Ultradźwiękowa liza próbek Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster jest powszechnie wykorzystywana w laboratoriach jako organizm modelowy. Dlatego często konieczne jest wykonywanie przedanalitycznych etapów przygotowania próbek Drosophila melanogaster, takich jak liza, rozbijanie komórek, ekstrakcja białek i ścinanie DNA. Dezintegratory ultradźwiękowe są niezawodne i wydajne, a różne zadania, takie jak liza, ekstrakcja białek czy fragmentacja DNA, można za ich pomocą łatwo wykonywać, dostosowując jedynie parametry procesu ultradźwiękowego. Homogenizatory ultradźwiękowe są zatem wszechstronnymi narzędziami o szerokim zakresie zastosowań.

Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja białek

Liza, solubilizacja komórek, homogenizacja tkanek i ekstrakcja białek to typowe zadania wykonywane za pomocą dezintegratorów ultradźwiękowych w laboratoriach biologicznych. Dezintegratory ultradźwiękowe i urządzenia do rozbijania komórek dobrze nadają się do homogenizacji tkanek zwierzęcych, owadów (np. Drosophila melanogaster, C. elegans) lub okazów roślinnych. Kolejnymi zastosowaniami sonikacji są liza zawiesin komórkowych i osadów oraz ekstrakcja białek wewnątrzkomórkowych.
Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja białek to wysoce niezawodne i powtarzalne procesy, które można przeprowadzać na podstawie ustalonych protokołów. Ponieważ intensywność procesu ultradźwiękowego można precyzyjnie regulować za pomocą parametrów sonikacji, takich jak amplituda, tryb cykliczny / impulsowy, temperatura i objętość próbki, raz sprawdzone protokoły można wielokrotnie powtarzać z takim samym wynikiem.

Ultradźwiękowa fragmentacja DNA i RNA

Po lizie komórek i ekstrakcji białek często wymaganym etapem przygotowania próbek jest ścinanie i fragmentacja DNA, RNA oraz chromatyny, np. przed immunoprecypitacją chromatyny (ChIP). Fragmentację DNA i RNA można niezawodnie uzyskać przez rozerwanie siłami fizycznymi wiązań kowalencyjnych utrzymujących strukturę DNA. Przy zastosowaniu fizycznego ścinania, takiego jak sonikacja, najpierw przerywane są nici DNA, a następnie DNA ulega fragmentacji na mniejsze części.
Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest niezawodną i wydajną metodą ścinania DNA do docelowej długości, np. 500bp (par zasad). Do głównych zalet ultradźwiękowej fragmentacji DNA należy precyzyjna kontrola parametrów i intensywności procesu ultradźwiękowego. Parametry procesu ultradźwiękowego można regulować poprzez precyzyjne dostosowanie intensywności, cykli i czasu sonikacji. Umożliwia to uzyskanie pożądanych rozmiarów DNA, a docelową długość DNA można niezawodnie uzyskiwać i odtwarzać. Ultradźwiękowe ścinanie DNA jest również idealne do uzyskiwania fragmentów DNA o dużej masie cząsteczkowej.

Protokoły ultradźwiękowej lizy Drosophila melanogaster

Poniżej przedstawiono różne protokoły wspomaganej ultradźwiękami lizy, ekstrakcji białek oraz fragmentacji DNA lub chromatyny w próbkach Drosophila.

Ultradźwiękowa liza do oznaczenia metodą immunoprecypitacji z sieciowaniem (CLIP)

Oznaczenie CLIP przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, z pewnymi modyfikacjami. Około 20 mg jajników samic typu dzikiego w wieku od 0 do 1 dnia poddano sieciowaniu promieniowaniem UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizowano na lodzie w 1 mL buforu RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacharozy, 1 mM DTT, 1× Complete Protease Inhibitors bez EDTA, 1 mM PMSF) z dodatkiem 300 U RNAseOUT i umieszczono na lodzie na 30 min. Homogenat poddano sonikacji na lodzie przy 80% mocy, pięciokrotnie w impulsach trwających 20 s, z przerwą 60 s pomiędzy nimi, za pomocą procesora ultradźwiękowego Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) i odwirowano (16 000 × g przez 5 min w 4°C). Rozpuszczalny ekstrakt wstępnie oczyszczano z użyciem 20 μl Protein-G dynabeads przez 20 min w 4°C. Po pobraniu próbek do immunoblottingu i ilościowego oznaczenia wyjściowego RNA (1%) przeprowadzono immunoprecypitację HP1 z 450 μl wstępnie oczyszczonego ekstraktu za pomocą przeciwciała anty-HP1 9A9, inkubując przez 4 h z 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecypitaty przemyto 4 razy buforem RCB. Aby wyeluować RNA poddane immunoprecypitacji, kulki zebrane w osadzie gotowano w 100 μL UltraPure DEPC-treated Water przez 5 min. Do supernatantu odzyskanego w celu przygotowania RNA dodano 900 μL Qiazol Reagent. Oczyszczone RNA wykorzystano jako matrycę do syntezy cDNA z użyciem oligo dT, losowych heksamerów i odwrotnej transkryptazy SuperScript III, zgodnie z protokołem producenta.
(Cassale et al. 2019)

Ultradźwiękowa liza do oznaczenia metodą immunoprecypitacji chromatyny

Immunoprecypitację chromatyny przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną przez Meneta, z niewielkimi modyfikacjami. Około 20 mg jajników samic typu dzikiego w wieku od 0 do 1 dnia homogenizowano w 1 mL buforu NEB (10 mM HEPES-Na przy pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na przy pH 8, 0,5 mM EDTA-Na przy pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidyny, 0,15 mM sperminy, 1× Complete Protease Inhibitors bez EDTA) za pomocą homogenizatora / dyspergatora zanurzeniowego przez 1 min (przy 3000 rpm). Homogenat przeniesiono do wstępnie schłodzonego szklanego homogenizatora Dounce’a i wykonano 15 pełnych ruchów ściśle dopasowanym tłokiem. Następnie wolne jądra komórkowe odwirowano przy 6000xg przez 10 min w 4°C. Osady zawierające jądra ponownie zawieszono w 1 mL NEB i odwirowano przy 20 000 × g przez 20 min w gradiencie sacharozy (0,65 mL sacharozy o stężeniu 1,6 M w NEB, 0,35 mL sacharozy o stężeniu 0,8 M w NEB). Osad ponownie zawieszono w 1 mL NEB z formaldehydem do końcowego stężenia 1%. Jądra poddawano sieciowaniu przez 10 min w temperaturze pokojowej, a reakcję zatrzymano przez dodanie 1/10 objętości glicyny o stężeniu 1,375 M. Jądra zebrano przez wirowanie przy 6000 × g przez 5 min. Jądra przemyto dwukrotnie w 1 mL NEB i ponownie zawieszono w 1 mL buforu do lizy (15 mM HEPES-Na przy pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA przy pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilosarkozyny i 1× Complete Protease Inhibitors bez EDTA). Jądra poddano sonikacji za pomocą procesora ultradźwiękowego Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) w sześciu powtórzeniach obejmujących 20 s sonikacji i 1 min na lodzie. Jądra poddane sonikacji odwirowano przy 13 000 × g przez 4 min w 4°C. Większość chromatyny poddanej sonikacji miała długość od 500 do 1000 par zasad (bp). Do każdej immunoprecypitacji inkubowano 15 μg chromatyny w obecności 10 μg przeciwciała monoklonalnego HP1 9A9 (3 h w 4°C na obracającym się kole). Następnie dodano 50 μl dynabeads protein G i kontynuowano inkubację przez noc w 4°C. Supernatanty odrzucono, a próbki przemyto dwukrotnie buforem do lizy (każde przemywanie przez 15 min w 4 °C) i dwukrotnie buforem TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl przy pH 8). Chromatynę eluowano z kulek w dwóch etapach; najpierw w 100 μl buforu do elucji 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl przy pH 8) w 65°C przez 15 min, po czym przeprowadzono wirowanie i odzyskano supernatant. Materiał z kulek ponownie ekstrahowano w 100 μl TE + 0,67% SDS. Połączony eluat (200 μl) inkubowano przez noc w 65°C w celu odwrócenia sieciowania, a następnie poddano działaniu RNaseA o stężeniu 50 μg/ml przez 15 min w 65°C oraz proteinazy K o stężeniu 500 μg/ml przez 3 h w 65°C. Próbki poddano ekstrakcji fenolem–chloroformem i strącaniu etanolem. DNA ponownie zawieszono w 25 μl wody. Aby zmaksymalizować zakres analiz molekularnych z użyciem DNA poddanego immunoprecypitacji, geny kandydujące amplifikowano parami zgodnie ze zoptymalizowanym protokołem duplex-PCR, stosując w jednej reakcji dwa różne zestawy starterów o podobnych temperaturach topnienia.
(Casale et al. 2019)
 

Wysokowydajne ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek w próbkach biologicznych

Hielscher Ultrasonics to partner z wieloletnim doświadczeniem w zakresie wysokowydajnych sonikatorów do rozbijania komórek, lizy, ekstrakcji białek, fragmentacji DNA, RNA i chromatyny oraz innych przedanalitycznych etapów przygotowania próbek. Oferując kompleksową gamę ultradźwiękowych homogenizatorów laboratoryjnych i urządzeń do przygotowania próbek, Hielscher ma idealne urządzenie ultradźwiękowe do Twoich zastosowań biologicznych i wymagań.
Klasyczny sonikator z sonotrodą wyposażoną w mikrokońcówkę, taki jak UP200St (200W; zob. zdjęcie po lewej), lub jedno z ultradźwiękowych urządzeń do przygotowania próbek VialTweeter lub UP200ST_TD_CupHorn z VialHolder to ulubione modele w laboratoriach badawczych i analitycznych. Klasyczna sonotroda jest idealna, gdy mniejsza liczba próbek wymaga lizy, ekstrakcji lub fragmentacji. Urządzenia do przygotowania próbek VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn umożliwiają jednoczesną sonikację odpowiednio do 10 lub 5 fiolek.
Jeśli konieczne jest przetwarzanie dużej liczby próbek (np. płytek 96-dołkowych, płytek mikrotitracyjnych itp.), UIP400MTP jest idealnym układem do sonikacji. UIP400MTP działa jak większy cuphorn, który jest wypełniony wodą i ma wystarczająco dużo miejsca, aby pomieścić płytki z mikrodołkami. Zasilany wydajnym procesorem ultradźwiękowym o mocy 400 watów, UIP400MTP zapewnia bardzo równomierną i intensywną sonikację płytek wielodołkowych w celu rozbijania komórek, lizy próbek, solubilizacji osadów, ekstrakcji białek lub ścinania DNA.

Precyzyjna kontrola dzięki inteligentnemu oprogramowaniu

Wszystkie rozwiązania Hielscher do sonikacji o mocy od 200 watów wzwyż są wyposażone w cyfrowy kolorowy ekran dotykowy i inteligentne oprogramowanie. Dzięki inteligentnemu rejestrowaniu danych wszystkie parametry procesu ultradźwiękowego są automatycznie zapisywane jako plik CSV na wbudowanej karcie SD od chwili uruchomienia sonikatora. Znacznie ułatwia to prowadzenie badań i dokumentowanie procesów. Po próbach sonikacji lub przygotowaniu próbek można łatwo przejrzeć parametry każdego przebiegu sonikacji i porównać je.
Za pomocą intuicyjnego menu można wstępnie ustawić wiele parametrów przed sonikacją: na przykład, aby kontrolować temperaturę próbki i zapobiec jej degradacji termicznej, można ustawić górną granicę temperatury próbki. Podłączany czujnik temperatury, dostarczany wraz z urządzeniem ultradźwiękowym, przekazuje procesorowi ultradźwiękowemu informacje o rzeczywistej temperaturze sonikacji. Po osiągnięciu górnej granicy temperatury urządzenie ultradźwiękowe wstrzymuje pracę do momentu osiągnięcia dolnej granicy ustawionego ∆T, a następnie automatycznie wznawia sonikację.
Jeśli wymagana jest sonikacja z określoną ilością dostarczanej energii, można wstępnie ustawić końcową energię ultradźwiękową danego przebiegu sonikacji. Oczywiście można również indywidualnie ustawić pulsację ultradźwiękową i tryb cykliczny.
Aby ponownie wykorzystać najskuteczniejsze parametry sonikacji, można zapisać różne tryby sonikacji (np. czas sonikacji, intensywność, tryb cykliczny itp.) jako ustawienia wstępne, dzięki czemu można je łatwo i szybko ponownie uruchomić.
Dla większej wygody obsługi wszystkimi cyfrowymi urządzeniami ultradźwiękowymi można sterować zdalnie za pomocą dowolnej popularnej przeglądarki (np. InternetExplorer, Safari, Chrome itp.). Połączenie LAN jest prostym rozwiązaniem typu plug-n-play i nie wymaga instalacji dodatkowego oprogramowania.
W Hielscher wiemy, że skuteczna sonikacja próbek biologicznych wymaga precyzji i powtarzalności. Dlatego zaprojektowaliśmy nasze sonikatory jako inteligentne urządzenia wyposażone we wszystkie funkcje umożliwiające wydajne, niezawodne, powtarzalne i wygodne przygotowanie próbek.

Poniższa tabela przedstawia orientacyjną zdolność przetwarzania naszych systemów ultradźwiękowych, od mikrokońcówek ultradźwiękowych i klasycznych homogenizatorów ultradźwiękowych po sonikatory MultiSample do wygodnego i niezawodnego przygotowania wielu próbek: