Wydajna synteza peptydów dzięki sonikacji
Synteza peptydów w fazie stałej (Solid Phase Peptide Synthesis - SPPS) jest powszechnie stosowaną metodą syntezy peptydów. Ultradźwięki to niezawodne narzędzie do intensyfikacji syntezy peptydów w fazie stałej, pozwalające uzyskać wyższe wydajności, lepszą czystość, brak racemizacji i znacznie przyspieszone tempo reakcji. Firma Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania ultradźwiękowe do syntezy, rozszczepiania i rozpuszczania peptydów.
Ultradźwiękowa synteza peptydów
Ultradźwięki są już szeroko stosowane jako metoda intensyfikująca w syntezie organicznej i są dobrze znane ze swoich zalet, takich jak drastyczne skrócenie czasu reakcji, wyższe wydajności, mniejsza ilość produktów ubocznych, inicjowanie szlaków, których nie można osiągnąć w inny sposób, i/lub lepsza selektywność. Duże korzyści można również uzyskać, gdy sonikacja zostanie włączona do reakcji syntezy peptydów. Wyniki badań wykazały, że synteza peptydów wspomagana ultradźwiękami pozwala uzyskać optymalną wydajność peptydów o wysokiej czystości, bez racemizacji, w krótkim czasie reakcji.
- Wysoka wydajność peptydów
- Znacznie szybsza synteza
- Wyższa czystość peptydów
- Brak racemizacji
- Równoległa synteza różnych peptydów
- Możliwość liniowego skalowania do dowolnej objętości
Ultradźwiękowy konik do równomiernej sonikacji kilku zbiorników reaktora w celu usprawnienia syntezy peptydów.
Grafika przedstawiająca syntezę peptydów w fazie stałej Merrifielda. Ultradźwięki są stosowane do promowania i wzmacniania reakcji syntezy, jak również do odszczepiania zsyntetyzowanych peptydów od żywicy.
Grafika: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
Synteza peptydów w fazie stałej ulepszona ultradźwiękami
Synteza peptydów w fazie stałej (SPPS) jest reakcją chemiczną, która umożliwia utworzenie łańcucha peptydowego w wyniku kolejnych reakcji pochodnych aminokwasów na nierozpuszczalnym porowatym podłożu. Jednak tradycyjna synteza peptydów w fazie stałej jest procesem stosunkowo mało wydajnym i powolnym. Dlatego też ultradźwiękowa intensyfikacja syntezy peptydów jest cenionym narzędziem umożliwiającym bardziej wydajną i szybszą syntezę peptydów.
Silva i in. (2021) porównali "klasyczną" syntezę peptydów w fazie stałej (SPPS) z syntezą peptydów wspomaganą ultradźwiękami (US) na przykładzie otrzymywania trzech peptydów, Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), Pep2 (RQMATADEA-NH2) i Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS wspomagany ultradźwiękami prowadził do 14-krotnego (Pep1) i 4-krotnego (Pep2) skrócenia czasu łączenia peptydów w porównaniu z metodą "klasyczną". Co ciekawe, SPPS wspomagany ultradźwiękami dał Pep1 o wyższej czystości (82%) niż "klasyczny" SPPS (73%). Znaczne skrócenie czasu syntezy w połączeniu z wysoką czystością surowego peptydu skłoniło zespół badawczy do zastosowania SPPS wspomaganego ultradźwiękami do dużego peptydu Pep3, który zawiera dużą liczbę aminokwasów hydrofobowych i sekwencji homoligicznych. Co godne uwagi, syntezę tego 25-merowego peptydu przeprowadzono w czasie krótszym niż 6 godzin (347 min) z umiarkowaną czystością (ok. 49%).
Szybsza synteza peptydów za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej z wykorzystaniem mieszania ultradźwiękowego.
(Opracowanie i analiza: Wołczański i in., 2019)
Merlino i wsp. (2019) przeprowadzili również kompleksowe badania wpływu ultradźwięków na syntezę peptydów w fazie stałej opartą na Fmoc, co pozwoliło na syntezę różnych biologicznie aktywnych peptydów (do 44-mer), przy znacznej oszczędności materiału i czasu reakcji. Wykazano, że ultradźwięki nie nasilają głównych reakcji ubocznych i poprawiają syntezę peptydów obdarzonych “sekwencje trudne”Stawia to ultradźwiękowo wspomaganą syntezę peptydów w fazie stałej (US-SPPS) wśród obecnie stosowanych, wysokowydajnych strategii syntezy peptydów.
Dostępność wysokowydajnych systemów do ultradźwiękowej (sonicznej) syntezy peptydów pozwala na znaczną poprawę szybkości syntezy i zwiększenie czystości surowych produktów. (por. Wołczański i in., 2019)
Badanie zjawiska racemizacji. Porównanie znaczących widm 1H NMR modelowych peptydów syntetyzowanych ręcznie metodą klasyczną w temperaturze pokojowej i metodą ultradźwiękową w podwyższonej temperaturze. Przesunięcia chemiczne α-protonów His i Cys oraz grupy metylenowej Acm (lewy panel), ɣ-metylowych protonów Val (prawy panel) wskazują, że sonikacja w temp. 70°C nie powoduje racemizacji.
(Opracowanie i analiza: Wołczański i in., 2019)
Ultradźwiękowe rozszczepianie peptydów
Po zakończeniu syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS) zsyntetyzowane peptydy należy oddzielić od żywic polimerowych. Etap ten znany jest również jako deprotekcja. Porównując metodę wytrząsania i ultradźwiękową do usuwania peptydów z żywicy, można stwierdzić, że metoda wytrząsania wymaga około 1 godziny, podczas gdy usuwanie peptydów za pomocą ultradźwięków trwa od 15 do 20 minut. Ultradźwiękowe rozszczepianie peptydów można stosować do rozszczepiania chronionych aminokwasów i peptydów połączonych z żywicami polistyrenowymi za pomocą benzylowych wiązań estrowych.
Ultradźwiękowe usuwanie peptydów z żywicy polistyrenowej umożliwia otrzymanie peptydów o wysokiej czystości, bez racemizacji, w ramach szybkiej procedury.
(opracowanie i grafika: ©Anuradha i Ravindranath, 1995)
Reaktor z mieszadłem ultradźwiękowym do ulepszonej i przyspieszonej syntezy peptydów. Zdjęcie przedstawia ultradźwiękowiec UP200St w szklanym reaktorze z mieszadłem.
Firma Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania ultradźwiękowe do sonikacji bezpośredniej i pośredniej. Wydajne i precyzyjnie sterowane procesory ultradźwiękowe dostarczają do naczynia reakcyjnego dokładnie taką ilość energii ultradźwiękowej, jaka jest potrzebna. Niezależnie od tego, czy jako naczynia do syntezy używasz strzykawek, probówek, płytek wielodołkowych czy szklanych reaktorów, firma Hielscher Ultrasonics oferuje najbardziej odpowiedni ultradźwiękowy procesor do zastosowań związanych z peptydami.
- peptydy dostosowane do potrzeb klienta
- produkcja peptydów na dużą skalę
- biblioteki peptydowe
Wiele syntez peptydów przeprowadza się w strzykawkach (np. w reaktorach strzykawkowych z otworami). Ultradźwiękowe mieszadło strzykawkowe firmy Hielscher sonduje roztwór peptydów, sprzęgając fale ultradźwiękowe przez ścianki strzykawki do cieczy. Ultradźwiękowe mieszadło strzykawkowe jest jednym z najpopularniejszych rozwiązań ultradźwiękowych do wspomaganej ultradźwiękami syntezy peptydów.
Ultradźwiękowy stojak na filiżanki jest odpowiednim narzędziem do sonikacji do 5 naczyń reakcyjnych, podczas gdy VialTweeter może pomieścić do 10 probówek reakcyjnych oraz dodatkowo 5 większych naczyń dzięki mocowaniu zaciskowemu.
W przypadku innych typów reaktorów, takich jak reaktor fazy stałej Merrifielda lub Kamysza oraz innych zbiorników/reaktorów z polipropylenu lub borokrzemianu, firma Hielscher oferuje dostosowane do potrzeb klienta systemy ultradźwiękowe z zaciskami do sonikacji pośredniej.
UIP400MTP jest idealnym urządzeniem do syntezy peptydów w fazie stałej w płytkach wielokomorowych/mikrotitracyjnych. Kawitacja ultradźwiękowa jest pośrednio równomiernie sprzężona z licznymi dołkami na próbki, co zapewnia doskonały transfer masy i reakcję syntezy. Obejrzyj poniższy film, aby zobaczyć UIP400MTP w akcji!
Oczywiście większe reaktory ze szkła prążkowanego, np. do syntezy w fazie roztworu, można łatwo wyposażyć w sondy ultradźwiękowe (np. sonotrody lub tuby ultradźwiękowe) dowolnej wielkości.
- różne typy ultradźwiękowców
- sonikacja bezpośrednia i pośrednia
- precyzyjna regulacja natężenia światła
- precyzyjna kontrola temperatury
- ultradźwięki ciągłe lub impulsowe
- inteligentne funkcje, urządzenia programowalne
- Dostępny dla każdej objętości
- liniową skalowalność
Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!
Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe do zastosowań mieszania, dyspergowania, emulgowania i ekstrakcji na skalę laboratoryjną, pilotażową i przemysłową.
Literatura / materiały źródłowe
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Fakty Warto wiedzieć
Peptydy
Peptydy to związki, w których wiele aminokwasów połączonych jest wiązaniami amidowymi, tzw. wiązaniami peptydowymi. Po połączeniu w struktury złożone – Te duże struktury peptydowe, składające się zazwyczaj z 50 lub więcej aminokwasów, nazywane są białkami. Peptydy są niezbędnym elementem budulcowym życia i pełnią wiele funkcji w organizmie.
Synteza peptydów
W chemii organicznej, biologii molekularnej i naukach przyrodniczych synteza peptydów to proces wytwarzania peptydów. Peptydy są syntetyzowane chemicznie poprzez reakcję kondensacji grupy karboksylowej jednego aminokwasu z grupą aminową innego aminokwasu. W celu uniknięcia niepożądanych reakcji ubocznych z różnymi łańcuchami bocznymi aminokwasów zwykle stosuje się strategie grup ochronnych (także grup zabezpieczających).
Chemiczna (in-vitro) synteza peptydów rozpoczyna się najczęściej od przyłączenia grupy karboksylowej przybywającego aminokwasu (C-terminus) do N-terminusu rosnącego łańcucha peptydowego. W przeciwieństwie do tej syntezy C-N, naturalna biosynteza długich peptydów w organizmach żywych przebiega w przeciwnym kierunku. Oznacza to, że w biosyntezie N-końcówka wchodzącego aminokwasu jest połączona z C-końcówką łańcucha białkowego (N-to-C).
Większość protokołów badawczo-rozwojowych syntezy peptydów opiera się na metodach fazy stałej, podczas gdy metody syntezy w fazie roztworu są stosowane w przemysłowej produkcji peptydów na dużą skalę.
Firma Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe od laboratorium do wielkość przemysłowa.