Technologia ultradźwiękowa firmy Hielscher

Ultradźwiękowy lizy E. coli

  • E. coli, bakterii najbardziej powszechnie stosowanych bakterii w mikrobiologii i biotechnologii.
  • zaburzające ultradźwiękowe komórkowe zapewniają wiarygodne i powtarzalne wyniki dla lizy komórek E. coli.
  • Intensywne jeszcze ściśle kontrolowaną kawitację i siły ścinające powodują całkowitego rozerwania i z wysoką wydajnością (na przykład ekstrakcji białka, DNA).

Rozrywanie komórki kawitacją

Bakterie Escherichia coli niezawodnie lizie stosując ultradźwięki homogenizatory tkankowe.Ultradźwiękowe sondy typu homogenizatory działać z ok. 20.000 cykli na sekundę (przy 20 kHz) oraz spowodować kawitację w cieczy lub supsensions. kawitacji akustycznej mikroskopijnych obszarów podciśnienia jak i wysokich temperaturach, do rozrywania komórek siebie. Chociaż temperatura może sięgnąć kilku tysięcy stopni Celsjusza, tomy kawitacji są tak małe, że nie znacznie podgrzać proces. Ultradźwięki generowane kawitacji akustycznej, a siły ścinające przekłuć lub rozbić błonę komórkową E. coli – w zależności od ustawienia urządzenia ultradźwiękowego homogenizator.

Zalety ultradźwiękowych lizę

  • Precyzyjna kontrola lizy (intensywność, amplitudę, temperatura)
  • optymalne przystosowanie do konkretnych próbek
  • kontrola temperatury
  • w przypadku bardzo małych i bardzo dużych próbek (il do litrów)
  • Uzdatnianie mechaniczny
  • skala liniowa-up z laboratorium do produkcji
Ten ultradźwiękowy zespół VialTweeter pozwala na jednoczesne przygotowanie próbki do 10 fiolek, w takich samych warunkach technologicznych. (Kliknij, aby powiększyć!)

VialTweeter ultradźwiękowy lizy

Zapytanie o informacje




Zwróć uwagę na nasze Polityka prywatności.


Podczas gdy chemiczna i enzymtic lizy może być problematyczne – od liza chemiczna może zmieniać struktur białkowych i powodować problemy oczyszczania i liza enzymatyczna wymaga długiego czasu inkubacji i nie jest powtarzalna – ultradźwiękowy zakłócenie jest wyrafinowany, szybka metoda komórka zakłócenie.
Rozpad ultradźwiękowy opiera się wyłącznie na siłach mechanicznych. Nie dodaje się żadnych substancji chemicznych, sonizacja rozbija ścianę komórkową przez siły ścinające. Rozkład chemiczny może zmienić strukturę białek i spowodować problemy z oczyszczaniem. zaburzenia enzymatyczne wymagają długiego czasu inkubacji i nie są powtarzalne.

Zalecenia ogólne

UP400St ultrasonicator z reaktora przepływowegoSonikacja jest najpopularniejszą techniką lizy bardzo małych, średnich i dużych ilości zawiesin komórkowych – od Pico-litra do 100 l / h (przy użyciu ultradźwięków komórkę przepływu). Komórki poddano lizie za pomocą ciekłego ścinania i kawitacji. DNA jest także ścięty w ultradźwiękami, tak że nie jest konieczne dodawanie DNazy do zawiesiny komórek.
Kontrola temperatury:
Przez wstępne chłodzenie próbki i utrzymuje się próbkę w sonikację na lodzie, próbki degradacja termiczna próbki, można łatwo zapobiec.
Idealnie byłoby, gdyby próbki były przechowywane w stanie schłodzonym podczas lizy, ale w przypadku większości próbek wystarczy, gdyby temperatura nie wzrosła powyżej temperatury hodowli lub źródła tkanek. Dlatego zaleca się, aby zawiesinę trzymać na lodzie i sonikować kilkoma krótkimi impulsami ultradźwiękowymi 5-10 sek. i przerwami 10-30 sek. Podczas przerw ciepło może się rozpraszać, aby przywrócić niską temperaturę. W przypadku większych próbek komórek dostępne są różne reaktory przepływowe z płaszczem chłodzącym.

Protokoły stosowane do otrzymywania z E. coli Lizaty

Analiza ekspresji i oczyszczania rekombinowanego białka

E. coli osad poddaje się działaniu ultradźwięków w ultradźwiękowym systemem UP100H (Hielscher). W tym celu, osad komórek ponownie zawiesza się w schłodzonym buforem do lizy (50 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i ochłodzono na lodzie w ciągu 10 minut. Następnie zawiesinę komórek poddaje się działaniu ultradźwięków w 10 krótkich impulsów 10 s, a następnie w odstępach 30 sekund w celu chłodzenia. Wreszcie, resztki komórkowe usunięto przez ultrawirowanie w 4 ° C przez 15 minut przy 14000 obrotów na minutę. W celu potwierdzenia ekspresji RPR supernatant przeprowadzono na 12% żelu poliakryloamidowym i analizuje przez SDS-PAGE i Western blot. Oczyszczanie wykonano za pomocą RPR Ni2+-NTA żywica (lnvitrogen, USA) zgodnie z podręcznikiem producenta. W tym etapie, sposób oczyszczania natywnej użyto. Czystość oczyszczonego białka oceniano za pomocą elektroforezy w 12% żelu poliakryloamidowym, a następnie barwienia barwnikiem Coomassie blue. Oczyszczony Stężenie białka mierzono metodą Micro BCA zestawu do oznaczania białka (Pierce, USA). (Azarnezhad i wsp. 2016)

Ultradźwiękowy Disruptor komórek UP100H (100W) do lizy, rozrywania komórek i ścinania DNA.

homogenizator ultradźwiękowy UP100H (100W)

Wzrost komórek prowadzi się sieciowanie i przygotowanie ekstraktów E. coli, komórki

Dla Seqa i polimerazy RNA chip-Chip E. coli MG1655 lub MG1655 ΔseqA hodowano w temperaturze 37 ° C do OD600 około 0,15 w 50 ml LB (+ 0,2% glukozy) przed dodaniem 27 μl formaldehydu (37%) na ml ośrodka (końcowe stężenie 1%). Sieciowanie przeprowadzono przy powolnym wytrząsaniu (100 obrotów na minutę) w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie zahartowano 10 ml 2,5 M glicyny (stężenie końcowe 0,5 M). W doświadczeniach z szokiem cieplnym, E. coli MG1655 hodowano w 65 ml pożywki LB w 30 ° C do OD600 około 0,3. Następnie 30 ml hodowli przenoszono do kolby wstępnie ogrzewano w temperaturze 43 ° C i pozostałość utrzymywano w temperaturze 30 ° C. Sieciowanie i hartowania jak opisana powyżej z wyjątkiem tego, że komórki były trzymane w temperaturze 30 lub 43 ° C przez 5 minut, po czym dalej wolnym wytrząsaniem w temperaturze pokojowej. Komórki zebrano przez odwirowanie, przemyto dwa razy zimnym (TBS, pH 7,5). Po ponownym zawieszeniem w 1 ml buforu do lizy (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharozy, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozymu) i inkubowano w temperaturze 37 ° C przez 30 minut, po czym dodano 4 ml OD bufor, komórki poddano działaniu ultradźwięków na lodzie z 12 razy po 30 s oraz 30 s przerwami w UP400St ultradźwiękowy procesor (Hielscher Ultradźwięki GmbH) w 100% mocy. Po odwirowaniu przez 10 min przy 9000 g, 800 | il aliquotes nadsączu przechowywano w temperaturze -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Nadprodukcja i oczyszczanie enzymów.

Dla nadprodukcji decahistidine (His10) -tagged białek E. coli BL21 (DE3) transformowano pET19b konstrukcji. Całonocnym wstępną hodowlę zbierano poprzez wirowanie, a 1% stosowano do zaszczepiania ekspresji kultur. Komórki niosące pET19mgtB hodowano w temperaturze 22 ° C, aż do osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) 0,7. Hodowlę przenoszono do 17 ° C i indukowano 100 uM IPTG. Po 16 godzinach zbierano hodowlę przez odwirowanie przy 7500 x g w temperaturze 4 ° C. Komórki zawieszano w 50 mM roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS), 0,3 M NaCl, pH 7,4 i rozrywano ultradźwiękami z końcówką mikro sonotrody S2 w UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Niemcy) w cyklu 0,5 amplitudą 75%.
Nadprodukcja decahistidine znakowanych GTFC indukowano w 37 ° C przy OD600 0,6 z 100 uM IPTG. Komórki następnie inkubowano przez 4 godziny, zebrano i poddano lizie jak podano powyżej dla MgtB.
Surowe ekstrakty komórkowe wirowano przy 15000 x g i 4 ° C w celu osadzenia resztek komórek. Sklarowany ekstraktów naniesiono na 1 ml kolumny HisTrap FF surowych za pomocą systemu ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Enzymy oczyszczono zgodnie z protokołem producenta dla gradientu elucji znakowane His białek. Eluowane Roztwory białek dializowano dwukrotnie wobec 1000 objętości 50 mM PBS, pH 7,4, 0,3 M NaCl w 4 ° C. Oczyszczanie analizowano przez 12% SDS-PAGE. Stężenie białka oznaczano metodą Bradford, stosując Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy). (Rabausch i wsp. 2013),

Ekstrakcji białka z bakterii E. coli
Białko przynęta będąca przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku, MTV1 Arabidopsis thaliana) jest połączone ze znacznikiem GST i wyrażone w BL21 Escherichia coli (E. coli), komórek.
1. przyjmować jedną pastylkę MTV1 GST i GST (co odpowiada 50 ml kultury bakteryjnej) i zawieś każda w 2,5 ml lodowato zimnego buforu do ekstrakcji.
2. Użyj ultrasonicator UP100H (Wyposażona w MS3 mikrokońcówek Sonotroda małych objętościach (2-5mL)) w celu rozerwania komórek bakteryjnych, aż do ich lizie, na co wskazuje zmniejszenie zmętnienia i zwiększenie lepkości. To musi być przeprowadzone na lodzie, a zaleca się sonikacji w odstępach czasu (na przykład 10 sekund, a następnie sonikację przez 10 sekund na lodzie, i tak dalej). Należy zwrócić uwagę, aby nie sonicate ze zbyt wysokim natężeniu. Jeśli pienienie lub wykrywa się tworzenie białego osadu natężenie musi zostać obniżone.
3. Przenieść lizie bakterii roztworu do 1,5 ml rurek mikrowirówki i wiruje się przy 4 ° C, 16000 x g przez 20 minut.

Allicyny zmodyfikowane białka w E. coli

VialTweeter to komfortowy ultrasonicator dla małej próbki homogenizacjiOkreślenie sulfhydrylowych zawartość, 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoesowy) (DTNB) Test
E. coli MG1655 na noc hodowli wykorzystano do inokulacji MOPS pożywce minimalnej (1: 100). Hodowlę prowadzono w warunkach aerobowych, aż osiągnięto A600 wynosi 0,4. Hodowlę dzieli się na trzy 15 ml hodowli do leczenia stresu. Nieleczone kultura służyła jako kontrola negatywna. 0,79 mM allicyny (128 | jg ml-1) Lub 1 mM diamid dodaje się do jednego z dwóch pozostałych kultur każdy. Hodowle inkubowano przez 15 min. 5 ml każdej hodowli zebrano przez odwirowanie (8525 x g, 4 ° C, 10 min). Komórki przemyto dwukrotnie w 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO42 mM KH2PO4PH 7,4, w warunkach beztlenowych przechowywane przed użyciem) i odwirowuje (13000 x g, 4 ° C, 10 min). Komórki ponownie zawiesza się w buforze do lizy (PBS z 6 mM guanidyny HCl, pH 7,4) przed zakłóceniami w temperaturze 4 ° C przez ultradźwięki (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Niemcy) (3 x 1 min). pozostałości komórek osadzano przez wirowanie (13000 x g, 4 ° C, 15 min). Supernatant przeniesiono do 3,5 ml QS-makro kuwety (10 mm) w mieszadło magnetyczne i miesza się z 1 ml buforu do lizy. Wymieranie próbek monitorowano przy 412 nm za pomocą spektrofotometru Jasco V-650 wyposażonego w kontrolowanej temperaturze uchwytu komórek PSC-718 (Jasco) w temperaturze pokojowej. 100 ul 3 mm ditiobis (2-nitrobenzoesowy) roztworu dodano. Zagłada była monitorowana aż do osiągnięcia nasycenia. Obliczanie stężenia tiolowej przeprowadzono stosując współczynnik ekstynkcji ε412 = 13,700 M-1 cm-1 dla tio-2-nitrobenzoesowego (TNB). Stężenie tiolu komórkowe zostały obliczone w oparciu o objętość komórki E. coli 6,7 x 10-15 litr i gęstość komórka600 = 0,5 (co odpowiada 1 x 108 komórki ml-1 kultura). (Muller i in., 2016)

Oznaczenie In vivo Glutation

E. coli MG1655 MOPS hodowano w pożywce minimalnej w łącznej objętości 200 ml dopóki A600 0,5 została osiągnięta. Hodowlę dzieli się na 50 ml hodowli do leczenia stresu. Po 15 min inkubacji z 0,79 mM allicyny, 1 mM diamidu lub sulfotlenek dimetylu (kontrola), komórki zebrano w 4,000g w 4 ° C przez 10 minut. Komórki przemywano dwukrotnie buforem KPE przed ponownym zawieszeniem w 700 ul granulek buforu KPE. Dla deproteination, 300l z 10% (w / v) kwas sulfosalicylowy dodano przed zakłóceniami komórek za pomocą ultradźwięków (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanty były zbierane po odwirowaniu (30 min, 13,000g, 4 ° C). Stężenia kwasu sulfosalicylowego zostały zmniejszone do 1% przez dodanie 3 objętości buforu KPE. Pomiary całkowitej glutationowej GSSG przeprowadzono jak opisano powyżej. Komórkowe stężenie glutationu zostały obliczone w oparciu o objętość komórki E. coli 6,7×10-15 litr i gęstość komórka600 00,5 (co odpowiada 1×108 komórki ml-1 kultura). stężenia GSH obliczono przez odjęcie 2 [GSSG] z całkowitej glutationu. (Muller i in., 2016)

Ultradźwiękowy disruptor do lizy komórek i ekstrakcji materiału biologicznego (kliknij aby powiększyć!)

Sonda typu ultrasonicator UP400St

Ekspresja ludzkiego mAspAT w E. coli

Ultradźwiękowy Disruptor komórek UP400St (400W) do ekstrakcji wewnątrzkomórkowego materii (na przykład białka, organelli, DNA, RNA i podobne)Pojedyncza kolonię E. coli BL21 (DE3) niosące wektor ekspresyjny w 30 ml Luria-Bertani (LB), zawierającej 100 ug średniej / ml ampicyliny, a następnie hodowano w temperaturze 37 ° C do uzyskania gęstości optycznej (OD600) Wyniosła 0,6. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 4000 x g przez 10 minut i ponownie zawieszono w 3 l świeżej pożywce LB zawierającej 100 | ig / ml ampicyliny.
Następnie ekspresję białka indukowano z 1 mM izopropylo-p-ᴅ 1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) przez 20 godziny w temperaturze 16ºC. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 8000 x g przez 15 minut i przemyto buforem A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). W przybliżeniu 45g (wilgotna masa) komórek otrzymano z 3 L hodowli. Po wirowaniu, osad komórek ponownie zawieszono w 40 ml (na 1 litr hodowli) lodowato zimnego buforu do ekstrakcji A, i lizowano przez ultradźwięki w temperaturze lodowatej stosując UP400St Instrument (Dr. Hielscher GmbH, Niemcy). Liza komórek wirowano przy 12000 obrotów na minutę przez 15 minut w celu oddzielenia rozpuszczalnych (supernatant) i wytrącony osad (granulek) frakcji. (Jiang i wsp. 2015)

Poniższa tabela daje wskazanie przybliżonej mocy przerobowych naszych ultrasonicators:

Wielkość partii natężenie przepływu Polecane urządzenia
0.5-1,5 mL b.d. VialTweeter
1 do 500mL 10-200mL/min UP100H
10 do 2000mL 20-400mL/min UP200Ht, UP400St
0.1 do 20L 0.2 do 4L/min UIP2000hdT
10-100L 2 do 10L/min UIP4000
b.d. 10-100L/min UIP16000
b.d. większe klaster UIP16000

Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!

Skorzystaj z formularza poniżej, jeśli chcesz zażądać dodatkowych informacji na temat ultradźwiękowej homogenizacji. Chętnie zaoferujemy Państwu system ultradźwiękowy, spełniający Państwa wymagań.









Proszę zwrócić uwagę na nasze Polityka prywatności.


Literatura / Referencje



Fakty Warto wiedzieć

komórek E. coli

Escherichia coli (E. coli) jest bakterią Gram-ujemną, fakultatywnie beztlenową, w kształcie pałeczki, bakterii coli z rodzaju Escherichia, która jest powszechnie spotykana w niższym jelicie organizmów ciepłokrwistych (endotermy). Istnieje duża liczba szczepów (lub podtypów) E. coli o różnych cechach. Większość szczepów E. coli jest nieszkodliwa dla ludzi, np. Szczepy B i K-12 stosowane powszechnie w zastosowaniach badawczych w laboratoriach. Jednak niektóre szczepy są szkodliwe i mogą powodować poważne choroby.
E. coli odgrywa ważną rolę we współczesnej inżynierii biologicznej i mikrobiologii przemysłowej, ponieważ bakterie łatwo jest manipulować. Do typowych zastosowań laboratoryjnych, które wiążą się często z używania E. coli, na przykład w celu utworzenia rekombinowanego kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) lub działać jako modelowy organizm.
E. coli jest bardzo uniwersalny gospodarza do wytwarzania białek heterologicznych i różnorodne układy do ekspresji białek są dostępne do wytwarzania rekombinowanych białek w E. coli. Używanie plazmidów, które umożliwiają ekspresję białka wysokim poziomie geny można wprowadzić do bakterii, które pozwala na wytwarzania takich białek w dużych ilościach w procesie fermentacji w przemyśle.
E. coli stosuje się jako fabryki komórek do wytwarzania insuliny. Dalsze zastosowania obejmują zastosowanie zmodyfikowanych komórkach E. coli, w celu opracowania i wytworzenia szczepionek i unieruchomione enzymy, do produkcji biopaliw, a także dla bioremediacją.
Szczep K-12 jest zmutowana postać E. coli, która nadmiernie wyraża enzym fosfatazy alkalicznej (ALP). Mutacja ta występuje z powodu defektu genu, które stale koduje enzym. Jeśli gen daje produkt bez hamowania jest to znane jako konstytutywnej aktywności. Ta specyficzna forma mutant stosuje się do izolacji i oczyszczenia enzymu ALP.

Ultradźwiękowy DNA Ścinanie

Ultradźwiękowe siły ścinania są powszechnie stosowany sposób oddzielić od komórek i złamać nici DNA na fragmenty. kawitacji akustycznej rozbija ściany komórkowe i błony do ekstrakcji DNA z komórek i wytworzenia fragmentów o 600 – 800 bp w długości, która jest idealna do analizy.
Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej o homogenizatory ultradźwiękowe do fragmentacji DNA!