradźwiękowego firmy Hielscher. UP100H (100 W, 30 kHz) sześć razy przez 20 s i 1 minutę na lodzie. Jądra soniczne odwirowywano w temperaturze 13000 × g przez 4 min. w temperaturze 4°C. Większość chromatyny sonikowanej miała długość od 500 do 1000 par zasadowych (bp). Na każdą immunoprecypitację inkubowano 15 μg chromatyny w obecności 10 μg przeciwciała monoklonalnego HP1 9A9 (3 h w temperaturze 4°C w wirującym kole). Następnie dodano 50 μl białka G dynabeads i kontynuowano inkubację przez noc w temperaturze 4°C. Supernatanty zostały wyrzucone, a próbki dwukrotnie wypłukano w Buforze do Lizy (każde 15 min w 4°C) i dwukrotnie w Buforze TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl przy pH 8). Chromatyna została wymyta z kulek w dwóch etapach; najpierw w 100 μl Buforu Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl w pH 8) w temperaturze 65°C przez 15 min, a następnie odwirowano i odzyskano supernatant. Materiał kulek został ponownie ekstrahowany w 100 μl TE + 0,67% SDS. Połączony eluat (200 μl) inkubowano przez noc w temperaturze 65°C w celu odwrócenia wiązań krzyżowych i poddawano działaniu 50 μg/ml RNazy A przez 15 min w temperaturze 65°C oraz 500 μg/ml Proteinazy K przez 3 h w temperaturze 65°C. Próbki poddano ekstrakcji chloroformu fenolowego i wytrąceniu etanolu. DNA zawieszono w 25 μl wody. W celu zmaksymalizowania analiz molekularnych z immunoprecypitowanym DNA, geny kandydujące zostały amplifikowane parami poprzez zoptymalizowany protokół duplex-PCR przy użyciu dwóch różnych zestawów primerów o podobnych temperaturach topnienia w jednej reakcji.
(Casale et al. 2019)
 

Wysokiej jakości dezruptory ultradźwiękowe do próbek biologicznych

Firma Hielscher Ultrasonics jest Państwa długoletnim partnerem w zakresie wysokowydajnych ultrasonografów służących do rozbijania komórek, lizy, ekstrakcji białek, fragmentacji DNA, RNA i chromatyny, jak również innych etapów przygotowania próbki przedanalitycznej. Oferując wszechstronne portfolio laboratoryjnych homogenizatorów ultradźwiękowych i jednostek przygotowujących próbki, firma Hielscher posiada idealne urządzenie ultradźwiękowe do zastosowań biologicznych i wymagań.
Klasyczny ultradźwiękowiec typu sonda z mikrokapsułką, np. UP200St (200W; patrz zdjęcie po lewej) lub jeden z zespołów przygotowania próbek ultradźwiękowych VialTweeter lub UP200ST_TD_CupHorn z VialHolder są ulubionymi modelami w laboratoriach badawczych i analitycznych. Klasyczna sonda ultradźwiękowa jest idealna, gdy trzeba przygotować mniejszą liczbę próbek, które muszą być poddane lizaniu, ekstrakcji lub rozdrobnieniu. Jednostki przygotowujące próbki VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn pozwalają na jednoczesną sondyzację odpowiednio do 10 lub 5 fiolek.
Jeżeli muszą być przetwarzane duże ilości próbek (np. płytki 96-dołkowe, płytki mikrotitracyjne itp.), to UIP400MTP to idealny zestaw soniczny. UIP400MTP działa jak większy cuphorn, który jest wypełniony wodą i ma wystarczająco dużo miejsca do przechowywania płytek mikrodołkowych. UIP400MTP, zasilany silnym procesorem ultradźwiękowym o mocy 400 W, zapewnia bardzo równomierną i intensywną sonikację płytek wielokomorowych w celu rozbijania komórek, ługowania próbek, rozpuszczania granulek, ekstrakcji białek lub ścinania DNA.

Precyzyjna kontrola za pomocą inteligentnego oprogramowania

Wszystkie rozwiązania soniczne firmy Hielscher o mocy od 200 W są wyposażone w cyfrowy, kolorowy ekran dotykowy i inteligentne oprogramowanie. Dzięki inteligentnemu protokołowaniu danych wszystkie parametry procesu ultradźwiękowego są automatycznie zapisywane jako plik CSV na wbudowanej karcie SD zaraz po uruchomieniu ultrasonicatora. Dzięki temu badania i protokołowanie są znacznie wygodniejsze. Po wykonaniu prób sonacji lub przygotowaniu próbki, można po prostu przejrzeć parametry sonacji każdego przebiegu sondy i porównać je.
Za pomocą intuicyjnego menu można zaprogramować wiele parametrów przed dźwiękiem: Na przykład, aby kontrolować temperaturę w próbce i zapobiec jej termicznej degradacji, można ustawić górną granicę temperatury próbki. Wtykany czujnik temperatury, który jest dostarczany z urządzeniem ultradźwiękowym, daje procesorowi ultradźwiękowemu informację zwrotną o rzeczywistej temperaturze sondy. Po osiągnięciu górnej granicy temperatury, urządzenie ultradźwiękowe zatrzymuje się aż do osiągnięcia dolnej granicy ustawionej ∆T, a następnie zaczyna automatycznie ponownie sonicować.
Jeśli wymagana jest soniacja z konkretnym wejściem energetycznym, można zaprogramować końcową energię ultradźwiękową biegu sondy. Oczywiście można również indywidualnie ustawić pulsację ultradźwiękową i tryb pracy cyklicznej.
Aby ponownie wykorzystać najbardziej udane parametry dźwięku, można zapisać różne tryby dźwięku (np. czas trwania dźwięku, intensywność, tryb cyklu itp.) jako wstępnie ustawione tryby, tak aby można je było łatwo i szybko uruchomić ponownie.
Dla większej wygody obsługi wszystkie cyfrowe urządzenia ultradźwiękowe mogą być obsługiwane za pomocą pilota zdalnego sterowania w dowolnej popularnej przeglądarce (np. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). Połączenie LAN jest prostą konfiguracją typu plug-n-play i nie wymaga dodatkowej instalacji oprogramowania.
My w firmie Hielscher wiemy, że skuteczne sondowanie próbek biologicznych wymaga precyzji i powtarzalności. Dlatego zaprojektowaliśmy nasze ultrasonografy jako urządzenia inteligentne, posiadające wszystkie funkcje, które umożliwiają efektywne, niezawodne, powtarzalne i wygodne przygotowanie próbki.

Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych systemów ultradźwiękowych, od mikrokapsułek ultradźwiękowych i klasycznych homogenizatorów ultradźwiękowych do ultrasonografów MultiSample w celu wygodnego i niezawodnego przygotowania wielu próbek: