Ultradźwiękowa liza komórek modyfikowanych metodami bioinżynierii w produkcji przemysłowej

Gatunki bakterii modyfikowanych metodami bioinżynierii, takie jak E. coli, a także genetycznie modyfikowane typy komórek ssaków i roślin są szeroko stosowane w biotechnologii do ekspresji cząsteczek. Aby uwolnić te zsyntetyzowane biomolekuły, niezbędna jest niezawodna technika rozbijania komórek. Sonikacja o wysokiej wydajności jest sprawdzoną metodą skutecznej i niezawodnej lizy komórek – łatwo skalowalną do dużej wydajności przetwarzania. Hielscher Ultrasonics oferuje urządzenia ultradźwiękowe o wysokiej wydajności do skutecznej lizy komórek w celu wytwarzania dużych ilości biomolekuł wysokiej jakości.

Ekstrakcja cząsteczek z fabryk komórkowych

Do produkcji szerokiej gamy biomolekuł można wykorzystać różne modyfikowane mikroorganizmy i komórki roślinne jako mikrobiologiczne fabryki komórkowe, w tym między innymi Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana oraz glony. Te fabryki komórkowe mogą wytwarzać białka, lipidy, substancje biochemiczne, polimery, biopaliwa i substancje oleochemiczne, które wykorzystuje się jako żywność lub surowce do zastosowań przemysłowych. Komórki wykorzystywane jako fabryki komórkowe hoduje się w zamkniętych bioreaktorach, gdzie mogą osiągać wysoką wydajność i specyficzność przy niskim zapotrzebowaniu na energię.
Aby wyizolować docelowe cząsteczki z hodowli komórek modyfikowanych metodami bioinżynierii, komórki trzeba rozbić, tak aby uwolnić materiał wewnątrzkomórkowy. Ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek stanowią uznaną, wysoce niezawodną i skuteczną technikę dezintegracji komórek i uwalniania związków.

Mikrobiologiczne fabryki komórkowe to komórki zmodyfikowane metodami inżynierii metabolicznej, wykorzystywane do syntezy różnych cennych związków. Ultradźwiękowe rozbijanie komórek jest skuteczną i niezawodną metodą uwalniania cennych związków z wnętrza komórek.
badanie i grafika: ©Villaverde, 2010.

Zalety ultradźwiękowych urządzeń do rozbijania komórek

Ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek, wykorzystujące nietermiczną, łagodną, a zarazem wysoce skuteczną technologię, są stosowane w laboratoriach i przemyśle do lizy komórek oraz wytwarzania ekstraktów wysokiej jakości, wykorzystywanych np. do izolowania cząsteczek z fabryk komórkowych.

Ultradźwięki dużej mocy do skutecznego rozbijania mikrobiologicznych fabryk komórkowych

Mechanizm działania i efekty stosowania ultradźwiękowych urządzeń do rozbijania komórek:
Ultradźwiękowe rozbijanie komórek wykorzystuje moc fal ultradźwiękowych. Homogenizator ultradźwiękowy / urządzenie do rozbijania komórek jest wyposażone w sondę (zwaną również sonotrodą) wykonaną ze stopu tytanu, która oscyluje z wysoką częstotliwością około 20 kHz. Oznacza to, że sonotroda przekazuje 20 000 drgań na sekundę do cieczy poddawanej sonikacji. Fale ultradźwiękowe wprowadzane do cieczy charakteryzują się naprzemiennymi cyklami wysokiego / niskiego ciśnienia. Podczas cyklu niskiego ciśnienia ciecz rozszerza się i powstają maleńkie pęcherzyki próżniowe. Te bardzo małe pęcherzyki rosną przez kilka naprzemiennych cykli ciśnienia, aż nie mogą już pochłaniać dalszej energii. W tym momencie pęcherzyki kawitacyjne gwałtownie implodują, tworząc lokalnie środowisko o wyjątkowo wysokiej gęstości energii. Zjawisko to jest znane jako kawitacja akustyczna i charakteryzuje się lokalnie bardzo wysokimi temperaturami, bardzo wysokimi ciśnieniami oraz siłami ścinającymi. Te naprężenia ścinające skutecznie rozbijają ściany komórkowe i zwiększają przenoszenie masy między wnętrzem komórki a otaczającym ją rozpuszczalnikiem. Jako technika czysto mechaniczna, wykorzystanie sił ścinających generowanych ultradźwiękowo jest szeroko stosowaną i zalecaną metodą rozbijania komórek bakteryjnych oraz izolacji białek. Jako prosta i szybka metoda rozbijania komórek sonikacja idealnie nadaje się do izolacji w małych, średnich i dużych objętościach. Cyfrowe sonikatory Hielscher są wyposażone w przejrzyste menu ustawień umożliwiające precyzyjną kontrolę sonikacji. Wszystkie dane sonikacji są automatycznie zapisywane na wbudowanej karcie SD i są łatwo dostępne. Zaawansowane możliwości odprowadzania ciepła, takie jak chłodzenie zewnętrzne, sonikacja w trybie impulsowym itp., podczas procesu dezintegracji ultradźwiękowej zapewniają utrzymanie idealnej temperatury procesu, a tym samym nienaruszonej postaci ekstrahowanych związków wrażliwych na ciepło.

Badania potwierdzają zalety ultradźwiękowego rozbijania komórek i ekstrakcji

Prof. Chemat i wsp. (2017) podsumowują w swoim badaniu, że „ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami jest przyjazną dla środowiska i ekonomicznie opłacalną alternatywą dla konwencjonalnych technik stosowanych do żywności i produktów naturalnych. Główne korzyści to skrócenie czasu ekstrakcji i przetwarzania, zmniejszenie ilości zużywanej energii i rozpuszczalników, liczby operacji jednostkowych oraz emisji CO₂ .”
Gabig-Ciminska i wsp. (2014) wykorzystali w swoim badaniu homogenizator wysokociśnieniowy i ultradźwiękowy dezintegrator komórek do lizy przetrwalników w celu uwolnienia DNA. Porównując obie metody rozbijania komórek, zespół badawczy stwierdza w odniesieniu do lizy komórek w celu uzyskania DNA przetrwalników, że „analizę przeprowadzono z wykorzystaniem lizatów komórkowych uzyskanych przez homogenizację wysokociśnieniową. Następnie zdaliśmy sobie sprawę, że ultradźwiękowe rozbijanie komórek ma wyjątkowe zalety w tym zastosowaniu. Jest dość szybkie i można je przeprowadzać dla małych objętości próbek.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekuły z fabryk komórkowych do produkcji żywności

Mikrobiologiczne fabryki komórkowe stanowią wykonalną i wydajną metodę produkcji, wykorzystującą organizmy mikrobiologiczne do uzyskiwania dużych ilości metabolitów rodzimych i nierodzimych poprzez metaboliczną bioinżynierię mikroorganizmów, takich jak bakterie, drożdże, grzyby itp. Enzymy produkowane na dużą skalę wytwarza się na przykład z wykorzystaniem mikroorganizmów, takich jak Aspergillus oryzae, grzyby i bakterie. Enzymy te są wykorzystywane do produkcji żywności i napojów, a także w rolnictwie, bioenergetyce i środkach do utrzymania czystości w gospodarstwie domowym.
Niektóre bakterie, takie jak Acetobacter xylinum i Gluconacetobacter xylinus, wytwarzają celulozę podczas procesu fermentacji, w którym nanowłókna są syntetyzowane metodą oddolną. Celuloza bakteryjna (znana również jako celuloza mikrobiologiczna) jest chemicznie równoważna celulozie roślinnej, ale charakteryzuje się wysokim stopniem krystaliczności i wysoką czystością (nie zawiera ligniny, hemicelulozy, pektyny ani innych składników biogennych), a także unikalną strukturą trójwymiarowej (3D) sieci utworzonej ze splecionych nanowłókien celulozy. (por. Zhong, 2020) W porównaniu z celulozą pochodzenia roślinnego celuloza bakteryjna jest bardziej zrównoważona środowiskowo, a wytwarzana celuloza jest czysta i nie wymaga złożonych etapów oczyszczania. Sonikacja oraz ekstrakcja rozpuszczalnikowa z użyciem NaOH lub SDS (dodecylosiarczanu sodu) są bardzo skuteczne w izolowaniu celulozy bakteryjnej z komórek bakterii.

Biomolekuły z fabryk komórkowych do produkcji leków i szczepionek

Jednym z najważniejszych produktów farmaceutycznych uzyskiwanych z fabryk komórkowych jest ludzka insulina. Do produkcji insuliny metodami bioinżynierii wykorzystuje się głównie E. coli i Saccharomyces cerevisiae. Ponieważ cząsteczki o rozmiarach nanometrycznych uzyskiwane w drodze biosyntezy wykazują wysoką biokompatybilność, biologiczne nanocząstki, takie jak ferrytyna, są korzystne w licznych zastosowaniach bioprodukcji. Ponadto produkcja z wykorzystaniem mikroorganizmów zmodyfikowanych metodami inżynierii metabolicznej jest często znacznie wydajniejsza pod względem uzyskiwanych ilości produktu. Na przykład produkcja kwasu artemizynowego, resweratrolu i likopenu wzrosła od dziesięciu do kilkuset razy i jest już wdrożona na skalę przemysłową lub trwa jej opracowywanie do takiej skali. (por. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Na przykład biomolekuły białkowe o rozmiarach nanometrycznych i właściwościach samoorganizacji, takie jak ferrytyna i cząstki wirusopodobne, są szczególnie interesujące w opracowywaniu szczepionek, ponieważ naśladują zarówno wielkość, jak i strukturę patogenów oraz umożliwiają koniugację antygenów na powierzchni w celu wspierania interakcji z komórkami odpornościowymi. Takie cząsteczki ulegają ekspresji w tak zwanych fabrykach komórkowych (np. zmodyfikowanych szczepach E. coli), które wytwarzają określoną cząsteczkę docelową.

Protokół ultradźwiękowej lizy E. coli BL21 w celu uwolnienia ferrytyny

Ferrytyna jest białkiem, którego podstawową funkcją jest magazynowanie żelaza. Ferrytyna wykazuje obiecujące możliwości zastosowania jako samoorganizujące się nanocząstki w szczepionkach, gdzie jest wykorzystywana jako nośnik składników szczepionki (np. białek kolca SARS-Cov-2). Badania naukowe Sun i wsp. (2016) pokazują, że rekombinowana ferrytyna może być uwalniana z Escherichia coli w postaci rozpuszczalnej przy niskich stężeniach NaCl (≤50 mmol/L). W celu ekspresji ferrytyny w E. coli BL21 i jej uwolnienia z powodzeniem zastosowano następujący protokół. Rekombinowany plazmid pET-28a/ferritin wprowadzono przez transformację do szczepu E coli BL21 (DE3). Komórki E coli BL21 (DE3) wytwarzające ferrytynę hodowano na pożywkach LB z 0,5% kanamycyny w temperaturze 37°C, a przy OD600 wynoszącym 0,6 indukowano je 0,4% izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydem przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Końcową hodowlę następnie zebrano przez wirowanie przy 8000g przez 10 minut w temperaturze 4°C i pobrano osad. Następnie osad ponownie zawieszono odpowiednio w pożywce LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstraktu drożdżowego)/buforze do lizy (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) i roztworach NaCl o różnych stężeniach (0, 50, 100, 170 i 300 mmol/L). Do lizy komórek bakteryjnych zastosowano sonikację w trybie impulsowym: np. z wykorzystaniem sonikatora UP400St przy amplitudzie 100% z cyklem pracy obejmującym 5 sekund włączenia i 10 sekund wyłączenia, przez 40 cykli), a następnie przeprowadzono wirowanie przy 10 000g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Supernatant i osad analizowano metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE). Wszystkie żele barwione dodecylosiarczanem sodu zeskanowano za pomocą skanera o wysokiej rozdzielczości. Obrazy żeli analizowano przy użyciu oprogramowania Magic Chemi 1D. W celu uzyskania optymalnej czytelności prążki białkowe wykrywano przez dostosowanie parametrów. Dane dotyczące prążków uzyskano z trzech powtórzeń technicznych. (por. Sun et al., 2016)

Ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek do przemysłowej lizy fabryk komórkowych

Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja to niezawodna i wygodna metoda uwalniania metabolitów z fabryk komórkowych, wspomagająca tym samym skuteczną produkcję cząsteczek docelowych. Ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek są dostępne w rozmiarach od laboratoryjnych po przemysłowe, a procesy można skalować całkowicie liniowo.
Hielscher Ultrasonics jest kompetentnym partnerem w zakresie ultradźwiękowych urządzeń do rozbijania komórek o wysokiej wydajności i ma wieloletnie doświadczenie we wdrażaniu systemów ultradźwiękowych w instalacjach stołowych i przemysłowych.
Pod względem zaawansowanych rozwiązań sprzętowych i programowych systemy rozbijania komórek Hielscher Ultrasonics spełniają wszystkie wymagania dotyczące optymalnej kontroli procesu, łatwej obsługi i wygody użytkowania. Klienci i użytkownicy sonikatorów Hielscher cenią możliwość precyzyjnego monitorowania i kontrolowania procesu, którą zapewniają ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek i ekstraktory Hielscher – za pomocą cyfrowego ekranu dotykowego i zdalnego sterowania przez przeglądarkę. Wszystkie istotne dane sonikacji (np. energia netto, energia całkowita, amplituda, czas trwania, temperatura, ciśnienie) są automatycznie zapisywane jako plik CSV na zintegrowanej karcie SD. Pomaga to uzyskiwać odtwarzalne i powtarzalne wyniki oraz ułatwia standaryzację procesu i spełnianie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania (cGMP).
Oczywiście procesory ultradźwiękowe Hielscher są zaprojektowane do pracy 24/7 pod pełnym obciążeniem, dzięki czemu mogą niezawodnie pracować w warunkach produkcji przemysłowej. Dzięki wysokiej wytrzymałości i niewielkim wymaganiom konserwacyjnym przestoje urządzeń ultradźwiękowych są naprawdę krótkie. Funkcje CIP (czyszczenie na miejscu) i SIP (sterylizacja na miejscu) ograniczają do minimum pracochłonne czyszczenie, zwłaszcza że wszystkie części mające kontakt z cieczą mają gładkie powierzchnie metalowe (bez ukrytych otworów lub dysz).

Poniższa tabela przedstawia orientacyjną, przybliżoną wydajność przetwarzania naszych sonikatorów: