Ultradźwiękowa liza E. coli

Bakterie E. coli są najczęściej wykorzystywanymi bakteriami w mikrobiologii i biotechnologii.
Ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek zapewniają wiarygodne i powtarzalne wyniki lizy E. coli.
Intensywna, a zarazem precyzyjnie kontrolowana kawitacja i siły ścinające prowadzą do całkowitego rozbicia komórek i wysokiej wydajności ekstrakcji (np. białek, DNA).

Dlaczego ultradźwiękowe rozbijanie komórek E. coli jest preferowaną metodą?

Homogenizatory ultradźwiękowe lub sonikatory sondowe oferują szereg korzyści przy lizie E. coli, ponieważ intensywne ultradźwięki skutecznie rozbijają ściany i błony komórkowe. Sonikatory sondowe są powszechnie stosowane do lizy E. coli z następujących powodów:

Skuteczne rozbijanie ścian komórkowych: E. coli ma półsztywną ścianę komórkową zbudowaną z peptydoglikanu, której rozbicie tradycyjnymi metodami lizy może być trudne. Sonikator sondowy generuje intensywne fale ultradźwiękowe, które tworzą pęcherzyki kawitacyjne w cieczy otaczającej komórki. Gdy pęcherzyki te zapadają się, wytwarzają strumienie cieczy o dużej prędkości i fale uderzeniowe, które powodują mechaniczne rozbicie ścian komórkowych, skutecznie uwalniając zawartość komórek, taką jak biomolekuły.

Zwiększona penetracja: Fale ultradźwiękowe generowane przez sondę / sonotrodę mogą wnikać głęboko w próbkę, docierając do większej liczby komórek E. coli i poddając je równomiernej obróbce. Pomaga to zapewnić bardziej równomierną lizę w całej próbce, co zwiększa skuteczność rozbijania komórek.

Skrócony czas przetwarzania: Energia dostarczana przez sonikator sondowy jest silnie skoncentrowana i zlokalizowana, co prowadzi do szybkiej i skutecznej lizy komórek. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak rozbijanie za pomocą kulek lub liza enzymatyczna, sonikacja może doprowadzić do lizy E. coli w ciągu minut, a nawet sekund. Podczas gdy wiele alternatywnych technik, takich jak zamrażanie i rozmrażanie, wymaga kilku cykli obróbki, liza ultradźwiękowa otwiera komórki w jednym etapie procesu.

Kontrola temperatury: Najnowocześniejsze sonikatory są wyposażone w czujniki temperatury i inteligentne oprogramowanie, które umożliwia ustawienie maksymalnej temperatury procesu. Sonikator automatycznie wstrzymuje pracę po osiągnięciu granicznej temperatury i rozpoczyna proces sonikacji po osiągnięciu ustawionej wartości temperatury. Chłodzenie próbek w łaźni lodowej to prosty sposób na utrzymanie niskiej temperatury próbki i zapobieganie jej degradacji pod wpływem ciepła.

Skalowalność: Sonikatory sondowe są dostępne w różnych rozmiarach, od urządzeń ręcznych po wielkoskalowe modele przemysłowe. Dzięki temu nadają się do przetwarzania małych objętości w laboratorium lub do zwiększania skali na potrzeby większych zastosowań bioprocesowych, np. produkcji szczepionek lub biosyntezy cząsteczek.

Wszechstronność: Sonikatory mogą być stosowane w różnych zastosowaniach poza lizą komórek, takich jak ścinanie DNA, ekstrakcja białek, homogenizacja tkanek, dyspergowanie nanocząstek i emulgowanie. Dlatego inwestycja w sonikator sondowy zapewnia wszechstronność w badaniach lub zastosowaniach przemysłowych.

Sonikatory sondowe, takie jak UP200St, są niezawodnymi homogenizatorami tkanek i urządzeniami do rozbijania komórek, dlatego są powszechnie stosowane do przygotowania próbek w genetyce, np. do lizy E.coli

Ekstrakcję białek z komórek E.coli skutecznie przeprowadza się za pomocą sondy ultradźwiękowej UP200St

Sonikator sondowy oferuje wiele korzyści przy lizie E. coli. Niezawodna i precyzyjna kontrola parametrów procesu ultradźwiękowego umożliwia optymalizację parametrów pracy, takich jak moc, czas trwania i sposób postępowania z próbką, w celu uzyskania pożądanych wyników.

Ten poradnik wyjaśnia, jaki typ sonikatora najlepiej sprawdza się w przygotowaniu próbek, między innymi do lizy, rozbijania komórek, izolacji białek oraz fragmentacji DNA i RNA w laboratoriach, analizie i badaniach naukowych. Proszę wybrać typ sonikatora najlepiej dopasowany do zastosowania, objętości i liczby próbek oraz wymaganej przepustowości. Hielscher Ultrasonics oferuje idealny homogenizator ultradźwiękowy do Państwa potrzeb!

Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest często stosowana jako etap przygotowania próbek w sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS)

Analizy elektroforetyczne genomowego DNA E. coli EDL933 poddanego sonikacji przez 0 – 15 min. L oznacza drabinkę DNA.
(badanie i ilustracja: ©Basselet et al. 2008)

Rozbijanie komórek za pomocą kawitacji ultradźwiękowej

Sondowe homogenizatory ultradźwiękowe pracują z częstotliwością około 20 000 cykli na sekundę (przy 20kHz) i wywołują kawitację w cieczach lub zawiesinach. Kawitacja akustyczna tworzy mikroskopijne obszary o ciśnieniu zbliżonym do próżni i wysokich temperaturach, które rozrywają komórki. Chociaż temperatury mogą osiągać kilka tysięcy stopni Celsjusza, objętości obszarów kawitacji są tak małe, że nie powodują istotnego nagrzewania medium procesowego. Kawitacja akustyczna i siły ścinające generowane przez ultradźwięki perforują lub rozrywają błonę komórkową komórek bakteryjnych, takich jak E.coli. Sonikatory Hielscher umożliwiają precyzyjną kontrolę parametrów procesu, takich jak intensywność ultradźwięków, amplituda, dostarczana energia i temperatura. Dzięki temu proces lizy ultradźwiękowej można optymalnie dostosować do typu komórek, hodowli komórkowej i celu procesu.

Zalety lizy ultradźwiękowej

precyzyjna kontrola lizy (intensywność, amplituda, temperatura)
wiarygodne, powtarzalne wyniki
optymalne dostosowanie do konkretnych próbek
kontrola temperatury
do próbek od bardzo małych po bardzo duże (od µL do litrów)
obróbka wyłącznie mechaniczna
łatwa i bezpieczna obsługa
liniowe zwiększanie skali od laboratorium do produkcji

Urządzenie ultradźwiękowe VialTweeter umożliwia jednoczesne przygotowanie próbek w maksymalnie 10 fiolkach w takich samych warunkach procesu. (Kliknij, aby powiększyć!)

VialTweeter do lizy ultradźwiękowej

Homogenizator ultradźwiękowy a inne techniki lizy

Podczas gdy liza chemiczna i enzymatyczna mogą być problematyczne – ponieważ liza chemiczna może zmieniać struktury białek i powodować problemy z oczyszczaniem, a liza enzymatyczna wymaga długich czasów inkubacji i nie jest powtarzalna – rozbijanie ultradźwiękowe jest zaawansowaną, szybką metodą rozbijania komórek.
Liza ultradźwiękowa opiera się wyłącznie na siłach mechanicznych. Nie dodaje się żadnych substancji chemicznych; sonikacja rozbija ścianę komórkową za pomocą sił ścinających. Liza chemiczna może zmieniać strukturę białek i powodować problemy z oczyszczaniem. Rozbijanie enzymatyczne wymaga długich czasów inkubacji i nie jest powtarzalne. Ultradźwiękowe rozbijanie komórek bakterii E.coli jest szybkie, proste, niezawodne i powtarzalne. Dlatego sonikatory Hielscher są stosowane w laboratoriach biologicznych i biochemicznych na całym świecie do przygotowania próbek, czynności przedanalitycznych, diagnostyki in vitro i różnorodnych oznaczeń.

Ogólne zalecenia dotyczące lizy ultradźwiękowej

Sonikacja jest najpopularniejszą techniką lizy bardzo małych, średnich i dużych ilości zawiesin komórkowych – od pikolitrów do 100L/hr (z zastosowaniem ultradźwiękowej komory przepływowej). Komórki ulegają lizie wskutek ścinania w cieczy i kawitacji. Podczas sonikacji DNA również podlega ścinaniu, dlatego dodawanie DNazy do zawiesiny komórkowej nie jest konieczne.

Kontrola temperatury podczas ultradźwiękowej lizy E.coli
Wstępne schłodzenie próbki i utrzymywanie jej na lodzie podczas sonikacji pozwala łatwo zapobiec termicznej degradacji próbki.
Najlepiej utrzymywać próbki podczas lizy w temperaturze zbliżonej do temperatury lodu, ale w przypadku większości próbek wystarczy, aby temperatura nie wzrastała powyżej temperatury hodowli lub tkanki źródłowej. Dlatego zaleca się utrzymywanie zawiesiny na lodzie i przeprowadzanie sonikacji za pomocą kilku krótkich impulsów ultradźwiękowych trwających 5–10 sec, z przerwami trwającymi 10–30 sec. Podczas przerw ciepło może się rozpraszać, co pozwala przywrócić niską temperaturę. Do większych próbek komórkowych dostępne są różne reaktory z komorami przepływowymi wyposażonymi w płaszcze chłodzące.
Przeczytaj tutaj szczegółowe wskazówki i zalecenia dotyczące skutecznej lizy ultradźwiękowej!

Protokoły ultradźwiękowego przygotowania lizatów E. coli

Naukowcy stosują homogenizatory ultradźwiękowe Hielscher do rozbijania komórek E.coli. Poniżej przedstawiono różne przetestowane i sprawdzone protokoły lizy E.coli z zastosowaniem homogenizatorów ultradźwiękowych Hielscher w różnych zastosowaniach związanych z E. coli.

Wzrost komórek, sieciowanie i przygotowanie ekstraktów komórkowych E. coli za pomocą ultradźwięków

Na potrzeby ChIP-Chip dla SeqA i polimerazy RNA hodowano E. coli MG1655 lub MG1655 ΔseqA w temperaturze 37°C do OD₆₀₀ wynoszącej około 0,15 w 50 ml LB (+ 0,2% glukozy), po czym dodano 27 μl formaldehydu (37%) na ml pożywki (stężenie końcowe 1%). Sieciowanie prowadzono przy powolnym wytrząsaniu (100 rpm) w temperaturze pokojowej przez 20 min, a następnie reakcję zatrzymano za pomocą 10 ml glicyny o stężeniu 2,5 M (stężenie końcowe 0,5 M). W doświadczeniach z szokiem cieplnym E. coli MG1655 hodowano w 65 ml pożywki LB w temperaturze 30°C do OD₆₀₀ wynoszącej około 0,3. Następnie 30 ml hodowli przeniesiono do kolby wstępnie ogrzanej do 43°C, a pozostałą część utrzymywano w temperaturze 30°C. Sieciowanie i zatrzymanie reakcji przeprowadzono w sposób opisany powyżej, z tym wyjątkiem, że komórki utrzymywano w temperaturze 30 lub 43°C przez 5 min przed dalszym powolnym wytrząsaniem w temperaturze pokojowej. Komórki zebrano przez wirowanie i dwukrotnie przemyto zimnym TBS (pH7.5). Po ponownym zawieszeniu w 1 ml buforu do lizy (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharozy, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozymu) i inkubacji w temperaturze 37°C przez 30 min, po której dodano 4 ml buforu IP, komórki poddano sonikacji na lodzie w 12 cyklach po 30 sec z przerwami po 30 sec, używając procesora ultradźwiękowego Hielscher UP400St przy ustawieniu mocy 100%. Po wirowaniu przez 10 min przy 9000 g porcje supernatantu o objętości 800 μl przechowywano w temperaturze -20°C. (Waldminghaus 2010)

Nadprodukcja i oczyszczanie enzymów za pomocą sondy ultradźwiękowej

W celu nadprodukcji białek ze znacznikiem dekahistydynowym (His10) komórki E. coli BL21(DE3) transformowano konstruktami pET19b. Hodowlę wstępną prowadzoną przez noc zebrano przez wirowanie, a 1% wykorzystano do zaszczepienia hodowli ekspresyjnej. Komórki zawierające pET19mgtB hodowano w temperaturze 22°C do osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) wynoszącej 0,7. Hodowlę przeniesiono do temperatury 17°C i indukowano za pomocą 100 μM IPTG. Po 16 h hodowlę zebrano przez wirowanie przy 7 500 × g w temperaturze 4°C. Komórki ponownie zawieszono w 50 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 0,3 M NaCl przy pH 7,4 i rozbito za pomocą sonikacji z użyciem sonotrody S2 z mikrokońcówką podłączonej do sonikatora Hielscher UP200St przy ustawieniu cyklu 0,5 i amplitudzie 75%.
Nadprodukcję GtfC ze znacznikiem dekahistydynowym indukowano w temperaturze 37°C przy OD₆₀₀ wynoszącej 0,6 za pomocą 100 μM IPTG. Następnie komórki inkubowano przez 4 h, zebrano i poddano lizie w sposób opisany powyżej dla MgtB.
Surowe ekstrakty komórkowe wirowano przy 15 000 × g i w temperaturze 4°C w celu osadzenia resztek komórkowych. Sklarowane ekstrakty nanoszono na kolumny HisTrap FF Crude o objętości 1 ml za pomocą systemu ÄKTAprime Plus. Enzymy oczyszczano zgodnie z protokołem producenta dotyczącym elucji gradientowej białek ze znacznikiem His. Wyeluowane roztwory białek poddawano dwukrotnej dializie wobec 1 000 objętości 50 mM PBS, pH 7,4, z 0,3 M NaCl w temperaturze 4°C. Oczyszczanie analizowano za pomocą 12% SDS-PAGE. Stężenie białka oznaczano metodą Bradforda z użyciem Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Ultradźwiękowa ekstrakcja białka z bakterii E. coli
Badane białko pełniące rolę przynęty (w tym przypadku MTV1 z Arabidopsis thaliana) łączy się ze znacznikiem GST i poddaje ekspresji w komórkach Escherichia coli (E. coli) BL21.

Pobierz po jednym osadzie GST-MTV1 i GST (odpowiadającym 50 ml hodowli bakteryjnej) i ponownie zawieś każdy w 2,5 mL buforu ekstrakcyjnego schłodzonego do temperatury lodu.
Użyj sonikatora UP100H (wyposażonego w sonotrodę MS3 z mikrokońcówką do małych objętości, około 2–5mL), aby rozbijać komórki bakteryjne do momentu ich lizy, na którą wskazują zmniejszona nieprzezroczystość i zwiększona lepkość. Należy przeprowadzać to na lodzie; zaleca się sonikację w odstępach (np. 10 sec sonikacji, a następnie 10 sec przerwy na lodzie i tak dalej). Należy uważać, aby nie prowadzić sonikacji ze zbyt dużą intensywnością. W przypadku zaobserwowania pienienia lub powstawania białego osadu należy zmniejszyć intensywność.
Przenieś roztwór zlizowanych bakterii do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 mL i wiruj w temperaturze 4°C przy 16 000 x g przez 20 min.

Sondy ultradźwiękowe wykorzystują siły kawitacji akustycznej do rozbijania komórek oraz ekstrakcji cząsteczek i DNA z E.coli.

Sonikatory sondowe, takie jak UP400St, wykorzystują zasadę działania kawitacji akustycznej do skutecznej lizy E.coli.

Analiza ekspresji i oczyszczanie białka rekombinowanego z zastosowaniem sonikacji

Osad E. coli poddano sonikacji za pomocą sonikatora Hielscher UP100H. W tym celu osad komórkowy ponownie zawieszono w schłodzonym buforze do lizy (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i chłodzono na lodzie przez 10 min. Następnie zawiesinę komórkową poddano sonikacji za pomocą 10 krótkich impulsów po 10 s z następującymi po nich przerwami po 30 s na chłodzenie. Na koniec resztki komórkowe usunięto przez ultrawirowanie w temperaturze 4°C przez 15 min przy 14 000 rpm. W celu potwierdzenia ekspresji rPR supernatant poddano elektroforezie w 12% żelu poliakrylamidowym i analizowano za pomocą SDS-PAGE oraz Western blot. rPR oczyszczano przy użyciu złoża Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) zgodnie z instrukcją producenta. Na tym etapie zastosowano metodę oczyszczania w warunkach natywnych. Czystość oczyszczonego białka oceniono za pomocą elektroforezy w 12% żelu poliakrylamidowym i późniejszego barwienia błękitem Coomassie. Stężenie oczyszczonego białka zmierzono za pomocą zestawu Micro BCA do oznaczania białka (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Film przedstawia ultradźwiękowy cuphorn o mocy 200 watów do dyspergowania, homogenizacji, ekstrakcji lub odgazowywania próbek laboratoryjnych.

Homogenizatory ultradźwiękowe do lizy E. coli

Hielscher Ultrasonics projektuje, produkuje i dostarcza wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe do niezawodnej i skutecznej lizy bakterii E. coli oraz innych typów komórek, tkanek i hodowli komórkowych.
Szeroka oferta sond ultradźwiękowych oraz systemów sonikacji pośredniej pozwala nam zaoferować idealny ultradźwiękowy homogenizator tkanek do danego zastosowania w rozbijaniu komórek i ekstrakcji.

Projektowanie, produkcja i doradztwo – jakość wyprodukowana w Niemczech

Sonikatory Hielscher są znane z najwyższych standardów jakości i projektowania. Inteligentne oprogramowanie, intuicyjne menu, programowalne ustawienia i automatyczne rejestrowanie danych to tylko niektóre z funkcji sonikatorów Hielscher. Solidna konstrukcja i łatwa obsługa umożliwiają sprawną integrację naszych sonikatorów z placówkami badawczymi i biotechnologicznymi. Sonikatory Hielscher z łatwością radzą sobie nawet w trudnych warunkach i wymagającym otoczeniu.

Hielscher Ultrasonics jest firmą posiadającą certyfikat ISO i kładzie szczególny nacisk na wysokowydajne sonikatory, które wyróżniają się najnowocześniejszą technologią i łatwością obsługi. Oczywiście sonikatory Hielscher są zgodne z wymaganiami CE i spełniają wymagania UL, CSA oraz RoHs.

Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych sonikatorów:

Objętość partii	Natężenie przepływu	Zalecane urządzenia
płytki wielodołkowe / mikrotitracyjne	nie dotyczy	UIP400MTP
CupHorn do fiolek lub zlewki	nie dotyczy	Ultrasonic CupHorn
ultradźwiękowy mikroreaktor przepływowy	nie dotyczy	GDmini2
do 10 fiolek o objętości od 0,5 do 1,5mL	nie dotyczy	VialTweeter
od 0,5 do 1,5mL	nie dotyczy	VialTweeter
od 1 do 500mL	od 10 do 200mL/min	UP100H
od 10 do 2000mL	od 20 do 400mL/min	UP200Ht, UP400St
od 0,1 do 20L	od 0,2 do 4L/min	UIP2000hdT
od 10 do 100L	od 2 do 10L/min	UIP4000
nie dotyczy	od 10 do 100L/min	UIP16000
nie dotyczy	większe	zespół urządzeń UIP16000

Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!

Film przedstawia ultradźwiękowy system przygotowania próbek UIP400MTP, który umożliwia niezawodne przygotowanie próbek w dowolnych standardowych płytkach wielodołkowych za pomocą ultradźwięków o wysokim natężeniu. Typowe zastosowania UIP400MTP obejmują lizę komórek, fragmentację DNA, RNA i chromatyny oraz ekstrakcję białek.

Dodatkowe protokoły ultradźwiękowej lizy E. coli

Białka modyfikowane allicyną w E. coli z zastosowaniem ultradźwiękowego urządzenia VialTweeter

Oznaczanie zawartości grup sulfhydrylowych za pomocą testu z kwasem 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoesowym) (DTNB)
Hodowlę E. coli MG1655 prowadzoną przez noc wykorzystano do zaszczepienia pożywki minimalnej MOPS (1:100). Hodowlę prowadzono w warunkach tlenowych do osiągnięcia A600 wynoszącej 0,4. Hodowlę podzielono na trzy hodowle po 15 ml w celu poddania ich działaniu czynników stresowych. Hodowla niepoddana temu działaniu służyła jako kontrola ujemna. Do jednej z dwóch pozostałych hodowli dodano 0,79 mM allicyny (128 μg ml-1), a do drugiej 1 mM diamidu. Hodowle inkubowano przez 15 min. Z każdej hodowli zebrano 5 ml przez wirowanie (8 525 × g, 4°C, 10 min). Komórki dwukrotnie przemyto 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, przechowywanego przed użyciem w warunkach beztlenowych) i odwirowano (13 000 × g, 4°C, 10 min). Komórki ponownie zawieszono w buforze do lizy (PBS z 6 mM chlorowodorku guanidyny, pH 7,4) przed rozbiciem w temperaturze 4°C za pomocą sonikacji (sonikator VialTweeter , Hielscher GmbH, Niemcy) (3 × 1 min). Resztki komórkowe osadzono przez wirowanie (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant przeniesiono do kuwety QS-macro o objętości 3,5 ml (10 mm), zawierającej magnetyczny pręcik mieszający, i zmieszano z 1 ml buforu do lizy. Absorbancję próbek monitorowano przy 412 nm za pomocą spektrofotometru Jasco V-650 wyposażonego w uchwyt kuwet PSC-718 z kontrolą temperatury, w temperaturze pokojowej. Dodano 100μl roztworu kwasu ditiobis(2-nitrobenzoesowego) o stężeniu 3 mM. Absorbancję monitorowano do osiągnięcia nasycenia. Stężenie tioli obliczono z wykorzystaniem współczynnika ekstynkcji ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 dla kwasu tio-2-nitrobenzoesowego (TNB). Stężenia tioli w komórkach obliczono na podstawie objętości komórek E. coli wynoszącej 6,7 × 10^-15 litra i gęstości komórek A600 = 0,5 (odpowiadającej 1 × 10⁸ komórek ml^-1 hodowli). (Müller et al. 2016)

Oznaczanie glutationu in vivo z zastosowaniem ultradźwiękowego urządzenia do rozbijania komórek

E.coli MG1655 hodowano w pożywce minimalnej MOPS w całkowitej objętości 200ml do osiągnięcia A600 wynoszącej 0,5. Hodowlę podzielono na hodowle po 50 ml w celu poddania ich działaniu czynników stresowych. Po 15 min inkubacji z 0,79 mM allicyny, 1 mM diamidu lub dimetylosulfotlenkiem (kontrola) komórki zebrano przy 4 000g w temperaturze 4°C przez 10 min. Komórki dwukrotnie przemyto buforem KPE przed ponownym zawieszeniem osadów w 700µl buforu KPE. W celu odbiałczenia dodano 300l 10% (w/v) kwasu sulfosalicylowego przed rozbiciem komórek za pomocą sonikacji (3 x 1 min; sonikator VialTweeter ). Supernatanty zebrano po wirowaniu (30 min, 13 000g, 4°C). Stężenia kwasu sulfosalicylowego zmniejszono do 1% przez dodanie 3 objętości buforu KPE. Pomiary glutationu całkowitego i GSSG przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Stężenia glutationu w komórkach obliczono na podstawie objętości komórek E. coli wynoszącej 6,7×10^-15 litra i gęstości komórek A600 0,5 (odpowiadającej 1×10⁸ komórek ml^-1 hodowli). Stężenia GSH obliczono przez odjęcie 2[GSSG] od glutationu całkowitego. (Müller et al. 2016)

Ekspresja ludzkiej mAspAT w E. coli z zastosowaniem homogenizatora ultradźwiękowego

Pojedynczą kolonię E. coli BL21 (DE3) zawierającą wektor ekspresyjny umieszczono w 30 mL pożywki Luria-Bertani (LB) zawierającej 100μg/mL ampicyliny, a następnie hodowano w temperaturze 37ºC do osiągnięcia gęstości optycznej (OD₆₀₀) wynoszącej 0,6. Komórki zebrano przez wirowanie przy 4 000 × g przez 10 min i ponownie zawieszono w 3L świeżej pożywki LB zawierającej 100μg/mL ampicyliny.
Następnie ekspresję białka indukowano za pomocą 1 mM izopropylo-β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) przez 20 h w temperaturze 16ºC. Komórki zebrano przez wirowanie przy 8 000 × g przez 15 min i przemyto buforem A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Z 3 L hodowli uzyskano około 45g komórek (mokra masa). Po wirowaniu osady komórkowe ponownie zawieszono w 40 mL (na 1 L hodowli) buforu ekstrakcyjnego A schłodzonego do temperatury lodu i poddano lizie przez sonikację w temperaturze zbliżonej do temperatury lodu, używając ultradźwiękowego urządzenia do rozbijania komórek Hielscher UP400St. Lizat komórkowy wirowano przy 12 000 rpm przez 15 min w celu oddzielenia frakcji rozpuszczalnej (supernatant) i wytrąconej (osad). (Jiang et al. 2015)

Powiązane tematy

Fakty, które warto znać

E.coli

Escherichia coli (E. coli) jest Gram-ujemną, względnie beztlenową bakterią z grupy coli, o kształcie pałeczki, należącą do rodzaju Escherichia, powszechnie występującą w dolnej części jelita organizmów stałocieplnych (endotermów). Istnieje duża liczba szczepów (lub podtypów) E. coli o zróżnicowanych cechach. Większość szczepów E. coli jest nieszkodliwa dla ludzi, np. szczepy B i K-12, które są powszechnie wykorzystywane do badań w laboratoriach. Niektóre szczepy są jednak szkodliwe i mogą powodować poważne choroby.
E. coli odgrywa ważną rolę we współczesnej inżynierii biologicznej i mikrobiologii przemysłowej, ponieważ bakteria ta jest łatwa do modyfikowania. Typowe zastosowania laboratoryjne, które często obejmują wykorzystanie E. coli, np. do tworzenia rekombinowanego kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) lub w roli organizmu modelowego.
E. coli jest bardzo wszechstronnym gospodarzem do produkcji białek heterologicznych, a do wytwarzania białek rekombinowanych w E. coli dostępne są różnorodne systemy ekspresji białek. Za pomocą plazmidów umożliwiających wysoki poziom ekspresji białek można wprowadzać geny do bakterii, co pozwala produkować takie białka w dużych ilościach w przemysłowych procesach fermentacji.
E.coli są wykorzystywane jako fabryki komórkowe do produkcji insuliny. Dalsze zastosowania obejmują wykorzystanie zmodyfikowanych komórek E. coli do opracowywania i produkcji szczepionek oraz immobilizowanych enzymów, do produkcji biopaliw, a także do bioremediacji.
Szczep K-12 jest zmutowaną formą E. coli, która wykazuje nadekspresję enzymu fosfatazy alkalicznej (ALP). Mutacja ta wynika z defektu genu, który stale koduje ten enzym. Jeśli gen wytwarza produkt bez jakiegokolwiek hamowania, określa się to jako aktywność konstytutywną. Ta konkretna zmutowana forma jest wykorzystywana do izolacji i oczyszczania enzymu ALP.
Bakterie E. coli są również powszechnie wykorzystywane jako fabryki komórkowe. Mikroorganizmy zmodyfikowane metodami inżynierii (np. bakterie) i komórki roślinne mogą być wykorzystywane jako tak zwane fabryki komórkowe. Te genetycznie zmodyfikowane komórki produkują cząsteczki, substancje chemiczne, polimery, białka i inne substancje, wykorzystywane na przykład w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym i chemicznym. Aby uwolnić cząsteczki wytwarzane we wnętrzu takich komórek zmodyfikowanych metodami bioinżynierii, powszechnie stosuje się lizę ultradźwiękową do rozbijania ścian komórkowych i przenoszenia substancji docelowych do otaczającej cieczy. Przeczytaj więcej o lizie komórek zmodyfikowanych metodami bioinżynierii!

Ultradźwiękowe ścinanie DNA

Ultradźwiękowe siły ścinające są powszechnie stosowane do uwalniania cząsteczek, organelli i białek z wnętrza komórek, a także do rozbijania nici DNA na fragmenty. Kawitacja akustyczna rozbija ściany i błony komórkowe, umożliwiając ekstrakcję DNA z komórek i wytworzenie fragmentów o długości około 600 – 800 bp, co jest idealne do analizy.
Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej o homogenizatorach ultradźwiękowych do fragmentacji DNA!

Literatura / źródła

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Ultradźwięki o wysokiej wydajności! Oferta produktów Hielscher obejmuje pełne spektrum od kompaktowego sonikatora laboratoryjnego, przez urządzenia stołowe, po w pełni przemysłowe systemy ultradźwiękowe.

Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe w rozmiarach od laboratoryjnych po przemysłowe.