Liza komórek BL21 za pomocą ultradźwięków

Komórki BL21 to szczep E. coli szeroko stosowany w laboratoriach badawczych, biotechnologii i produkcji przemysłowej ze względu na zdolność do wysoce wydajnej ekspresji białek. Ultradźwiękowe rozbijanie komórek, liza i ekstrakcja białek to powszechnie stosowana metoda izolowania i pozyskiwania docelowych białek z wnętrza komórek BL21. Ultradźwięki całkowicie rozbijają komórkę i uwalniają wszystkie uwięzione w niej białka, udostępniając 100% białka.

Komórki BL21 do ekspresji białek

BL21 to chemicznie kompetentny szczep bakterii E. coli odpowiedni do transformacji i ekspresji białek na wysokim poziomie z wykorzystaniem układu indukcji opartego na polimerazie RNA T7 i IPTG. Komórki BL21 umożliwiają wysoce wydajną ekspresję białka z dowolnego genu znajdującego się pod kontrolą promotora T7. Szczep E. coli BL21(DE3) jest szczepem do produkcji białek opartej na polimerazie RNA T7, stosowanym w połączeniu z wektorami ekspresyjnymi opartymi na promotorze T7, i jest szeroko wykorzystywany w laboratoriach oraz przemyśle do produkcji białek rekombinowanych. W BL21(DE3) ekspresja genu kodującego białko rekombinowane jest transkrybowana przez kodowaną chromosomalnie polimerazę RNA T7 (T7 RNAP), która transkrybuje osiem razy szybciej niż konwencjonalna RNAP E. coli. Dzięki temu szczep BL21(DE3) jest wysoce wydajny i stanowi jeden z najbardziej preferowanych komórkowych systemów ekspresji białek.

Protokół ultradźwiękowej lizy i ekstrakcji białek z komórek BL21

Lizę komórek BL21 przeprowadza się najczęściej za pomocą ultradźwięków w połączeniu z lauroilosarkozynianem sodu (znanym również jako sarkozyl) jako buforem do lizy. Zaletami ultradźwiękowego rozbijania komórek i ekstrakcji białek są niezawodność, powtarzalność oraz prosta, bezpieczna i szybka obsługa sonikatorów. Poniższy protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące ultradźwiękowej lizy komórek BL21:

• W celu usunięcia białek opiekuńczych osady bakterii BL21 ponownie zawieszono w 50 ml lodowato zimnego buforu Sodium Tris-EDTA (STE) (zawierającego 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl z dodatkiem 100 mM PMSF).
• Następnie dodaje się 500 ul lizozymu (10 mg/ ml) i inkubuje komórki na lodzie przez 15 min.
• Następnie dodaje się 500 ul DTT i 7 ml sarkozylu (10% (w/v) przygotowanego w buforze STE).
• Konieczne jest utrzymywanie wszystkich buforów do oczyszczania w lodowato zimnym stanie oraz przechowywanie próbek na lodzie przez cały czas. W miarę możliwości wszystkie etapy oczyszczania należy przeprowadzać w chłodni.



• W celu ultradźwiękowej lizy i ekstrakcji białek próbki poddaje się sonikacji w urządzeniu VialTweeter – sonikatorze do wielu próbek przez 4 x 30 sec przy amplitudzie 100%, z przerwą 2 min między kolejnymi sonikacjami. Alternatywnie można zastosować homogenizator ultradźwiękowy z sondą i mikrokońcówką, np. UP200Ht z S26d2 (3 x 30 sec, przerwa 2 min. między cyklami ultradźwiękowymi, amplituda 80%).
• Na potrzeby dalszych etapów oczyszczania próbki muszą być przechowywane na lodzie lub alternatywnie w temperaturze -80°C do czasu dalszego przetwarzania.

Liza ultradźwiękowa przy precyzyjnej kontroli temperatury

Precyzyjna i niezawodna kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie podczas pracy z próbkami biologicznymi. Wysokie temperatury inicjują termiczną degradację białek w próbkach.
Podobnie jak wszystkie mechaniczne techniki przygotowania próbek, sonikacja wytwarza ciepło. Jednak podczas korzystania z VialTweeter można skutecznie kontrolować temperaturę próbek. Przedstawiamy różne możliwości monitorowania i kontrolowania temperatury próbek podczas przygotowywania ich do analizy za pomocą VialTweeter i VialPress.

1. Monitorowanie temperatury próbki: Procesor ultradźwiękowy UP200St, który napędza VialTweeter, jest wyposażony w inteligentne oprogramowanie i podłączany czujnik temperatury. Podłącz czujnik temperatury do UP200St i umieść jego końcówkę w jednej z probówek z próbkami. Za pomocą cyfrowego kolorowego wyświetlacza dotykowego można ustawić w menu UP200St określony zakres temperatury dla sonikacji próbek. Sonikator automatycznie zatrzyma się po osiągnięciu maksymalnej temperatury i pozostanie w stanie wstrzymania, aż temperatura próbki spadnie do dolnej wartości ustawionej temperatury ∆. Następnie sonikacja zostanie automatycznie wznowiona. Ta inteligentna funkcja zapobiega degradacji wywołanej ciepłem.
2. Blok VialTweeter można wstępnie schłodzić. Umieść blok VialTweeter (wyłącznie sonotrodę bez przetwornika!) w lodówce lub zamrażarce, aby wstępnie schłodzić blok tytanowy, co pomaga opóźnić wzrost temperatury w próbce. Jeśli to możliwe, można również wstępnie schłodzić samą próbkę.
3. Użyj suchego lodu do chłodzenia podczas sonikacji. Użyj płytkiej tacy wypełnionej suchym lodem i umieść VialTweeter na lodzie, aby ciepło mogło szybko się rozpraszać.

Klienci na całym świecie używają VialTweeter i VialPress w codziennej pracy związanej z przygotowaniem próbek w laboratoriach biologicznych, biochemicznych, medycznych i klinicznych. Dzięki inteligentnemu oprogramowaniu i kontroli temperatury procesora UP200St temperatura jest niezawodnie kontrolowana, a degradacja próbek wywołana ciepłem jest eliminowana. Ultradźwiękowe przygotowanie próbek za pomocą VialTweeter i VialPress zapewnia wysoce wiarygodne i powtarzalne wyniki!
 

Znajdź optymalne ultradźwiękowe urządzenie do rozbijania komórek do swojego zastosowania w lizie

Hielscher Ultrasonics jest producentem o wieloletnim doświadczeniu w dziedzinie wysokowydajnych ultradźwiękowych urządzeń do rozbijania komórek i homogenizatorów do zastosowań laboratoryjnych, systemów stołowych oraz systemów w skali przemysłowej. Wielkość hodowli komórek bakteryjnych, cel badań lub produkcji oraz objętość komórek do przetworzenia na godzinę lub dzień to kluczowe czynniki przy wyborze odpowiedniego ultradźwiękowego urządzenia do rozbijania komórek do danego zastosowania.
Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania do jednoczesnej sonikacji wielu próbek (do 10 fiolek za pomocą VialTweeter) i masowego przetwarzania próbek (tj. płytek mikrotitracyjnych / płytek ELISA za pomocą UIP400MTP), a także klasyczne laboratoryjne sonikatory z sondą o różnych poziomach mocy od 50 do 400 watów oraz w pełni przemysłowe procesory ultradźwiękowe o mocy do 16 000 watów na urządzenie do komercyjnego rozbijania komórek i ekstrakcji białek w produkcji na dużą skalę. Wszystkie sonikatory Hielscher są skonstruowane do pracy 24/7/365 przy pełnym obciążeniu. Wytrzymałość i niezawodność to podstawowe cechy naszych urządzeń ultradźwiękowych.
Wszystkie cyfrowe homogenizatory ultradźwiękowe są wyposażone w inteligentne oprogramowanie, kolorowy wyświetlacz dotykowy i automatyczne rejestrowanie danych, dzięki czemu urządzenie ultradźwiękowe jest wygodnym narzędziem pracy w laboratoriach i zakładach produkcyjnych.
Poinformuj nas, jaki rodzaj komórek, jaką objętość, z jaką częstotliwością i w jakim celu musisz przetwarzać w swoich próbkach biologicznych. Polecimy ultradźwiękowe urządzenie do rozbijania komórek najlepiej dopasowane do wymagań Twojego procesu.

Poniższa tabela przedstawia orientacyjną wydajność przetwarzania naszych systemów ultradźwiękowych – od kompaktowych homogenizatorów ręcznych i sonikatorów do wielu próbek po przemysłowe procesory ultradźwiękowe do zastosowań komercyjnych:

Literatura / Źródła

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.