Biosyntetyczna produkcja oligosacharydów mleka ludzkiego

Biosynteza oligosacharydów mleka ludzkiego (HMO) poprzez fermentację lub reakcje enzymatyczne jest procesem złożonym, wymagającym zużycia zasobów i często mało wydajnym. Sonikacja zwiększa transport masy między substratem a fabrykami komórkowymi oraz stymuluje wzrost i metabolizm komórek. Tym samym sonikacja intensyfikuje fermentację i procesy biochemiczne, prowadząc do szybszej i bardziej wydajnej produkcji HMO.

Oligosacharydy mleka ludzkiego

Oligosacharydy mleka ludzkiego (HMO), znane również jako glikany mleka ludzkiego, to cząsteczki cukrów należące do grupy oligosacharydów. Do istotnych przykładów HMO należą 2’-fukozylolaktoza (2′-FL), lakto-N-neotetraoza (LNnT), 3’-galaktozylolaktoza (3′-GL) i difukozylolaktoza (DFL).
Chociaż mleko kobiece zawiera ponad 150 różnych struktur HMO, obecnie tylko 2′-fukozylolaktoza (2′-FL) i lakto-N-neotetraoza (LNnT) są produkowane na skalę komercyjną i stosowane jako dodatki żywieniowe w preparatach do żywienia niemowląt.
Oligosacharydy mleka ludzkiego (HMO) są znane ze swojego znaczenia w żywieniu niemowląt. Oligosacharydy mleka ludzkiego są wyjątkowym rodzajem składników odżywczych, które w jelitach niemowlęcia działają jako prebiotyki, substancje przeciwdrobnoustrojowe zapobiegające adhezji oraz immunomodulatory, a także w znacznym stopniu przyczyniają się do rozwoju mózgu. HMO występują wyłącznie w mleku kobiecym; mleko innych ssaków (np. krów, kóz, owiec, wielbłądów itp.) nie zawiera tych szczególnych form oligosacharydów.
Oligosacharydy mleka ludzkiego są trzecim pod względem zawartości składnikiem stałym mleka ludzkiego i mogą występować w wodzie w postaci rozpuszczonej, zemulgowanej lub zawieszonej. Laktoza i kwasy tłuszczowe są najobficiej występującymi składnikami stałymi mleka ludzkiego. HMO występują w stężeniu 0,35–0,88 uncji (9,9–24,9 g)/ L. Znanych jest około 200 oligosacharydów mleka ludzkiego różniących się strukturą. Dominującym oligosacharydem u 80% wszystkich kobiet jest 2′-fukozylolaktoza, która występuje w mleku kobiecym w stężeniu około 2,5 g/ L.
Ponieważ HMO nie są trawione, nie dostarczają kalorii. Jako niestrawne węglowodany pełnią funkcję prebiotyków i są selektywnie fermentowane przez pożądaną mikroflorę jelitową, zwłaszcza bifidobakterie.

Biosynteza oligosacharydów mleka ludzkiego

Fabryki komórkowe oraz układy enzymatyczne / chemoenzymatyczne to obecnie stosowane technologie syntezy HMO. W produkcji HMO na skalę przemysłową fermentacja z wykorzystaniem mikrobiologicznych fabryk komórkowych, synteza biochemiczna oraz różne reakcje enzymatyczne stanowią możliwe sposoby bioprodukcji HMO. Ze względów ekonomicznych biosynteza z wykorzystaniem mikrobiologicznych fabryk komórkowych jest obecnie jedyną techniką stosowaną w przemysłowej produkcji HMO.

Fermentacyjna produkcja HMO z wykorzystaniem mikrobiologicznych fabryk komórkowych

E.coli, Saccharomyces cerevisiae i Lactococcus lactis są powszechnie stosowanymi fabrykami komórkowymi wykorzystywanymi do bioprodukcji cząsteczek biologicznych, takich jak HMO. Fermentacja jest procesem biochemicznym, w którym mikroorganizmy przekształcają substrat w docelowe cząsteczki biologiczne. Mikrobiologiczne fabryki komórkowe wykorzystują jako substrat cukry proste, które przekształcają w HMO. Ponieważ cukry proste (np. laktoza) są łatwo dostępnym i tanim substratem, proces biosyntezy pozostaje opłacalny.
Na szybkość wzrostu i biokonwersji wpływa przede wszystkim transport masy składników odżywczych (substratu) do mikroorganizmów. Szybkość transportu masy jest głównym czynnikiem wpływającym na syntezę produktu podczas fermentacji. Sonikacja jest dobrze znana ze wspomagania transportu masy.
Podczas fermentacji warunki w bioreaktorze muszą być stale monitorowane i regulowane, aby komórki mogły rosnąć jak najszybciej, a następnie produkować docelowe biomolekuły (np. oligosacharydy, takie jak HMO; insulinę; białka rekombinowane). Teoretycznie tworzenie produktu rozpoczyna się, gdy tylko hodowla komórkowa zaczyna rosnąć. Jednak zwłaszcza w przypadku komórek zmodyfikowanych genetycznie, takich jak mikroorganizmy poddane inżynierii genetycznej, jest ono zwykle indukowane później poprzez dodanie do substratu substancji chemicznej, która zwiększa ekspresję docelowej biomolekuły. Bioreaktory ultradźwiękowe (sonobioreaktory) można precyzyjnie kontrolować i umożliwiają one swoistą stymulację mikroorganizmów. Prowadzi to do przyspieszenia biosyntezy i zwiększenia wydajności.
Liza i ekstrakcja ultradźwiękowa: fermentacyjna produkcja złożonych HMO może być ograniczana przez niskie stężenia produktów fermentacji i pozostawanie produktów wewnątrz komórek. Liza i ekstrakcja ultradźwiękowa służą do uwalniania materiału wewnątrzkomórkowego przed oczyszczaniem i dalszymi etapami przetwarzania.

Fermentacja wspomagana ultradźwiękami

Szybkość wzrostu mikroorganizmów, takich jak Escherichia coli, E.coli poddane inżynierii genetycznej, Saccharomyces cerevisiae i Lactococcus lactis, można zwiększyć poprzez zwiększenie szybkości transportu masy i przepuszczalności ściany komórkowej dzięki zastosowaniu kontrolowanej sonikacji o niskiej częstotliwości. Jako łagodna, nietermiczna technika przetwarzania sonikacja wprowadza do brzeczki fermentacyjnej wyłącznie siły mechaniczne.
Kawitacja akustyczna: zasada działania sonikacji opiera się na kawitacji akustycznej. Sonda ultradźwiękowa (sonotroda) sprzęga fale ultradźwiękowe o niskiej częstotliwości z ośrodkiem. Fale ultradźwiękowe rozchodzą się w cieczy, tworząc naprzemienne cykle wysokiego ciśnienia (sprężania) / niskiego ciśnienia (rozrzedzania). W wyniku sprężania i rozciągania cieczy w naprzemiennych cyklach powstają maleńkie pęcherzyki próżniowe. Te małe pęcherzyki próżniowe rosną przez kilka cykli, aż osiągną rozmiar, przy którym nie mogą już pochłaniać dalszej energii. W tym punkcie maksymalnego wzrostu pęcherzyk próżniowy gwałtownie imploduje i wytwarza lokalnie ekstremalne warunki, określane jako zjawisko kawitacji. W kawitacyjnym „gorącym punkcie” można zaobserwować duże różnice ciśnienia i temperatury oraz intensywne siły ścinające wraz ze strugami cieczy o prędkości do 280m/sec. Dzięki tym efektom kawitacyjnym uzyskuje się intensywny transport masy i sonoporację (perforację ścian komórkowych i błon komórkowych). Składniki odżywcze substratu są transportowane do żywych, całych komórek i do ich wnętrza, dzięki czemu fabryki komórkowe są optymalnie odżywiane, a szybkość wzrostu i konwersji wzrasta. Bioreaktory ultradźwiękowe stanowią prosty, a zarazem wysoce skuteczny sposób przetwarzania biomasy w procesie biosyntezy prowadzonym w jednym naczyniu.
Precyzyjnie kontrolowana, łagodna sonikacja jest dobrze znana z intensyfikowania procesów fermentacyjnych.
Sonikacja poprawia „produktywność wielu bioprocesów z udziałem żywych komórek poprzez zwiększenie pobierania substratu, zwiększenie produkcji lub wzrostu dzięki zwiększeniu porowatości komórek oraz potencjalnie zwiększenie uwalniania składników komórkowych”. (Naveena et al. 2015)
Dowiedz się więcej o fermentacji wspomaganej ultradźwiękami!

Naveena et al. (2015) stwierdzili, że intensyfikacja ultradźwiękowa zapewnia szereg korzyści podczas bioprzetwarzania, w tym niskie koszty eksploatacji w porównaniu z innymi metodami usprawniania procesu, prostotę obsługi i niewielkie zapotrzebowanie na moc.

Wysokowydajne ultradźwiękowe reaktory fermentacyjne

Procesy fermentacyjne obejmują żywe mikroorganizmy, takie jak bakterie lub drożdże, które pełnią funkcję fabryk komórkowych. Chociaż sonikację stosuje się w celu wspomagania transportu masy oraz zwiększania szybkości wzrostu mikroorganizmów i konwersji, kluczowe znaczenie ma precyzyjna kontrola natężenia ultradźwięków, aby uniknąć zniszczenia fabryk komórkowych.
Hielscher Ultrasonics specjalizuje się w projektowaniu, produkcji i dystrybucji wysokowydajnych sonikatorów, które można precyzyjnie kontrolować i monitorować, aby zapewnić wyjątkowo wysoką wydajność fermentacji.

Kontrola procesu jest nie tylko niezbędna do uzyskania wysokiej wydajności i doskonałej jakości, lecz także umożliwia powtarzanie i odtwarzanie wyników. Zwłaszcza w przypadku stymulacji fabryk komórkowych dostosowanie parametrów sonikacji do specyfiki komórek jest niezbędne do uzyskania wysokiej wydajności i zapobiegania degradacji komórek. Dlatego wszystkie cyfrowe modele sonikatorów Hielscher są wyposażone w inteligentne oprogramowanie, które umożliwia dostosowywanie, monitorowanie i korygowanie parametrów sonikacji. Parametry procesu ultradźwiękowego, takie jak amplituda, temperatura, ciśnienie, czas sonikacji, cykle pracy i dostarczona energia, mają zasadnicze znaczenie dla wspomagania produkcji HMO poprzez fermentację.
Inteligentne oprogramowanie sonikatorów Hielscher automatycznie zapisuje wszystkie ważne parametry procesu na zintegrowanej karcie SD. Automatyczny zapis danych procesu sonikacji stanowi podstawę standaryzacji procesu oraz odtwarzalności / powtarzalności, które są wymagane przez Dobrą Praktykę Wytwarzania (GMP).

Reaktory ultradźwiękowe do fermentacji

Hielscher oferuje sondy ultradźwiękowe o różnych rozmiarach, długościach i geometriach, które można stosować zarówno do obróbki okresowej, jak i w przepływie ciągłym. Reaktory ultradźwiękowe, znane również jako sonobioreaktory, są dostępne dla dowolnej objętości, obejmując bioprzetwarzanie ultradźwiękowe od małych próbek laboratoryjnych po skalę pilotażową i w pełni komercyjną produkcję.
Powszechnie wiadomo, że położenie sonotrody ultradźwiękowej w naczyniu reakcyjnym wpływa na rozkład kawitacji i mikroprzepływów w ośrodku. Sonotrodę i reaktor ultradźwiękowy należy dobierać odpowiednio do przetwarzanej objętości pożywki z komórkami. Chociaż sonikację można prowadzić zarówno w trybie okresowym, jak i ciągłym, przy dużych objętościach produkcyjnych zaleca się stosowanie instalacji o przepływie ciągłym. Podczas przechodzenia przez ultradźwiękową komorę przepływową cała pożywka z komórkami jest poddawana dokładnie takiej samej ekspozycji na sonikację, co zapewnia najskuteczniejszą obróbkę. Szeroka gama sond ultradźwiękowych i reaktorów z komorą przepływową Hielscher Ultrasonics umożliwia skompletowanie idealnego zestawu do bioprzetwarzania ultradźwiękowego.

Hielscher Ultrasonics – od laboratorium przez skalę pilotażową po produkcję

Hielscher Ultrasonics oferuje pełne spektrum urządzeń ultradźwiękowych: od kompaktowych ręcznych homogenizatorów ultradźwiękowych do przygotowywania próbek, przez systemy stołowe i pilotażowe, po przemysłowe urządzenia ultradźwiękowe o dużej mocy, które z łatwością przetwarzają w ciągu godziny ilości odpowiadające ładunkom samochodów ciężarowych. Dzięki wszechstronności i elastycznym możliwościom instalacji i montażu sonikatory Hielscher można łatwo zintegrować z wszelkiego rodzaju reaktorami okresowymi, reaktorami okresowymi z zasilaniem lub układami o przepływie ciągłym.
Różnorodne akcesoria oraz części wykonane na zamówienie umożliwiają idealne dostosowanie zestawu ultradźwiękowego do wymagań procesu.
Procesory ultradźwiękowe Hielscher, skonstruowane do pracy 24/7 przy pełnym obciążeniu i intensywnej eksploatacji w wymagających warunkach, są niezawodne i wymagają jedynie niewielkich nakładów na konserwację.
Poniższa tabela przedstawia orientacyjną zdolność przetwarzania naszych sonikatorów: