Synteza peptydów w fazie stałej – większa wydajność dzięki sonikacji
Synteza peptydów w fazie stałej (SPPS) jest powszechnie stosowaną metodą syntezy peptydów. Sonikacja jest niezawodnym narzędziem intensyfikacji syntezy peptydów w fazie stałej, zapewniającym wyższą wydajność, większą czystość, brak racemizacji i znacznie większą szybkość reakcji. Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania ultradźwiękowe do syntezy, odszczepiania i rozpuszczania peptydów.
Ultradźwiękowa synteza peptydów w fazie stałej
Sonikacja jest już szeroko stosowana jako metoda intensyfikacji syntezy organicznej i jest dobrze znana ze swoich zalet, takich jak radykalne skrócenie czasu reakcji, wyższa wydajność, mniejsza ilość produktów ubocznych, inicjowanie szlaków reakcji, których nie można uruchomić innymi sposobami, i/lub lepsza selektywność. Duże korzyści można również uzyskać, wprowadzając sonikację do reakcji syntezy peptydów. Wyniki badań wykazały, że synteza peptydów wspomagana ultradźwiękami pozwala uzyskać zoptymalizowaną wydajność peptydów o wysokiej czystości, bez racemizacji i przy krótkim czasie reakcji.
- Wysoka wydajność otrzymywania peptydów
- Znacznie szybsza synteza
- Wyższa czystość peptydów
- Brak racemizacji
- Równoległa synteza różnych peptydów
- Możliwość skalowania do dowolnej objętości
Ultradźwiękowa sonotroda kielichowa do równomiernej sonikacji kilku naczyń reakcyjnych w celu usprawnienia syntezy peptydów.
Ilustracja przedstawiająca syntezę peptydów w fazie stałej metodą Merrifielda. Sonikacja służy do wspomagania i intensyfikacji reakcji syntezy, a także do odszczepiania zsyntetyzowanych peptydów od żywicy.
Ilustracja: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Badanie | Badane peptydy | Czas reakcji (metoda klasyczna a US-SPPS) | Czystość produktu surowego (metoda klasyczna a US-SPPS) | Racemizacja i reakcje uboczne | Najważniejsze wnioski |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkefalina, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfina | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Nie zaobserwowano dla Cys/His, nawet przy 70°C | ~7–12x szybsza synteza; znaczna poprawa czystości, szczególnie w przypadku sekwencji podatnych na agregację, takich jak TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (tylko US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Nie badano; odnotowano niewielki spadek czystości Pep2 | 14-krotne skrócenie czasu dla Pep1; znaczny wzrost wydajności otrzymywania produktów surowych. |
| Merlino et al. (2019) | Modelowe pentapeptydy, peptydy o długości do 44 reszt aminokwasowych, „trudne sekwencje” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (model) | 84% → 93% (model); znacznie wyższa niż przy ogrzewaniu termicznym (~45°C) | Brak istotnego wzrostu udziału enancjomerów Cys/His | Wysoka skuteczność w przypadku trudnych sekwencji i sekwencji podatnych na agregację; umożliwia zmniejszenie nadmiaru odczynników przy zachowaniu wysokiej czystości. |
Synteza peptydów w fazie stałej usprawniona dzięki ultradźwiękom
Synteza peptydów w fazie stałej (SPPS) jest reakcją chemiczną umożliwiającą budowę łańcucha peptydowego poprzez kolejne reakcje pochodnych aminokwasów na nierozpuszczalnym, porowatym nośniku. Tradycyjna synteza peptydów w fazie stałej jest jednak procesem stosunkowo mało wydajnym i powolnym. Dlatego ultradźwiękowa intensyfikacja syntezy peptydów jest wysoko cenionym narzędziem umożliwiającym skuteczniejszą i szybszą syntezę peptydów.
Silva et al. (2021) porównali „klasyczną” syntezę peptydów w fazie stałej (SPPS) z zastosowaniem grupy fluorenylometoksykarbonylowej (Fmoc) z SPPS wspomaganą ultradźwiękami (US), przygotowując trzy peptydy: Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), swoisty wobec receptora czynnika wzrostu fibroblastów 3(FGFR3), oraz nowe peptydy Pep2 (RQMATADEA-NH2) i Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS wspomagana US doprowadziła do 14-krotnego (Pep1) i 4-krotnego (Pep2) skrócenia czasu budowy peptydów w porównaniu z metodą „klasyczną”. Co ciekawe, SPPS wspomagana ultradźwiękami pozwoliła uzyskać Pep1 o wyższej czystości (82%) niż „klasyczna” SPPS (73%). Znaczne skrócenie czasu w połączeniu z uzyskaną wysoką czystością surowych peptydów skłoniło zespół badawczy do zastosowania SPPS wspomaganej US do dużego peptydu Pep3, zawierającego wiele hydrofobowych aminokwasów i sekwencji homooligomerycznych. Co godne uwagi, syntezę tego 25-merowego peptydu przeprowadzono w czasie krótszym niż 6 godzin (347 min), uzyskując umiarkowaną czystość (około 49%).
Szybsza synteza peptydów w fazie stałej z zastosowaniem mieszania ultradźwiękowego.
(Badanie i analiza: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) przeprowadzili również kompleksowe badanie wpływu ultradźwięków na syntezę peptydów w fazie stałej z zastosowaniem Fmoc, która umożliwiła syntezę różnych biologicznie aktywnych peptydów (o długości do 44 reszt aminokwasowych), przy znacznej oszczędności materiałów i czasu reakcji. Wykazali, że sonikacja nie nasilała głównych reakcji ubocznych i usprawniała syntezę peptydów o „trudnych sekwencjach”, co plasuje syntezę peptydów w fazie stałej wspomaganą ultradźwiękami (US-SPPS) wśród obecnych wysoce wydajnych strategii syntezy peptydów.
Dostępność wysokowydajnych systemów do ultradźwiękowej syntezy peptydów (z zastosowaniem sonikacji) pozwala znacznie zwiększyć szybkość syntezy i czystość produktów surowych. (por. Wołczański et al., 2019)
Badanie racemizacji. Porównanie istotnych widm 1H NMR modelowych peptydów syntetyzowanych ręcznie metodą klasyczną w temperaturze pokojowej z peptydami syntetyzowanymi metodą ultradźwiękową w podwyższonej temperaturze. Przesunięcia chemiczne protonów α His i Cys oraz grupy metylenowej Acm (lewe panele), a także protonów grupy ɣ-metylowej Val (prawe panele) pokazują, że sonikacja w 70°C nie powoduje racemizacji.
(Badanie i analiza: Wołczański et al., 2019)
Ultradźwiękowe odszczepianie peptydów
Po syntezie peptydów w fazie stałej (SPPS) zsyntetyzowane peptydy muszą zostać odszczepione od żywic polimerowych. Ten etap jest również znany jako usuwanie grup ochronnych. Porównanie zwykłego wytrząsania i sonikacji przy odszczepianiu peptydów od żywicy pokazuje, że metoda wytrząsania wymaga około 1 godziny, natomiast odszczepianie ultradźwiękowe można przeprowadzić w ciągu 15 do 20 min. Ultradźwiękowe odszczepianie peptydów można stosować do odszczepiania chronionych aminokwasów i peptydów związanych z żywicami polistyrenowymi poprzez benzylowe wiązania estrowe.
Ultradźwiękowe odszczepianie peptydów od żywicy polistyrenowej zapewnia wysoką wydajność otrzymywania peptydów o wysokiej czystości, bez racemizacji, w ramach szybkiej procedury.
(badanie i ilustracja: ©Anuradha and Ravindranath, 1995)
Reaktor mieszany ultradźwiękowo do usprawnionej i przyspieszonej syntezy peptydów. Na zdjęciu przedstawiono sonikator UP200St w szklanym reaktorze z mieszaniem.
Wysokowydajne sonikatory do syntezy peptydów
Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania ultradźwiękowe do sonikacji bezpośredniej i pośredniej. Wydajne procesory ultradźwiękowe z możliwością precyzyjnego sterowania dostarczają do naczynia reakcyjnego dokładnie odpowiednią ilość energii ultradźwiękowej. Niezależnie od tego, czy jako naczynia do syntezy stosujesz strzykawki, probówki, płytki wielodołkowe czy reaktory szklane, Hielscher Ultrasonics oferuje najbardziej odpowiedni sonikator do Twojego zastosowania związanego z peptydami.
- syntezy peptydów na zamówienie
- produkcji peptydów na dużą skalę
- tworzenia bibliotek peptydów
Wiele syntez peptydów przeprowadza się w strzykawkach (np. w reaktorach strzykawkowych z fritą). Ultradźwiękowe urządzenie Hielscher do mieszania w strzykawkach poddaje roztwór peptydu sonikacji, sprzęgając fale ultradźwiękowe z cieczą przez ściankę strzykawki. Ultradźwiękowe urządzenie do mieszania w strzykawkach jest jednym z najpopularniejszych rozwiązań ultradźwiękowych do syntezy peptydów wspomaganej ultradźwiękami.
Ultradźwiękowa sonotroda kielichowa jest odpowiednim narzędziem do sonikacji do 5 naczyń reakcyjnych, natomiast VialTweeter może pomieścić do dziesięciu probówek reakcyjnych oraz dodatkowo pięć większych naczyń przy użyciu akcesorium zaciskowego.
W przypadku innych typów reaktorów, takich jak reaktory Merrifielda lub Kamysza do syntezy w fazie stałej oraz inne naczynia i reaktory z polipropylenu lub szkła borokrzemowego, Hielscher oferuje sonikatory do sonikacji pośredniej i bezpośredniej z dostosowanym mocowaniem zaciskowym lub kołnierzem.
Oczywiście większe reaktory szklane z mieszaniem, np. do syntezy w fazie roztworowej, można łatwo wyposażyć w sondy ultradźwiękowe (znane również jako sonotrody) dowolnej wielkości.
- różne typy sonikatorów
- sonikacja bezpośrednia i pośrednia
- precyzyjna kontrola intensywności
- precyzyjna kontrola temperatury
- ultradźwięki ciągłe lub impulsowe
- inteligentne funkcje, programowalne urządzenia
- dostępność dla dowolnej objętości
- liniowa skalowalność
UIP400MTP jest idealnym urządzeniem do syntezy peptydów w fazie stałej na płytkach wielodołkowych lub mikrotitracyjnych. Kawitacja ultradźwiękowa jest sprzęgana pośrednio i równomiernie z zawartością licznych dołków z próbkami, zapewniając doskonały transport masy i przebieg reakcji syntezy. Obejrzyj poniższy film, aby zobaczyć sonikator do mikropłytek UIP400MTP w działaniu!
Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!
Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe do mieszania, dyspergowania, emulgowania i ekstrakcji w skali laboratoryjnej, pilotażowej i przemysłowej.
Co warto wiedzieć o ultradźwiękowej syntezie peptydów
Czym są peptydy?
Peptydy to związki, w których wiele aminokwasów jest połączonych wiązaniami amidowymi, zwanymi wiązaniami peptydowymi. Gdy tworzą złożone struktury – zazwyczaj składające się z 50 lub więcej aminokwasów – te duże struktury peptydowe określa się mianem białek. Peptydy są niezbędnym budulcem życia i pełnią liczne funkcje w organizmie.
Jak przebiega synteza peptydów?
W chemii organicznej, biologii molekularnej i naukach o życiu synteza peptydów jest procesem wytwarzania peptydów. Peptydy syntetyzuje się chemicznie w reakcji kondensacji grupy karboksylowej jednego aminokwasu z grupą aminową innego aminokwasu. Zwykle stosuje się strategie wykorzystujące grupy ochronne (zwane również grupami zabezpieczającymi), aby uniknąć niepożądanych reakcji ubocznych z różnymi łańcuchami bocznymi aminokwasów.
Chemiczna synteza peptydów (in vitro) najczęściej rozpoczyna się od sprzęgania grupy karboksylowej dołączanego aminokwasu (koniec C) z końcem N rosnącego łańcucha peptydowego. W przeciwieństwie do tej syntezy przebiegającej od C do N, naturalna biosynteza białek złożonych z długich łańcuchów peptydowych w organizmach żywych zachodzi w przeciwnym kierunku. Oznacza to, że w biosyntezie koniec N dołączanego aminokwasu łączy się z końcem C łańcucha białkowego (od N do C).
Większość protokołów badawczo-rozwojowych dotyczących syntezy peptydów opiera się na metodach w fazie stałej, natomiast metody syntezy w fazie roztworowej stosuje się w przemysłowej produkcji peptydów na dużą skalę.
Jaki jest obecny stan wiedzy i techniki w zakresie syntezy peptydów?
SUS-SPPS (zrównoważona SPPS wspomagana ultradźwiękami) pozwala, jak wykazano, ograniczyć proces do zaledwie dwóch etapów na cykl (połączone sprzęganie/blokowanie nieprzereagowanych grup/usuwanie grup ochronnych + pojedyncze płukanie), znacznie zmniejszając zużycie rozpuszczalników i skracając czas. (por. Mottola et al., 2025)
TAPS wspomagana ultradźwiękami jest rozwijającym się połączeniem metod, którego skuteczność wykazano w syntezach całkowitych (np. lipobactin), i jest badana przez organizacje zajmujące się rozwojem i produkcją na zlecenie (CDMO) pod kątem wytwarzania aktywnych substancji farmaceutycznych (API).
Poznaj zalety syntezy peptydów z zastosowaniem znaczników (TAGGING), wspomaganej ultradźwiękami!
Przetwarzanie ciągłe jest badane jako dalsze usprawnienie – opisano platformy ciągłej syntezy typu one-pot wspomaganej sililowanymi znacznikami.
Dziedzina ta zmierza w kierunku zasad zielonej chemii, a zarówno ultradźwięki, jak i TAPS przyczyniają się do ograniczenia zużycia rozpuszczalników, zmniejszenia ilości stosowanych odczynników i poprawy zrównoważonego charakteru procesów.
Literatura / Źródła
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe o wielkości od laboratoryjnej do przemysłowej.