Ultradźwiękowa liza bioinżynieryjnych komórek w produkcji przemysłowej

Bioinżynieryjne gatunki bakterii, takie jak E. coli, a także genetycznie zmodyfikowane typy komórek ssaków i roślin są szeroko stosowane w biotechnologii do ekspresji cząsteczek. W celu uwolnienia tych zsyntetyzowanych biocząsteczek wymagana jest niezawodna technika rozbijania komórek. Wysokowydajna ultrasonizacja jest sprawdzoną metodą skutecznej i niezawodnej lizy komórek – Łatwo skalowalny do dużych przepustowości. Hielscher Ultrasonics oferuje wysokowydajny sprzęt ultradźwiękowy do skutecznej lizy komórek w celu produkcji dużych ilości wysokiej jakości biomolekuł.

Ekstrakcja cząsteczek z fabryk komórkowych

Do produkcji szerokiej gamy biomolekuł można wykorzystać różne zmodyfikowane mikroby i komórki roślinne, w tym Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana i algi. Te fabryki komórek mogą produkować białka, lipidy, biochemikalia, polimery, biopaliwa i oleochemikalia, które są wykorzystywane jako żywność lub surowiec do zastosowań przemysłowych. Komórki wykorzystywane jako fabryki komórek są hodowane w zamkniętych bioreaktorach, gdzie mogą osiągnąć wysoką wydajność, specyficzność i niskie zapotrzebowanie na energię.
Aby wyizolować docelowe cząsteczki z bioinżynieryjnych kultur komórkowych, komórki muszą zostać rozbite, aby uwolnić materiał wewnątrzkomórkowy. Ultradźwiękowe przerywacze komórek są dobrze znane jako wysoce niezawodna i skuteczna technika dezintegracji komórek i uwalniania związków.

Fabryki komórek drobnoustrojów są metabolicznie zaprojektowanymi komórkami wykorzystywanymi do syntezy różnych cennych związków. Ultradźwiękowe rozbijanie komórek jest skuteczną i niezawodną metodą uwalniania cennych związków z wnętrza komórki.
opracowanie i grafika: ©Villaverde, 2010.

Zalety ultradźwiękowych zakłócaczy komórek

Jako nietermiczna, łagodna, ale wysoce wydajna technologia, ultradźwiękowe zakłócacze są stosowane w laboratorium i przemyśle do lizowania komórek i produkcji wysokiej jakości ekstraktów, np. stosowanych do izolacji cząsteczek z fabryk komórek.

Ultradźwięki o dużej mocy do skutecznego niszczenia fabryk komórek drobnoustrojów

Mechanizm i skutki ultradźwiękowych zakłócaczy komórek:
Ultradźwiękowe rozbijanie komórek wykorzystuje moc fal ultradźwiękowych. Homogenizator ultradźwiękowy / rozbijacz komórek jest wyposażony w sondę (inaczej sonotrodę) wykonaną ze stopu tytanu, która oscyluje z wysoką częstotliwością ok. 20 kHz. Oznacza to, że sonda ultradźwiękowa przenosi 20 000 drgań na sekundę do sonikowanej cieczy. Fale ultradźwiękowe sprzężone z cieczą charakteryzują się naprzemiennymi cyklami wysokiego / niskiego ciśnienia. Podczas cyklu niskiego ciśnienia ciecz rozszerza się i powstają drobne pęcherzyki próżniowe. Te bardzo małe pęcherzyki rosną przez kilka naprzemiennych cykli ciśnienia, aż nie będą w stanie wchłonąć dalszej energii. W tym momencie pęcherzyki kawitacyjne implodują gwałtownie i tworzą lokalnie środowisko o niezwykłej gęstości energii. Zjawisko to znane jest jako kawitacja akustyczna i charakteryzuje się lokalnie bardzo wysokimi temperaturami, bardzo wysokimi ciśnieniami i siłami ścinającymi. Te naprężenia ścinające skutecznie rozbijają ściany komórek i zwiększają transfer masy między wnętrzem komórki a otaczającym rozpuszczalnikiem. Jako technika czysto mechaniczna, ultradźwiękowo generowane siły ścinające są szeroko stosowane i zalecane do rozbijania komórek bakteryjnych, a także do izolacji białek. Jako prosta i szybka metoda rozbijania komórek, sonikacja jest idealna do izolacji małych, średnich i dużych objętości. Cyfrowe ultrasonografy firmy Hielscher są wyposażone w przejrzyste menu ustawień umożliwiające precyzyjną kontrolę sonikacji. Wszystkie dane sonikacji są automatycznie zapisywane na wbudowanej karcie SD i są łatwo dostępne. Zaawansowane opcje rozpraszania ciepła, takie jak chłodzenie zewnętrzne, sonikacja w trybie pulsacyjnym itp. podczas procesu dezintegracji ultradźwiękowej zapewniają utrzymanie idealnej temperatury procesu, a tym samym nienaruszalność ekstrahowanych związków wrażliwych na ciepło.

Badania podkreślają zalety ultradźwiękowego rozbijania i ekstrakcji komórek

Prof. Chemat et al. (2017) podsumowuje w swoim badaniu, że "ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami jest zieloną i ekonomicznie opłacalną alternatywą dla konwencjonalnych technik dla żywności i produktów naturalnych. Głównymi korzyściami są skrócenie czasu ekstrakcji i przetwarzania, ilość zużytej energii i rozpuszczalników, operacje jednostkowe i emisja CO₂ ".
Gabig-Ciminska i wsp. (2014) wykorzystali w swoich badaniach homogenizator wysokociśnieniowy i ultradźwiękowy dezintegrator komórkowy do lizy zarodników w celu uwolnienia DNA. Porównując obie metody rozbijania komórek, zespół badawczy stwierdza, że w odniesieniu do lizy komórek dla DNA zarodników, "analiza została przeprowadzona przy użyciu lizatów komórkowych z homogenizacji wysokociśnieniowej. Następnie zdaliśmy sobie sprawę, że ultradźwiękowe rozbijanie komórek ma wyjątkowe zalety w tym celu. Jest dość szybkie i może być przetwarzane dla małych objętości próbek". (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekuły z fabryk komórkowych do produkcji żywności

Fabryki komórek mikrobiologicznych to opłacalna i wydajna metodologia produkcji wykorzystująca organizmy mikrobiologiczne do wytwarzania wysokiej wydajności natywnych i nie natywnych metabolitów poprzez bioinżynierię metaboliczną mikroorganizmów mikrobiologicznych, takich jak bakterie, drożdże, grzyby itp. Enzymy luzem są na przykład wytwarzane przy użyciu mikroorganizmów, takich jak Aspergillus oryzae, grzyby i bakterie. Enzymy te są wykorzystywane do produkcji żywności i napojów, a także w rolnictwie, bioenergii i gospodarstwie domowym.
Niektóre bakterie, takie jak Acetobacter xylinum i Gluconacetobacter xylinus, wytwarzają celulozę podczas procesu fermentacji, w którym nanowłókna są syntetyzowane w procesie oddolnym. Celuloza bakteryjna (znana również jako celuloza mikrobiologiczna) jest chemicznie równoważna celulozie roślinnej, ale ma wysoki stopień krystaliczności i wysoką czystość (wolną od ligniny, hemicelulozy, pektyny i innych składników biogennych), a także unikalną strukturę trójwymiarowej (3D) siatkowanej sieci splecionych nanowłókien celulozowych. (por. Zhong, 2020) W porównaniu z celulozą pochodzenia roślinnego, celuloza bakteryjna jest bardziej zrównoważona, a produkowana celuloza jest czysta i nie wymaga skomplikowanych etapów oczyszczania. Ultradźwięki i ekstrakcja rozpuszczalnikiem przy użyciu NaOH lub SDS (dodecylosiarczan sodu) są bardzo skuteczne w izolacji celulozy bakteryjnej z komórek bakteryjnych.

Biomolekuły z fabryk komórkowych do produkcji farmaceutyków i szczepionek

Jednym z najbardziej znanych produktów farmaceutycznych pochodzących z fabryk komórkowych jest ludzka insulina. Do bioinżynieryjnej produkcji insuliny wykorzystywane są głównie bakterie E. coli i Saccharomyces cerevisiae. Ponieważ bio-syntetyzowane nanocząsteczki oferują wysoką biokompatybilność, biologiczne nanocząsteczki, takie jak ferrytyna, są korzystne dla wielu zastosowań w biomanufakturowaniu. Dodatkowo, produkcja w zmodyfikowanych metabolicznie mikroorganizmach jest często znacznie bardziej wydajna pod względem uzyskiwanych plonów. Na przykład, produkcja kwasu artemizynowego, resweratrolu i likopenu wzrosła dziesięciokrotnie do kilkusetkrotnie i jest już ustalona lub jest w fazie rozwoju do produkcji na skalę przemysłową. (por. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Na przykład, oparte na białkach nanocząsteczki o właściwościach samoorganizujących się, takie jak ferrytyna i cząsteczki wirusopodobne, są szczególnie interesujące dla rozwoju szczepionek, ponieważ naśladują zarówno rozmiar, jak i strukturę patogenów i są podatne na koniugację powierzchniową antygenów w celu promowania interakcji z komórkami odpornościowymi. Takie cząsteczki ulegają ekspresji w tzw. fabrykach komórek (np. zmodyfikowanych szczepach E. coli), które wytwarzają określoną cząsteczkę docelową.

Protokół do lizy ultradźwiękowej i E. coli BL21 do uwalniania ferrytyny

Ferrytyna jest białkiem, którego podstawową funkcją jest magazynowanie żelaza. Ferrytyna wykazuje obiecujące możliwości jako samoorganizujące się nanocząsteczki w szczepionkach, gdzie jest wykorzystywana jako nośnik szczepionki (np. białka kolca SARS-Cov-2). Badania naukowe Sun et. al. (2016) pokazują, że rekombinowana ferrytyna może być uwalniana w postaci rozpuszczalnej z Escherichia coli w niskich stężeniach NaCl (≤50 mmol/L). W celu ekspresji ferrytyny w E. coli BL21 i uwolnienia ferrytyny, z powodzeniem zastosowano następujący protokół. Rekombinowany plazmid pET-28a/ferrytyna został transformowany do szczepu E. coli BL21 (DE3). Komórki ferrytyny E coli BL21 (DE3) hodowano w pożywce LB z 0,5% kanamycyną w temperaturze 37°C i indukowano przy OD600 0,6 za pomocą 0,4% izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Ostateczna hodowla została następnie zebrana przez odwirowanie przy 8000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a osad został zebrany. Następnie osad ponownie zawieszono w pożywce LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstraktu drożdżowego)/buforze lizującym (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) i różnych stężeniach roztworu NaCl (odpowiednio 0, 50, 100, 170 i 300 mmol/L). W celu lizy komórek bakteryjnych, sonikację zastosowano w trybie impulsowym: np. przy użyciu urządzenia Ultrasonicator UP400St przy 100% amplitudzie z cyklem pracy 5 sekund ON, 10 sekund OFF, przez 40 cykli), a następnie odwirowano przy 10 000g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Supernatant i osad analizowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE). Wszystkie żele barwione dodecylosiarczanem sodu skanowano skanerem o wysokiej rozdzielczości. Obrazy żeli analizowano przy użyciu oprogramowania Magic Chemi 1D. W celu uzyskania optymalnej przejrzystości, pasma białkowe zostały wykryte poprzez dostosowanie parametrów. Dane dla pasm zostały wygenerowane z triplikatów technicznych. (por. Sun et al., 2016)

Ultradźwiękowe zakłócacze komórkowe do przemysłowej lizy fabryk komórek

Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja jest niezawodną i wygodną metodą uwalniania metabolitów z fabryk komórkowych, wspomagając w ten sposób skuteczną produkcję cząsteczek docelowych. Ultradźwiękowe rozbijacze komórek są dostępne w rozmiarach od laboratoryjnych do przemysłowych, a procesy mogą być skalowane całkowicie liniowo.
Hielscher Ultrasonics jest kompetentnym partnerem w zakresie wysokowydajnych zakłócaczy ultradźwiękowych i posiada wieloletnie doświadczenie w dziedzinie implantacji systemów ultradźwiękowych w warunkach laboratoryjnych i przemysłowych.
Jeśli chodzi o zaawansowany sprzęt i oprogramowanie, systemy rozbijania komórek Hielscher Ultrasonics spełniają wszystkie wymagania dotyczące optymalnej kontroli procesu, łatwej obsługi i przyjazności dla użytkownika. Klienci i użytkownicy ultrasonografów Hielscher doceniają korzyści, jakie ultradźwiękowe rozbijacze komórek i ekstraktory Hielscher pozwalają na precyzyjne monitorowanie i kontrolę procesu. – za pomocą cyfrowego wyświetlacza dotykowego i zdalnego sterowania przez przeglądarkę. Wszystkie ważne dane sonikacji (np. energia netto, energia całkowita, amplituda, czas trwania, temperatura, ciśnienie) są automatycznie zapisywane jako plik CSV na zintegrowanej karcie SD. Pomaga to uzyskać powtarzalne i powtarzalne wyniki oraz ułatwia standaryzację procesu, a także spełnienie Dobrych Praktyk Produkcyjnych (cGMP).
Oczywiście procesory ultradźwiękowe Hielscher są zbudowane do pracy 24/7 pod pełnym obciążeniem i dlatego mogą być niezawodnie eksploatowane w warunkach produkcji przemysłowej. Ze względu na wysoką wytrzymałość i niskie koszty utrzymania, przestoje urządzeń ultradźwiękowych są naprawdę niskie. Funkcje CIP (czyszczenie na miejscu) i SIP (sterylizacja na miejscu) minimalizują pracochłonne czyszczenie, zwłaszcza że wszystkie mokre części są gładkimi metalowymi powierzchniami (bez ukrytych otworów lub dysz).

Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych ultradźwiękowców: