Bioinżynieryjne gatunki bakterii, takie jak E. coli, jak również genetycznie modyfikowane komórki ssaków i roślin są szeroko stosowane w biotechnologii do ekspresji molekuł. Aby uwolnić zsyntetyzowane biomolekuły, konieczna jest niezawodna technika rozbijania komórek. Wysokowydajna ultradźwięki to sprawdzona metoda wydajnej i niezawodnej lizy komórek. – łatwo skalowalne do dużych wydajności. Firma Hielscher Ultrasonics oferuje Państwu wysokowydajne urządzenia ultradźwiękowe do efektywnej lizy komórek w celu uzyskania dużych ilości wysokiej jakości biomolekuł.

Ekstrakcja molekuł z fabryk komórkowych

Do produkcji szerokiej gamy biomolekuł, jako fabryki komórek mikrobiologicznych można wykorzystać różne zmodyfikowane mikroby i komórki roślinne, w tym Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana i algi, wśród wielu innych. Te fabryki komórkowe mogą produkować białka, lipidy, biochemikalia, polimery, biopaliwa i oleochemikalia, które są wykorzystywane jako żywność lub surowiec do zastosowań przemysłowych. Komórki wykorzystywane jako fabryki komórek są hodowane w zamkniętych bioreaktorach, gdzie mogą osiągnąć wysoką wydajność, specyficzność i niskie zapotrzebowanie na energię.
Aby wyizolować docelowe cząsteczki z bioinżynieryjnych hodowli komórkowych, komórki muszą zostać rozbite, tak aby materiał wewnątrzkomórkowy został uwolniony. Ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek są dobrze znane jako wysoce niezawodna i wydajna technika dezintegracji komórek i uwalniania związków.

Fabryki komórek mikrobiologicznych to zmodyfikowane metabolicznie komórki wykorzystywane do syntezy różnych cennych związków. Ultradźwiękowe rozbijanie komórek jest wydajną i niezawodną metodą uwalniania cennych związków z wnętrza komórki.
opracowanie i grafika: ©Villaverde, 2010.

Zalety ultradźwiękowych rozbijaczy komórek

Jako nietermiczna, łagodna, ale wysoce wydajna technologia, zakłócacze ultradźwiękowe są stosowane w laboratoriach i przemyśle do liasu komórek i produkcji wysokiej jakości ekstraktów, np. używanych do izolacji molekuł z fabryk komórkowych.

Ultradźwięki o dużej mocy do skutecznego rozbijania fabryk komórek bakteryjnych

Mechanizm i efekty działania ultradźwiękowych czynników zakłócających pracę komórek:
Ultradźwiękowe rozbijanie komórek wykorzystuje siłę fal ultradźwiękowych. Ultradźwiękowy homogenizator / rozbijacz komórek jest wyposażony w sondę (tzw. sonotrodę) wykonaną ze stopu tytanu, która oscyluje z wysoką częstotliwością ok. 20 kHz. Oznacza to, że sonda ultradźwiękowa wprowadza w sonikowaną ciecz 20.000 drgań na sekundę. Wbudowane w ciecz fale ultradźwiękowe charakteryzują się naprzemiennymi cyklami wysokiego i niskiego ciśnienia. Podczas cyklu niskiego ciśnienia ciecz rozszerza się i powstają drobne pęcherzyki próżniowe. Te bardzo małe pęcherzyki rosną przez kilka naprzemiennych cykli ciśnieniowych, aż nie mogą absorbować dalszej energii. W tym momencie pęcherzyki implodują gwałtownie i tworzą lokalnie środowisko o niezwykłej gęstości energii. Zjawisko to znane jest jako kawitacja akustyczna i charakteryzuje się lokalnie bardzo wysokimi temperaturami, bardzo wysokimi ciśnieniami i siłami ścinającymi. Naprężenia ścinające powodują efektywne pękanie ścian komórkowych i zwiększają transfer masy pomiędzy wnętrzem komórki a otaczającym ją rozpuszczalnikiem. Jako czysto mechaniczna technika, ultradźwiękowo generowane siły ścinające są szeroko stosowane i zalecane do rozbijania komórek bakteryjnych, jak również do izolacji białek. Jako prosta i szybka metoda rozbijania komórek, sonikacja jest idealna do izolacji małych, średnich i dużych objętości. Cyfrowe ultradźwięki firmy Hielscher wyposażone są w przejrzyste menu ustawień dla precyzyjnej kontroli sonikacji. Wszystkie dane sonikacji są automatycznie zapisywane na wbudowanej karcie SD i są łatwo dostępne. Wyszukane możliwości odprowadzania ciepła, jak np. chłodzenie zewnętrzne, sonikacja w trybie pulsacyjnym itd. podczas procesu dezintegracji ultradźwiękowej zapewniają utrzymanie idealnej temperatury procesu, a tym samym nienaruszalność ekstrahowanych związków wrażliwych na ciepło.

Badania podkreślają zalety ultradźwiękowego rozbijania i ekstrakcji komórek

Prof. Chemat i wsp. (2017) w swoim opracowaniu przypominają, że "ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami jest ekologiczną i ekonomicznie opłacalną alternatywą dla konwencjonalnych technik dla żywności i produktów naturalnych. Główne korzyści to zmniejszenie czasu ekstrakcji i przetwarzania, ilości zużywanej energii i rozpuszczalników, operacji jednostkowych oraz emisji CO₂ ".
Gabig-Ciminska i wsp. (2014) w swoim badaniu wykorzystali homogenizator wysokociśnieniowy oraz ultradźwiękowy dsintegrator komórek do lizy zarodników w celu uwolnienia DNA. Porównując obie metody rozbijania komórek, zespół badawczy stwierdza, że jeśli chodzi o lizę komórek w celu uwolnienia DNA zarodników, "analiza została przeprowadzona przy użyciu lizatów komórkowych z homogenizacji wysokociśnieniowej. Następnie zdaliśmy sobie sprawę, że ultradźwiękowe rozbijanie komórek ma do tego celu wyjątkowe zalety. Jest ono dość szybkie i może być przetwarzane dla małych objętości próbek." (Gabig-Ciminska i in., 2014)

Biomolekuły z fabryk komórkowych do produkcji żywności

Fabryki komórek mikrobiologicznych są opłacalną i wydajną metodologią produkcyjną wykorzystującą organizmy mikrobiologiczne do wytwarzania wysokiej wydajności rodzimych i nierodzimych metabolitów poprzez bioinżynierię metaboliczną mikroorganizmów takich jak bakterie, drożdże, grzyby itp. Enzymy luzem są na przykład produkowane przy użyciu mikroorganizmów, takich jak Aspergillus oryzae, grzyby i bakterie. Enzymy te są stosowane w produkcji żywności i napojów, a także w rolnictwie, bioenergii i gospodarstwie domowym.
Niektóre bakterie, takie jak Acetobacter xylinum i Gluconacetobacter xylinus, wytwarzają celulozę w procesie fermentacji, gdzie nanowłókna są syntetyzowane w procesie bottom-up. Celuloza bakteryjna (zwana również celulozą mikrobiologiczną) jest chemicznie równoważna celulozie roślinnej, ale charakteryzuje się wysokim stopniem krystaliczności i wysoką czystością (jest wolna od ligniny, hemicelulozy, pektyn i innych składników biogennych), jak również unikalną strukturą nanowłókien celulozowych - trójwymiarową (3D) siatkowaną siecią. (por. Zhong, 2020) W porównaniu z celulozą pochodzenia roślinnego, celuloza bakteryjna jest bardziej zrównoważona, a produkowana celuloza jest czysta i nie wymaga skomplikowanych etapów oczyszczania. Ultradźwięki i ekstrakcja rozpuszczalnikiem przy użyciu NaOH lub SDS (dodecylosiarczan sodu) są bardzo skuteczne w izolacji celulozy bakteryjnej z komórek bakteryjnych.

Biomolekuły z fabryk komórkowych do produkcji farmaceutyków i szczepionek

Jednym z najbardziej znanych produktów farmaceutycznych pochodzących z fabryk komórkowych jest insulina ludzka. Do bioinżynieryjnej produkcji insuliny wykorzystuje się głównie bakterie E. coli i Saccharomyces cerevisiae. Ponieważ biosyntetyzowane nanocząsteczki charakteryzują się wysoką biokompatybilnością, biologiczne nanocząsteczki, takie jak ferrytyna, są korzystne dla wielu zastosowań biomanufakturowych. Dodatkowo, produkcja w zmodyfikowanych metabolicznie mikrobach jest często znacznie bardziej wydajna w uzyskiwanych plonach. Na przykład, produkcja kwasu artemizynowego, resweratrolu i likopenu wzrosła dziesięciokrotnie do kilkusetkrotności i jest już ustalona lub jest w trakcie opracowywania do produkcji na skalę przemysłową. (por. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Na przykład, nanocząsteczki biomolekuł o właściwościach samoskładających się, takie jak ferrytyna i cząsteczki wirusopodobne, są szczególnie interesujące dla rozwoju szczepionek, ponieważ naśladują zarówno rozmiar, jak i strukturę patogenów i są podatne na koniugację powierzchniową antygenów w celu promowania interakcji z komórkami odpornościowymi. Cząsteczki takie ulegają ekspresji w tzw. fabrykach komórek (np. w zmodyfikowanych szczepach E. coli), które produkują określoną cząsteczkę docelową.

Protokół ultradźwiękowej lizy i uwalniania ferrytyny z E. coli BL21

Ferrytyna jest białkiem, którego podstawową funkcją jest magazynowanie żelaza. Ferrytyna wykazuje obiecujące możliwości jako samoskładające się nanocząstki w szczepionkach, gdzie jest wykorzystywana jako nośnik szczepionki (np. białka spike SARS-Cov-2). Badania naukowe Sun i in. (2016) pokazują, że rekombinowana ferrytyna może być uwalniana jako forma rozpuszczalna z Escherichia coli przy niskich stężeniach NaCl (≤50 mmol/L). W celu ekspresji ferrytyny w E. coli BL21 i uwolnienia ferrytyny, z powodzeniem zastosowano następujący protokół. Rekombinowany plazmid pET-28a/ferrytyna transformowano do szczepu E coli BL21 (DE3). Komórki E coli BL21 (DE3) z ferrytyną hodowano w podłożu wzrostowym LB z 0,5% kanamycyną w temperaturze 37°C i indukowano przy OD600 równej 0,6 za pomocą 0,4% izopropylo-β-D-tiogalaktoopiranozydu przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Ostateczna hodowla była następnie zbierana przez wirowanie przy 8000g przez 10 minut w 4°C, a osad był zbierany. Następnie osad zawieszano ponownie w podłożu LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrakt drożdżowy)/bufor lizujący (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) i różne stężenia roztworu NaCl (odpowiednio 0, 50, 100, 170 i 300 mmol/L). Do lizy komórek bakteryjnych zastosowano sonikację w trybie impulsowym: np. przy użyciu sonikatora ultrasonator UP400St przy 100% amplitudzie z cyklem pracy 5 sekund ON, 10 sekund OFF, przez 40 cykli), a następnie odwirowano przy 10 000g przez 15 minut w 4°C. Supernatant i osad analizowano metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE). Wszystkie żele barwione dodecylosiarczanem sodu skanowano przy użyciu skanera o wysokiej rozdzielczości. Obrazy żeli analizowano przy użyciu oprogramowania Magic Chemi 1D. W celu uzyskania optymalnej przejrzystości, pasma białkowe były wykrywane poprzez dostosowanie parametrów. Dane dla pasm zostały wygenerowane z technicznych triplikatów. (por. Sun i in., 2016)

Ultradźwiękowe rozbijacze komórek do przemysłowej lizy komórek

Liza i ekstrakcja ultradźwiękowa to niezawodna i wygodna metoda uwalniania metabolitów z fabryk komórkowych, wspomagająca w ten sposób wydajną produkcję cząsteczek docelowych. Ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek są dostępne w rozmiarach od laboratoryjnych do przemysłowych, a procesy mogą być skalowane w sposób całkowicie liniowy.
Firma Hielscher Ultrasonics jest kompetentnym partnerem w zakresie wysokowydajnych urządzeń ultradźwiękowych i posiada długoletnie doświadczenie w zakresie implantacji systemów ultradźwiękowych w warunkach laboratoryjnych i przemysłowych.
Systemy do rozbijania komórek firmy Hielscher Ultrasonics spełniają wszystkie wymagania w zakresie optymalnego sterowania procesem, łatwej obsługi i przyjaznej użytkownikowi technologii. Klienci i użytkownicy ultradźwiękowych urządzeń firmy Hielscher cenią sobie to, że ultradźwiękowe rozbijacze i ekstraktory komórek firmy Hielscher umożliwiają precyzyjne monitorowanie i sterowanie procesem. – za pomocą cyfrowego wyświetlacza dotykowego i zdalnego sterowania przez przeglądarkę. Wszystkie ważne dane sonikacji (np. energia netto, energia całkowita, amplituda, czas trwania, temperatura, ciśnienie) są automatycznie zapisywane jako plik CSV na zintegrowanej karcie SD. Pomaga to w uzyskaniu powtarzalnych i odtwarzalnych wyników oraz ułatwia standaryzację procesu, jak również spełnienie wymogów Dobrej Praktyki Wytwarzania (cGMP).
Oczywiście procesory ultradźwiękowe firmy Hielscher są przystosowane do pracy 24/7 pod pełnym obciążeniem i dlatego mogą być niezawodnie eksploatowane w przemysłowych warunkach produkcyjnych. Dzięki dużej wytrzymałości i niewielkim nakładom na konserwację czas przestoju urządzeń ultradźwiękowych jest naprawdę niewielki. Funkcje CIP (clean-in-place) i SIP (sterilize-in-place) minimalizują pracochłonne czyszczenie, zwłaszcza że wszystkie części mokre są gładkimi powierzchniami metalowymi (bez ukrytych kryz lub dysz).

Poniższa tabela daje wskazanie przybliżonej mocy przerobowych naszych ultrasonicators: