Ultradźwiękowy lizy E. coli

  • E. coli, bakterii najbardziej powszechnie stosowanych bakterii w mikrobiologii i biotechnologii.
  • zaburzające ultradźwiękowe komórkowe zapewniają wiarygodne i powtarzalne wyniki dla lizy komórek E. coli.
  • Intensywne jeszcze ściśle kontrolowaną kawitację i siły ścinające powodują całkowitego rozerwania i z wysoką wydajnością (na przykład ekstrakcji białka, DNA).

Dlaczego ultradźwiękowe rozbijanie komórek E. coli jest preferowaną metodą?

Homogenizatory ultradźwiękowe lub ultrasonografy z sondą oferują szereg korzyści dla lizy E. coli, ponieważ intensywne ultradźwięki skutecznie niszczą ściany komórkowe i błony. Ultradźwięki typu sondowego są szeroko stosowane do lizy E. coli z następujących powodów:

  • Skuteczne rozbijanie ścian komórkowych: E. coli ma półsztywną ścianę komórkową złożoną z peptydoglikanu, która może być trudna do rozbicia przy użyciu tradycyjnych metod lizy. Sonda ultradźwiękowa generuje intensywne fale ultradźwiękowe, które tworzą pęcherzyki kawitacyjne w cieczy otaczającej komórki. Kiedy pęcherzyki te zapadają się, generują szybkie strumienie cieczy i fale uderzeniowe, które powodują mechaniczne rozerwanie ścian komórkowych, skutecznie uwalniając zawartość komórkową, taką jak biomolekuły.
  • Zwiększona penetracja: Fale ultradźwiękowe generowane przez sondę / sonotrodę mogą wnikać głęboko w próbkę, docierając do większej liczby komórek E. coli i traktując je równomiernie. Pomaga to zapewnić, że liza jest bardziej jednolita w całej próbce, co skutkuje wyższą skutecznością rozbijania komórek.
  • Skrócony czas przetwarzania: Energia dostarczana przez sondę ultradźwiękową jest wysoce skoncentrowana i zlokalizowana, co prowadzi do szybkiej i skutecznej lizy komórek. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak ubijanie kulek lub liza enzymatyczna, sonikacja może osiągnąć lizę E. coli w ciągu kilku minut lub nawet sekund. Podczas gdy wiele alternatywnych technik, takich jak zamrażanie-rozmrażanie, wymaga kilku rund leczenia, liza ultradźwiękowa otwiera komórki w jednym etapie procesu.
  • Kontrola temperatury: Najnowocześniejsze ultradźwięki są wyposażone w czujniki temperatury i inteligentne oprogramowanie, które pozwala ustawić maksymalną temperaturę procesu. Ultradźwiękowiec zatrzymuje się automatycznie po osiągnięciu limitu temperatury i rozpoczyna proces sonikacji po osiągnięciu ustawionego punktu temperatury. Chłodzenie próbek w kąpieli lodowej jest prostą metodą utrzymywania niskiej temperatury próbki i zapobiegania degradacji próbki wywołanej ciepłem.
  • Skalowalność: Ultradźwięki typu sondowego są dostępne w różnych rozmiarach, od urządzeń ręcznych po wielkoskalowe modele przemysłowe. Dzięki temu nadają się do przetwarzania małych objętości w laboratorium lub skalowania do większych zastosowań bioprocesowych, np. produkcji szczepionek lub biosyntezy cząsteczek.
  • Wszechstronność: Ultradźwięki mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań poza lizą komórek, takich jak ścinanie DNA, ekstrakcja białek, homogenizacja tkanek, dyspersja nanocząstek i emulgowanie. Dlatego też inwestycja w ultradźwięki typu sondowego zapewnia wszechstronność w warunkach badawczych lub przemysłowych.
  • Ultradźwięki typu sondowego, takie jak UP200St, są niezawodnymi homogenizatorami tkanek i kruszarkami komórkowymi, dlatego są szeroko stosowane do przygotowywania próbek w genetyce, np. do lizy bakterii E. coli.

    Ekstrakcja białek z komórek E. coli jest wydajnie przeprowadzana za pomocą sonda ultradźwiękowa UP200St

    Ultradźwięki typu sondowego oferują wiele zalet dla lizy E. coli. Niezawodna i precyzyjna kontrola nad parametrami procesu ultradźwiękowego pozwala zoptymalizować parametry pracy, takie jak moc, czas trwania i obsługa próbki, aby osiągnąć pożądane wyniki.
     

    Zapytanie o informacje




    Zwróć uwagę na nasze Polityka prywatności.


     

    Ten samouczek wyjaśnia, jaki typ sonikatora jest najlepszy do zadań związanych z przygotowywaniem próbek, takich jak liza, rozbijanie komórek, izolacja białek, fragmentacja DNA i RNA w laboratoriach, analiza i badania. Wybierz idealny typ sonikatora do swojego zastosowania, objętości próbki, liczby próbek i przepustowości. Hielscher Ultrasonics ma idealny homogenizator ultradźwiękowy dla Ciebie!

    Jak znaleźć idealny sonikator do rozbijania komórek i ekstrakcji białek w nauce i analizie?

    Miniatura wideo

    Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest często stosowana jako etap przygotowania próbki w sekwencjonowaniu następnej generacji (NGS).

    Analizy elektroforetyczne genomowego DNA E. coli EDL933 poddanego ultradźwiękom 0-15 min. L oznacza DNA Ladder.
    (badanie i zdjęcie: ©Basselet et al. 2008)

    Rozbijanie komórek za pomocą kawitacji ultradźwiękowej

    Homogenizatory ultradźwiękowe działają z częstotliwością około 20 000 cykli na sekundę (przy 20 kHz) i powodują kawitację w cieczach lub zawiesinach. Kawitacja akustyczna tworzy mikroskopijne obszary o ciśnieniu podobnym do próżni i wysokich temperaturach, które rozrywają komórki. Chociaż temperatury mogą osiągać kilka tysięcy stopni Celsjusza, objętości kawitacji są tak małe, że nie podgrzewają znacząco procesu. Generowana przez ultradźwięki kawitacja akustyczna i siły ścinające perforują lub rozrywają błonę komórkową komórek bakteryjnych, takich jak E. coli. Ultradźwięki Hielscher pozwalają na precyzyjną kontrolę parametrów procesu, takich jak intensywność ultradźwięków, amplituda, energia wejściowa i temperatura. W ten sposób proces lizy ultradźwiękowej można optymalnie dostosować do typu komórki, hodowli komórkowej i celu procesu.
     

    Zalety ultradźwiękowych lizę

    • Precyzyjna kontrola lizy (intensywność, amplitudę, temperatura)
    • wiarygodne, powtarzalne wyniki
    • optymalne przystosowanie do konkretnych próbek
    • kontrola temperatury
    • w przypadku bardzo małych i bardzo dużych próbek (il do litrów)
    • Czysto mechaniczna obróbka
    • Przyjazna dla użytkownika, bezpieczna obsługa
    • skala liniowa-up z laboratorium do produkcji
    Ten ultradźwiękowy zespół VialTweeter pozwala na jednoczesne przygotowanie próbki do 10 fiolek, w takich samych warunkach technologicznych. (Kliknij, aby powiększyć!)

    VialTweeter ultradźwiękowy lizy

    Zapytanie o informacje




    Zwróć uwagę na nasze Polityka prywatności.


    Homogenizator ultradźwiękowy a inne techniki lizy

    Podczas gdy liza chemiczna i enzymatyczna może być problematyczna – od liza chemiczna może zmieniać struktur białkowych i powodować problemy oczyszczania i liza enzymatyczna wymaga długiego czasu inkubacji i nie jest powtarzalna – ultradźwiękowy zakłócenie jest wyrafinowany, szybka metoda komórka zakłócenie.
    Liza ultradźwiękowa opiera się wyłącznie na siłach mechanicznych. Nie dodaje się żadnych chemikaliów, sonikacja rozbija ścianę komórkową siłami ścinającymi. Liza chemiczna może zmienić strukturę białka i wprowadzić problemy z oczyszczaniem. Rozpad enzymatyczny wymaga długiego czasu inkubacji i nie jest powtarzalny. Ultradźwiękowe rozbijanie komórek bakterii E. coli jest szybkie, proste, niezawodne i powtarzalne. Dlatego ultrasonografy firmy Hielscher są stosowane w laboratoriach biologicznych i biochemicznych na całym świecie do przygotowywania próbek, preanalityki, diagnostyki in vitro i różnorodnych testów.

    Ogólne zalecenia dotyczące lizy ultradźwiękowej

    Sonikacja jest najpopularniejszą techniką lizy bardzo małych, średnich i dużych ilości zawiesin komórkowych – od Pico-litra do 100 l / h (przy użyciu ultradźwięków komórkę przepływu). Komórki poddano lizie za pomocą ciekłego ścinania i kawitacji. DNA jest także ścięty w ultradźwiękami, tak że nie jest konieczne dodawanie DNazy do zawiesiny komórek.
     

    Kontrola temperatury podczas ultradźwiękowej lizy E. coli
    Ultradźwiękowy rozbijacz komórek UP100H (100W) do rozbijania komórek i ekstrakcji związków roślinnych.Przez wstępne chłodzenie próbki i utrzymuje się próbkę w sonikację na lodzie, próbki degradacja termiczna próbki, można łatwo zapobiec.
    Idealnie, próbki powinny być przechowywane w stanie lodowatym podczas lizy, ale dla większości próbek wystarczy, jeśli temperatura nie wzrośnie powyżej temperatury hodowli lub źródła tkanki. Dlatego zaleca się utrzymywanie zawiesiny na lodzie i sonikowanie kilkoma krótkimi impulsami ultradźwiękowymi trwającymi 5-10 sekund i przerwami trwającymi 10-30 sekund. Podczas przerw, ciepło może rozproszyć się w celu przywrócenia niskiej temperatury. W przypadku większych próbek komórek dostępne są różne reaktory przepływowe z płaszczem chłodzącym.
    Przeczytaj tutaj szczegółowe wskazówki i zalecenia dotyczące udanej lizy ultradźwiękowej!

    Protokoły ultradźwiękowego przygotowania lizatów E. Coli

    Naukowcy używają homogenizatorów ultradźwiękowych Hielscher do rozbijania komórek E. coli. Poniżej można znaleźć różne przetestowane i sprawdzone protokoły lizy E. coli przy użyciu homogenizatorów ultradźwiękowych Hielscher do różnych zastosowań związanych z E. coli.
     

    Ten klip wideo przedstawia homogenizator ultradźwiękowy UP100H firmy Hielscher, ultradźwiękowiec szeroko stosowany do przygotowania próbek w laboratoriach.

    Homogenizator ultradźwiękowy UP100H

    Miniatura wideo

    Wzrost komórek, sieciowanie i przygotowanie ekstraktów komórkowych E. coli za pomocą ultradźwięków

    Dla Seqa i polimerazy RNA chip-Chip E. coli MG1655 lub MG1655 ΔseqA hodowano w temperaturze 37 ° C do OD600 około 0,15 w 50 ml LB (+ 0,2% glukozy) przed dodaniem 27 μl formaldehydu (37%) na ml ośrodka (końcowe stężenie 1%). Sieciowanie przeprowadzono przy powolnym wytrząsaniu (100 obrotów na minutę) w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie zahartowano 10 ml 2,5 M glicyny (stężenie końcowe 0,5 M). W doświadczeniach z szokiem cieplnym, E. coli MG1655 hodowano w 65 ml pożywki LB w 30 ° C do OD600 około 0,3. Następnie 30 ml hodowli przeniesiono do wstępnie ogrzanej kolby w temperaturze 43°C, a pozostałą część utrzymywano w temperaturze 30°C. Sieciowanie i wygaszanie przebiegało tak, jak opisano powyżej, z wyjątkiem tego, że komórki trzymano w temperaturze 30 lub 43°C przez 5 minut przed dalszym powolnym wytrząsaniem w temperaturze pokojowej. Komórki zebrano przez odwirowanie i przemyto dwukrotnie zimnym TBS (pH 7,5). Po ponownym zawieszeniu w 1 ml buforu lizującego (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharozy, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozymu) i inkubacji w temperaturze 37°C przez 30 minut, a następnie dodaniu 4 ml buforu IP, komórki poddano sonikacji na lodzie z 12-krotnymi 30-sekundowymi i 30-sekundowymi przerwami przy użyciu procesora ultradźwiękowego Hielscher UP400St przy ustawieniu 100% mocy. Po wirowaniu przez 10 minut przy 9000 g, 800 μl podwielokrotności supernatantu przechowywano w temperaturze -20°C. (Waldminghaus 2010)
     

    Nadprodukcja i oczyszczanie enzymów za pomocą sondy ultradźwiękowej

    Ultrasonograf UP100H to homogenizator laboratoryjny często używany do przygotowywania próbek z płytek do hodowli komórkowych.W celu nadprodukcji białek znakowanych dekastydyną (His10), E. coli BL21(DE3) transformowano konstruktami pET19b. Prekultura została zebrana przez odwirowanie, a 1% wykorzystano do zaszczepienia kultury ekspresyjnej. Komórki niosące pET19mgtB hodowano w temperaturze 22°C do osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) wynoszącej 0,7. Hodowlę przeniesiono do 17°C i indukowano 100 μM IPTG. Po 16 godzinach hodowlę zebrano przez odwirowanie z prędkością 7500 × g w temperaturze 4°C. Komórki zawieszono ponownie w 50 mM roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 0,3 M NaCl o pH 7,4 i rozerwano przez ultradźwięki za pomocą sonotrody z mikrokońcówką S2 w ultrasonografie Hielscher UP200St przy cyklu 0,5 i amplitudzie 75%.
    Nadprodukcja decahistidine znakowanych GTFC indukowano w 37 ° C przy OD600 0,6 z 100 uM IPTG. Komórki następnie inkubowano przez 4 godziny, zebrano i poddano lizie jak podano powyżej dla MgtB.
    Surowe ekstrakty komórkowe odwirowano przy 15 000 × g i 4°C w celu sedymentacji resztek komórkowych. Oczyszczone ekstrakty załadowano na kolumny HisTrap FF Crude o pojemności 1 ml przy użyciu systemu ÄKTAprime Plus. Enzymy oczyszczono zgodnie z protokołem producenta dla elucji gradientowej białek znakowanych His. Wyeluowane roztwory białek dwukrotnie dializowano wobec 1000 objętości 50 mM PBS, pH 7,4, z 0,3 M NaCl w temperaturze 4°C. Oczyszczanie analizowano za pomocą 12% SDS-PAGE. Stężenie białka określono metodą Bradford przy użyciu Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
     

    Ultradźwiękowa ekstrakcja białka z bakterii E. coli
    Białko przynęta będąca przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku, MTV1 Arabidopsis thaliana) jest połączone ze znacznikiem GST i wyrażone w BL21 Escherichia coli (E. coli), komórek.

    1. Pobrać jeden osad GST-MTV1 i GST (odpowiadający 50 ml hodowli bakteryjnej) i zawiesić każdy z nich w 2,5 ml lodowato zimnego buforu ekstrakcyjnego.
    2. Użyć ultrasonografu UP100H (wyposażonego w mikrotip-sonotrodę MS3 dla małych objętości ok. 2-5 ml) w celu rozbicia komórek bakteryjnych aż do ich lizy, na co wskazuje zmniejszone zmętnienie i zwiększona lepkość. Należy to przeprowadzić na lodzie i zaleca się sonikację w odstępach czasu (np. 10 sekund sonikacji, a następnie 10 sekund przerwy na lodzie i tak dalej). Należy uważać, aby nie sonifikować ze zbyt dużą intensywnością. Jeśli wykryte zostanie pienienie lub tworzenie się białego osadu, należy zmniejszyć intensywność.
    3. Przenieść zlizowany roztwór bakterii do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml i odwirowywać w temperaturze 4°C, 16 000 x g przez 20 minut.

     

    Sondy ultradźwiękowe wykorzystują siły kawitacji akustycznej do rozbijania komórek i ekstrakcji cząsteczek i DNA z bakterii E. coli.

    Ultradźwięki z sondą, takie jak UP400St wykorzystują zasadę działania kawitacji akustycznej do skutecznej lizy bakterii E.coli.

    Analiza ekspresji i oczyszczanie rekombinowanego białka za pomocą sonikacji

    Osad E. coli poddano działaniu ultradźwięków za pomocą ultrasonografu Hielscher UP100H. W tym celu osad komórkowy zawieszono ponownie w schłodzonym buforze lizującym (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i schłodzono na lodzie przez 10 minut. Następnie zawiesinę komórek poddano sonikacji z 10 krótkimi seriami po 10 s, po których nastąpiła przerwa 30 s na chłodzenie. Na koniec, resztki komórek usunięto przez ultrawirowanie w temperaturze 4°C przez 15 minut z prędkością 14000 obrotów na minutę. W celu potwierdzenia ekspresji rPR, supernatant naniesiono na 12% żel poliakrylamidowy i przeanalizowano metodą SDS-PAGE i Western blotting. Oczyszczanie rPR przeprowadzono przy użyciu żywicy Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) zgodnie z instrukcją producenta. Na tym etapie zastosowano natywną metodę oczyszczania. Czystość oczyszczonego białka oceniano za pomocą elektroforezy na 12% żelu poliakrylamidowym, a następnie barwienia błękitem Coomassie. Stężenie oczyszczonego białka mierzono za pomocą zestawu do oznaczania białka Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Ten film pokazuje ultradźwiękowy cuphorn o mocy 200 W do dyspergowania, homogenizacji, ekstrakcji lub odgazowania próbek laboratoryjnych.

    Ultrasonic Cuphorn (200 Wat)

    Miniatura wideo

    Homogenizatory ultradźwiękowe do lizy bakterii E. coli

    Hielscher Ultrasonics projektuje, produkuje i dostarcza wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe do niezawodnej i skutecznej lizy bakterii E. coli i innych typów komórek, tkanek i kultur komórkowych.
    Szeroka gama sond ultradźwiękowych, jak również systemów sonikacji pośredniej, pozwala nam zaoferować idealny ultradźwiękowy homogenizator tkanek do zastosowań związanych z rozbijaniem i ekstrakcją komórek.

    Projektowanie, produkcja i doradztwo – Jakość Made in Germany

    Ultradźwiękowe urządzenia firmy Hielscher mogą być zdalnie sterowane za pomocą przeglądarki internetowej. Parametry sonikacji mogą być monitorowane i precyzyjnie dopasowywane do wymagań procesu.Ultradźwięki Hielscher są dobrze znane z najwyższej jakości i standardów projektowych. Inteligentne oprogramowanie, intuicyjne menu, programowalne ustawienia i automatyczne protokołowanie danych to tylko kilka cech ultrasonografów Hielscher. Solidność i łatwa obsługa pozwalają na płynną integrację naszych ultradźwiękowców z obiektami badawczymi i biotechnologicznymi. Nawet trudne warunki i wymagające środowiska są łatwo obsługiwane przez ultradźwięki Hielscher.

    Hielscher Ultrasonics jest firmą posiadającą certyfikat ISO i kładzie szczególny nacisk na ultradźwięki o wysokiej wydajności, charakteryzujące się najnowocześniejszą technologią i łatwością obsługi. Oczywiście ultradźwięki Hielscher są zgodne z CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.

    Poniższa tabela daje wskazanie przybliżonej mocy przerobowych naszych ultrasonicators:

    Wielkość partiinatężenie przepływuPolecane urządzenia
    płytki wielokrotnego użytku / mikrotiteryb.d.UIP400MTP
    CupHorn do fiolek lub zlewekb.d.ultradźwiękowy cuphorn
    ultradźwiękowy reaktor mikroprzepływowyb.d.GDmini2
    do 10 fiolek o pojemności od 0,5 do 1,5 mlb.d.VialTweeter
    0.5-1,5 mLb.d.VialTweeter
    1 do 500mL10-200mL/minUP100H
    10 do 2000mL20-400mL/minUP200Ht, UP400St
    0.1 do 20L0.2 do 4L/minUIP2000hdT
    10-100L2 do 10L/minUIP4000
    b.d.10-100L/minUIP16000
    b.d.większeklaster UIP16000

    Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!

    Poproś o więcej informacji

    Skorzystaj z poniższego formularza, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat ultradźwiękowych homogenizatorów tkanek i kruszarek komórek, zastosowań do lizy i cen. Z przyjemnością omówimy z Tobą Twój proces i zaoferujemy Ci homogenizator ultradźwiękowy spełniający Twoje wymagania!









    Proszę zwrócić uwagę na nasze Polityka prywatności.


    Film przedstawia ultradźwiękowy system przygotowania próbek UIP400MTP, który pozwala na niezawodne przygotowanie próbek z dowolnych standardowych płytek wielodołkowych przy użyciu ultradźwięków o wysokiej intensywności. Typowe zastosowania UIP400MTP obejmują lizę komórek, ścinanie DNA, RNA i chromatyny, a także ekstrakcję białek.

    Ultrasonikator UIP400MTP do sonikacji płytek wieloigłowych

    Miniatura wideo

    Dodatkowe protokoły ultradźwiękowej lizy E. coli

    Białka modyfikowane allicyną w E. coli przy użyciu ultradźwiękowej fiolkiTweeter

    VialTweeter przy procesorze ultradźwiękowym UP200STOkreślenie sulfhydrylowych zawartość, 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoesowy) (DTNB) Test
    Do zaszczepienia minimalnej pożywki MOPS (1:100) użyto całonocnej hodowli E. coli MG1655. Hodowlę prowadzono w warunkach tlenowych aż do osiągnięcia A600 równego 0,4. Hodowlę podzielono na trzy 15-ml hodowle w celu poddania ich działaniu stresu. Nieleczona hodowla służyła jako kontrola negatywna. Do jednej z dwóch pozostałych hodowli dodano 0,79 mM allicyny (128 μg ml-1) lub 1 mM diamidu. Hodowle inkubowano przez 15 minut. 5 ml każdej hodowli zebrano przez odwirowanie (8 525 × g, 4°C, 10 min). Komórki przemyto dwukrotnie 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, przechowywane beztlenowo przed użyciem) i odwirowano (13 000 × g, 4°C, 10 min). Komórki ponownie zawieszono w buforze lizującym (PBS z 6 mM guanidyniowym HCl, pH 7,4) przed rozerwaniem w temperaturze 4°C za pomocą ultradźwięków (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Niemcy) (3 × 1 min). Szczątki komórkowe osuszono przez odwirowanie (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant przeniesiono do kuwety QS-macro o pojemności 3,5 ml (10 mm) z mieszadłem magnetycznym i zmieszano z 1 ml buforu lizującego. Wygaszanie próbek monitorowano przy 412 nm za pomocą spektrofotometru Jasco V-650 wyposażonego w uchwyt kuwety PSC-718 z regulacją temperatury w temperaturze pokojowej. Dodano 100 μl 3 mM roztworu kwasu ditiobis(2-nitrobenzoesowego). Ekstynkcja była monitorowana aż do osiągnięcia nasycenia. Obliczenie stężenia tiolu przeprowadzono przy użyciu współczynnika ekstynkcji ϵ412 = 13,700 M-1 cm-1 dla tio-2-nitrobenzoesowego (TNB). Stężenie tiolu komórkowe zostały obliczone w oparciu o objętość komórki E. coli 6,7 x 10-15 litr i gęstość komórek A600 = 0,5 (co odpowiada 1 × 108 komórki ml-1 kultura). (Muller i in., 2016)
     

    Oznaczanie glutationu in vivo przy użyciu ultradźwiękowej kruszarki komórkowej

    E.coli MG1655 hodowano w minimalnej pożywce MOPS w całkowitej objętości 200 ml, aż do osiągnięcia A600 równego 0,5. Hodowlę podzielono na 50 ml w celu poddania działaniu stresu. Po 15 minutach inkubacji z 0,79 mM allicyną, 1 mM diamidem lub dimetylosulfotlenkiem (kontrola), komórki zbierano przy 4000g w 4°C przez 10 minut. Komórki przemyto dwukrotnie buforem KPE przed ponownym zawieszeniem osadu w 700 µl buforu KPE. W celu deprotekcji dodano 300 l 10% (w/v) kwasu sulfosalicylowego przed rozbiciem komórek za pomocą ultradźwięków (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanty były zbierane po odwirowaniu (30 min, 13,000g, 4 ° C). Stężenia kwasu sulfosalicylowego zostały zmniejszone do 1% przez dodanie 3 objętości buforu KPE. Pomiary całkowitej glutationowej GSSG przeprowadzono jak opisano powyżej. Komórkowe stężenie glutationu zostały obliczone w oparciu o objętość komórki E. coli 6,7×10-15 litr i gęstość komórek A600 0,5 (co odpowiada 1×108 komórki ml-1 kultura). stężenia GSH obliczono przez odjęcie 2 [GSSG] z całkowitej glutationu. (Muller i in., 2016)

    Ekspresja ludzkiego mAspAT w E. coli przy użyciu homogenizatora ultradźwiękowego

    Ultradźwiękowy Disruptor komórek UP400St (400W) do ekstrakcji wewnątrzkomórkowego materii (na przykład białka, organelli, DNA, RNA i podobne)Pojedyncza kolonię E. coli BL21 (DE3) niosące wektor ekspresyjny w 30 ml Luria-Bertani (LB), zawierającej 100 ug średniej / ml ampicyliny, a następnie hodowano w temperaturze 37 ° C do uzyskania gęstości optycznej (OD600) Wyniosła 0,6. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 4000 x g przez 10 minut i ponownie zawieszono w 3 l świeżej pożywce LB zawierającej 100 | ig / ml ampicyliny.
    Następnie ekspresję białka indukowano 1 mM β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozydem izopropylu (IPTG) przez 20 godzin w temperaturze 16ºC. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 8000 × g przez 15 minut i przemyto buforem A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Około 45 g (mokra masa) komórek uzyskano z 3 l hodowli. Po odwirowaniu, osad komórkowy zawieszono ponownie w 40 ml (dla 1 l hodowli) lodowatego buforu ekstrakcyjnego A i poddano lizie ultradźwiękowej w temperaturze lodowatej przy użyciu ultradźwiękowej kruszarki komórkowej Hielscher UP400St. Lizę komórek odwirowano przy 12 000 obr/min przez 15 minut w celu oddzielenia frakcji rozpuszczalnej (supernatant) i wytrąconej (osad). (Jiang et al. 2015)
     



    Fakty Warto wiedzieć

    komórek E. coli

    Escherichia coli (E. coli) jest bakterią Gram-ujemną, fakultatywnie beztlenową, w kształcie pałeczki, bakterii coli z rodzaju Escherichia, która jest powszechnie spotykana w niższym jelicie organizmów ciepłokrwistych (endotermy). Istnieje duża liczba szczepów (lub podtypów) E. coli o różnych cechach. Większość szczepów E. coli jest nieszkodliwa dla ludzi, np. Szczepy B i K-12 stosowane powszechnie w zastosowaniach badawczych w laboratoriach. Jednak niektóre szczepy są szkodliwe i mogą powodować poważne choroby.
    E. coli odgrywa ważną rolę we współczesnej inżynierii biologicznej i mikrobiologii przemysłowej, ponieważ bakterie łatwo jest manipulować. Do typowych zastosowań laboratoryjnych, które wiążą się często z używania E. coli, na przykład w celu utworzenia rekombinowanego kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) lub działać jako modelowy organizm.
    E. coli jest bardzo uniwersalny gospodarza do wytwarzania białek heterologicznych i różnorodne układy do ekspresji białek są dostępne do wytwarzania rekombinowanych białek w E. coli. Używanie plazmidów, które umożliwiają ekspresję białka wysokim poziomie geny można wprowadzić do bakterii, które pozwala na wytwarzania takich białek w dużych ilościach w procesie fermentacji w przemyśle.
    E. coli są wykorzystywane jako fabryki komórek do produkcji insuliny. Dalsze zastosowania obejmują wykorzystanie zmodyfikowanych komórek E. coli do opracowywania i produkcji szczepionek i unieruchomionych enzymów, do produkcji biopaliw, a także do bioremediacji.
    Szczep K-12 jest zmutowana postać E. coli, która nadmiernie wyraża enzym fosfatazy alkalicznej (ALP). Mutacja ta występuje z powodu defektu genu, które stale koduje enzym. Jeśli gen daje produkt bez hamowania jest to znane jako konstytutywnej aktywności. Ta specyficzna forma mutant stosuje się do izolacji i oczyszczenia enzymu ALP.
    Bakterie E. coli są również szeroko stosowane jako fabryki komórek. Zmodyfikowane mikroby (np. bakterie) i komórki roślinne mogą być wykorzystywane jako tzw. fabryki komórek. Te genetycznie zmodyfikowane komórki wytwarzają cząsteczki, substancje chemiczne, polimery, białka i inne substancje, które są wykorzystywane na przykład w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym i chemicznym. W celu uwolnienia cząsteczek wytwarzanych we wnętrzu takich bioinżynierskich komórek powszechnie stosuje się lizę ultradźwiękową, która rozbija ściany komórkowe i przenosi substancje docelowe do otaczającej je cieczy. Dowiedz się więcej na temat lizy komórek bioinżynieryjnych!

    Ultradźwiękowy DNA Ścinanie

    Ultradźwiękowe siły ścinające są powszechnie stosowaną metodą uwalniania cząsteczek, organelli i białek z wnętrza komórki, a także rozbijania nici DNA na kawałki. Kawitacja akustyczna rozbija ściany komórkowe i błony, aby wyodrębnić DNA z komórek i wygenerować fragmenty o długości około 600 nm. – 800 bp w długości, która jest idealna do analizy.
    Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej o homogenizatory ultradźwiękowe do fragmentacji DNA!

    Literatura / materiały źródłowe


    Ultradźwięki o wysokiej wydajności! Oferta firmy Hielscher obejmuje pełne spektrum produktów - od kompaktowych ultradźwięków laboratoryjnych, poprzez urządzenia stołowe, aż po w pełni przemysłowe systemy ultradźwiękowe.

    Firma Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe od laboratorium do wielkość przemysłowa.


    Chętnie porozmawiamy o Państwa procesie.

    Skontaktujmy się.