Ultradźwiękowa liza próbek Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster jest szeroko stosowana w laboratoriach jako organizm modelowy. W związku z tym należy często przeprowadzać wstępne etapy przygotowania analitycznego, takie jak liza, rozrywanie komórek, ekstrakcja białek i ścinanie DNA próbek Drosophila melanogaster. Dysembratory ultradźwiękowe są niezawodne i wydajne i mogą być wykorzystywane do wykonywania różnych zadań, takich jak liza, ekstrakcja białek lub fragmentacja DNA z łatwością, dostosowując jedynie parametry procesu ultradźwiękowego. Homogenizatory ultradźwiękowe są zatem elastycznymi narzędziami o szerokim zakresie zastosowań.

Liza ultradźwiękowa i ekstrakcja białek

Liza, solubilizacja komórek, homogenizacja tkanek i ekstrakcja białek są typowymi zadaniami dla dysembratorów ultradźwiękowych w laboratoriach biologicznych. Ultradźwiękowe dysembratory i rozbijacze komórek są dobrze przystosowane do homogenizacji tkanek zwierzęcych, owadów (np. Drosophila melanogaster, C. elegans) lub próbek roślinnych. Kolejne zastosowania ultradźwięków to liza zawiesin i osadów komórkowych, a także ekstrakcja białek wewnątrzkomórkowych.
Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja białek to wysoce niezawodne i powtarzalne procesy, które mogą być wykonywane na podstawie ustalonych protokołów. Ponieważ intensywność procesu ultradźwiękowego można dokładnie regulować za pomocą parametrów sonikacji, takich jak amplituda, cykl? tryb impulsu, temperatura i objętość próbki, raz sprawdzone protokoły można powtarzać z tym samym wynikiem w kółko.

Ultradźwiękowa fragmentacja DNA i RNA

Po lizie komórek i ekstrakcji białek, powszechnym wymaganym etapem przygotowania próbki jest ścinanie i fragmentacja DNA, RNA i chromatyny, np. przed immunoprecypitacją chromatyny (ChIP). Fragmentację DNA i RNA można niezawodnie osiągnąć poprzez zerwanie wiązań kowalencyjnych, które utrzymują DNA razem za pomocą sił fizycznych. Używając fizycznego ścinania, takiego jak sonikacja, najpierw nici DNA są łamane, a następnie DNA jest fragmentowane na mniejsze kawałki.
Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest niezawodna i skuteczna w ścinaniu DNA do docelowej długości, np. 500bp (par zasad). Główne zalety ultradźwiękowej fragmentacji DNA obejmują precyzyjną kontrolę parametrów i intensywności procesu ultradźwiękowego. Parametry procesu ultradźwiękowego można regulować poprzez precyzyjne dostrojenie intensywności sonikacji, cykli i czasu. Umożliwia to tworzenie pożądanych rozmiarów DNA, a docelowa długość DNA może być niezawodnie wytwarzana i odtwarzana. Ultradźwiękowe ścinanie DNA jest również idealne do tworzenia fragmentów DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.

Protokoły ultradźwiękowej lizy Drosophila melanogaster

Poniżej znajdują się różne protokoły do wspomaganej ultradźwiękami lizy, ekstrakcji białek i fragmentacji DNA lub chromatyny próbek Drosophila.

Liza ultradźwiękowa do testu immunoprecypitacji z sieciowaniem (CLIP)

Test CLIP przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami z pewnymi modyfikacjami. Około 20 mg jajników od 0 do 1-dniowych samic typu dzikiego usieciowano UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizowano na lodzie w 1 ml buforu RCB (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacharozy, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) uzupełnionym 300 U RNAseOUT i umieszczonym na lodzie na 30 min. Homogenat poddano działaniu ultradźwięków na lodzie, przy 80% mocy, pięć razy w 20-sekundowych seriach z 60-sekundowym odpoczynkiem pomiędzy nimi przy użyciu procesora ultradźwiękowego Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) and centrifuged (16000 × g for 5 min at 4°C). Soluble extract was precleared with 20 μl Protein-G dynabeads for 20 min at 4°C. After removal of samples for immunoblotting and quantitation of RNA input (1%), HP1 was immunoprecipitated with anti-HP1 9A9 antibody from 450 μl precleared extract by incubation for 4 h with 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecipitates were washed 4 times with RCB. To elute the immunoprecipitated RNAs, the pelleted beads were boiled in 100 μL of UltraPure DEPC-treated Water for 5 min. 900 μL Qiazol Reagent was added to the supernatant recovered for RNA preparation. The RNA purified was used as a template to synthesize cDNA using oligo dT, random hexamers and SuperScript reverse transcriptase III according to the manufacturer’s protocol.
(Cassale et al. 2019)

Liza ultradźwiękowa dla testu immunoprecypitacji chromatyny

Immunoprecypitację chromatyny przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną przez Meneta z niewielkimi modyfikacjami. Około 20 mg jajników od 0 do 1-dniowych samic typu dzikiego homogenizowano w 1 ml buforu NEB (10 mM HEPES-Na przy pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na przy pH 8, 0.5 mM EDTA-Na przy pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidyna, 0,15 mM spermina, 1× kompletne inhibitory proteazy wolne od EDTA) za pomocą homogenizatora? dyspergatora zanurzeniowego przez 1 min (przy 3000 obr./min). Homogenat przeniesiono do wstępnie schłodzonego szklanego odbijaka i zastosowano 15 pełnych uderzeń za pomocą ciasnego tłuczka. Następnie wolne jądra odwirowano przy 6000xg przez 10 minut w temperaturze 4°C. Osad zawierający jądra zawieszono ponownie w 1 ml NEB i odwirowano przy 20000 × g przez 20 minut w gradiencie sacharozy (0,65 ml 1,6 M sacharozy w NEB, 0,35 ml 0,8 M sacharozy w NEB). Osad zawieszono ponownie w 1 ml NEB i formaldehydu do końcowego stężenia 1%. Jądra usieciowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wygaszono przez dodanie 1/10 objętości 1,375 M glicyny. Jądra zebrano przez odwirowanie przy 6000 × g przez 5 min. Jądra przemyto dwukrotnie w 1 ml NEB i ponownie zawieszono w 1 ml buforu do lizy (15 mM HEPES-Na przy pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA przy pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% dezoksycholanu Na, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilosarkozyny i 1× kompletne inhibitory proteazy bez EDTA). Jądra poddano sonikacji przy użyciu procesora ultradźwiękowego Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) sześć razy przez 20 s na i 1 min na lodzie. Sonikowane jądra odwirowywano z prędkością 13000 × g przez 4 minuty w temperaturze 4°C. Większość sonikowanej chromatyny miała długość od 500 do 1000 par zasad (bp). Dla każdej immunoprecypitacji, 15 μg chromatyny inkubowano w obecności 10 μg przeciwciała monoklonalnego HP1 9A9 (3 h w 4°C w obracającym się kole). Następnie dodano 50 μl białka G dynabeads i kontynuowano inkubację przez noc w temperaturze 4°C. Supernatanty odrzucono, a próbki przemyto dwukrotnie w buforze do lizy (każde płukanie 15 min w 4°C) i dwukrotnie w buforze TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl przy pH 8). Chromatynę eluowano z kulek w dwóch etapach; najpierw w 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl przy pH 8) w temperaturze 65°C przez 15 minut, a następnie odwirowano i odzyskano supernatant. Materiał kulek ponownie ekstrahowano w 100 μl TE + 0,67% SDS. Połączony eluat (200 μl) inkubowano przez noc w temperaturze 65°C w celu odwrócenia wiązań krzyżowych i poddano działaniu 50 μg/ml RNazyA przez 15 minut w temperaturze 65°C oraz 500 μg/ml Proteinazy K przez 3 godziny w temperaturze 65°C. Próbki ekstrahowano fenolem-chloroformem i wytrącano etanolem. DNA zawieszono ponownie w 25 μl wody. W celu zmaksymalizowania analiz molekularnych z immunoprecypitowanym DNA, geny kandydujące amplifikowano parami za pomocą zoptymalizowanego protokołu duplex-PCR przy użyciu dwóch różnych zestawów starterów o podobnych temperaturach topnienia w pojedynczej reakcji.
(Casale et al. 2019)
 

Wysokowydajne ultradźwiękowe zakłócacze komórek dla próbek biologicznych

Hielscher Ultrasonics jest długoletnim partnerem, jeśli chodzi o wysokowydajne ultrasonografy do rozbijania komórek, lizy, ekstrakcji białek, DNA, RNA i fragmentacji chromatyny, a także innych przedanalitycznych etapów przygotowania próbek. Oferując kompleksowe portfolio ultradźwiękowych homogenizatorów laboratoryjnych i jednostek do przygotowywania próbek, Hielscher posiada idealne urządzenie ultradźwiękowe do zastosowań biologicznych i wymagań.
Klasyczny ultradźwiękowiec z mikrokońcówką, taki jak UP200St (200 W; patrz zdjęcie po lewej) lub jedno z ultradźwiękowych urządzeń do przygotowywania próbek VialTweeter lub UP200St_TD_CupHorn z uchwytem VialHolder są ulubionymi modelami w laboratoriach badawczych i analitycznych. Klasyczna sonda ultradźwiękowa jest idealna, gdy trzeba przygotować mniej próbek do lizy, ekstrakcji lub fragmentacji. Jednostki do przygotowywania próbek VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn pozwalają na jednoczesną sonikację do 10 lub 5 fiolek, odpowiednio.
Jeśli konieczne jest przetworzenie dużej liczby próbek (np. płytki 96-dołkowe, płytki mikromiareczkowe itp. UIP400MTP to idealna konfiguracja do sonikacji. UIP400MTP działa jak większy cuphorn, który jest wypełniony wodą i ma wystarczająco dużo miejsca, aby pomieścić płytki mikrodołkowe. Zasilany przez potężny procesor ultradźwiękowy o mocy 400 W, UIP400MTP zapewnia bardzo równomierną i intensywną sonikację płytek wielodołkowych w celu rozbicia komórek, lizowania próbek, rozpuszczania peletek, ekstrakcji białek lub ścinania DNA.

Precyzyjna kontrola dzięki inteligentnemu oprogramowaniu

Wszystkie rozwiązania sonikacyjne Hielscher od 200 watów wzwyż są wyposażone w cyfrowy kolorowy ekran dotykowy i inteligentne oprogramowanie. Dzięki inteligentnemu protokołowaniu danych wszystkie parametry procesu ultradźwiękowego są automatycznie zapisywane jako plik CSV na wbudowanej karcie SD, gdy tylko ultradźwięk zostanie uruchomiony. Dzięki temu badania i protokołowanie są znacznie wygodniejsze. Po próbach sonikacji lub przygotowaniu próbki można po prostu przejrzeć parametry sonikacji każdego przebiegu sonikacji i porównać je.
Za pomocą intuicyjnego menu można ustawić wiele parametrów przed sonikacją: Na przykład, aby kontrolować temperaturę próbki i zapobiec jej degradacji termicznej, można ustawić górną granicę temperatury próbki. Podłączany czujnik temperatury, który jest dostarczany z jednostką ultradźwiękową, daje procesorowi ultradźwiękowemu informacje zwrotne na temat rzeczywistej temperatury sonikacji. Po osiągnięciu górnego limitu temperatury, urządzenie ultradźwiękowe zatrzymuje się do momentu osiągnięcia dolnej granicy ustawionej ∆T i ponownie automatycznie rozpoczyna sonikację.
Jeśli wymagana jest sonikacja z określonym poborem energii, można wstępnie ustawić końcową energię ultradźwiękową przebiegu sonikacji. Oczywiście pulsacja ultradźwiękowa i tryb cyklu mogą być również ustawiane indywidualnie.
Aby ponownie wykorzystać najbardziej udane parametry sonikacji, można zapisać różne tryby sonikacji (np. czas sonikacji, intensywność, tryb cyklu itp.) jako tryby wstępnie ustawione, dzięki czemu można je łatwo i szybko uruchomić ponownie.
Dla większej wygody obsługi, wszystkie cyfrowe urządzenia ultradźwiękowe mogą być obsługiwane za pomocą pilota zdalnego sterowania w dowolnej popularnej przeglądarce (np. InternetExplorer, Safari, Chrome itp.). Połączenie LAN jest prostą konfiguracją plug-n-play i nie wymaga instalacji dodatkowego oprogramowania.
W Hielscher wiemy, że udana sonikacja próbek biologicznych wymaga precyzji i powtarzalności. Dlatego zaprojektowaliśmy nasze ultradźwięki jako inteligentne urządzenia ze wszystkimi funkcjami, które umożliwiają wydajne, niezawodne, powtarzalne i wygodne przygotowanie próbek.

Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych systemów ultradźwiękowych, od mikro-końcówek ultradźwiękowych i klasycznych homogenizatorów ultradźwiękowych po ultrasonografy MultiSample do wygodnego i niezawodnego przygotowywania wielu próbek: