Liza komórek BL21 za pomocą ultradźwięków
Komórki BL21 są szczepem E. coli, który jest szeroko stosowany w laboratoriach badawczych, biotechnologii i produkcji przemysłowej ze względu na ich zdolność do wysoce wydajnej ekspresji białek. Ultradźwiękowe rozbijanie komórek, liza i ekstrakcja białek jest powszechną metodą izolowania i zbierania docelowych białek z wnętrza komórek BL21. Ultradźwięki całkowicie rozbijają komórkę i uwalniają wszystkie uwięzione białka, dzięki czemu 100% białka jest dostępne.
Komórki BL21 do ekspresji białek
Komórka BL21 jest chemicznie kompetentnym szczepem bakteryjnym E. coli odpowiednim do transformacji i ekspresji białek na wysokim poziomie przy użyciu systemu indukcji polimerazy RNA T7-IPTG. Komórki BL21 umożliwiają wysokowydajną ekspresję białek dowolnego genu znajdującego się pod kontrolą promotora T7. Szczep E. coli BL21(DE3) jest szczepem do produkcji białek opartym na polimerazie T7 RNA w połączeniu z wektorami ekspresyjnymi opartymi na promotorze T7 i jest szeroko stosowany w laboratoriach i przemyśle do produkcji białek rekombinowanych. W BL21(DE3) ekspresja genu kodującego rekombinowane białko jest transkrybowana przez chromosomalnie zakodowaną polimerazę RNA T7 (T7 RNAP), która transkrybuje osiem razy szybciej niż konwencjonalna RNAP E. coli. Sprawia to, że szczep BL21(DE3) jest wysoce wydajny i staje się jednym z najbardziej preferowanych systemów komórkowych do ekspresji białek.
Protokół lizy ultradźwiękowej i ekstrakcji białek z komórek BL21
Liza komórek BL21 jest najczęściej przeprowadzana przy użyciu ultradźwięków w połączeniu z lauroilosarkozynianem sodu (znanym również jako sarkosyl) jako buforem lizującym. Zalety ultradźwiękowego rozbijania komórek i ekstrakcji białek polegają na niezawodności, powtarzalności, a także prostej, bezpiecznej i szybkiej obsłudze ultrasonografów. Poniższy protokół podaje krok po kroku kierunek ultradźwiękowej lizy komórek BL21:
- W celu usunięcia białek chaperonowych, osady bakterii BL21 zawieszono ponownie w 50 ml zimnego buforu Sodium Tris-EDTA (STE) (składającego się z 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl uzupełnionego 100 mM PMSF).
- Następnie dodaje się 500 ul lizozymu (10 mg/ml) i inkubuje komórki na lodzie przez 15 minut.
- Następnie dodaje się 500 ul DTT i 7 ml sarkozylu (10% (w/v) w buforze STE).
- Ważne jest, aby wszystkie bufory do oczyszczania były lodowato zimne, a próbki cały czas znajdowały się w lodzie. Wszystkie etapy oczyszczania powinny być przeprowadzane w chłodni, jeśli to możliwe.
- W przypadku lizy ultradźwiękowej i ekstrakcji białek, próbki są poddawane działaniu ultradźwięków w VialTweeter MultiSample Ultrasonicator przez 4 x 30 s przy 100% amplitudzie z 2-minutową przerwą między każdą sonikacją. Alternatywnie, homogenizator ultradźwiękowy typu sondy z mikro-końcówką np, UP200Ht z S26d2 (3 x 30 s, 2 min. przerwy między cyklami ultradźwiękowymi, 80% amplitudy).
- Do dalszych etapów oczyszczania próbki muszą być przechowywane w lodzie lub alternatywnie w temperaturze -80°C do czasu dalszego przetwarzania.
Ultradźwiękowy przerywacz komórek UP200St z mikrokońcówką S26d2 do lizy i ekstrakcji białek
Liza ultradźwiękowa pod precyzyjną kontrolą temperatury
Precyzyjna i niezawodna kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie podczas pracy z próbkami biologicznymi. Wysokie temperatury inicjują indukowaną termicznie degradację białek w próbkach.
Podobnie jak wszystkie mechaniczne techniki przygotowania próbek, sonikacja wytwarza ciepło. Jednak temperatura próbek może być dobrze kontrolowana podczas korzystania z VialTweeter. Przedstawiamy różne opcje monitorowania i kontrolowania temperatury próbek podczas przygotowywania ich do analizy za pomocą VialTweeter i VialPress.
- Monitorowanie temperatury próbki: Procesor ultradźwiękowy UP200St, który napędza VialTweeter, jest wyposażony w inteligentne oprogramowanie i podłączany czujnik temperatury. Podłącz czujnik temperatury do UP200St i włóż końcówkę czujnika temperatury do jednej z próbówek. Za pomocą cyfrowego kolorowego wyświetlacza dotykowego można ustawić w menu UP200St określony zakres temperatur dla sonikacji próbki. Ultradźwięk automatycznie zatrzyma się po osiągnięciu maksymalnej temperatury i zatrzyma się, aż temperatura próbki spadnie do niższej wartości ustawionej temperatury ∆. Następnie sonikacja rozpocznie się automatycznie ponownie. Ta inteligentna funkcja zapobiega degradacji spowodowanej ciepłem.
- Blok VialTweeter może być wstępnie schłodzony. Umieszczenie bloku VialTweeter (tylko sonotrody bez przetwornika!) w lodówce lub zamrażarce w celu wstępnego schłodzenia bloku tytanowego pomaga opóźnić wzrost temperatury próbki. Jeśli to możliwe, sama próbka może być również wstępnie schłodzona.
- Do chłodzenia podczas sonikacji należy używać suchego lodu. Użyj płytkiej tacy wypełnionej suchym lodem i umieść VialTweeter na lodzie, aby ciepło mogło szybko się rozproszyć.
Klienci na całym świecie używają VialTweeter i VialPress do codziennego przygotowywania próbek w laboratoriach biologicznych, biochemicznych, medycznych i klinicznych. Inteligentne oprogramowanie i kontrola temperatury procesora UP200St, temperatura jest niezawodnie kontrolowana i unika się degradacji próbki spowodowanej ciepłem. Ultradźwiękowe przygotowanie próbek za pomocą VialTweeter i VialPress zapewnia wysoce wiarygodne i powtarzalne wyniki!
Znajdź optymalny zakłócacz ultradźwiękowy do zastosowań związanych z lizą
Hielscher Ultrasonics jest długoletnim doświadczonym producentem wysokowydajnych ultradźwiękowych rozbijaczy komórek i homogenizatorów dla laboratoriów, systemów stołowych i przemysłowych. Wielkość hodowli komórek bakteryjnych, cel badawczy lub produkcyjny oraz ilość komórek do przetworzenia w ciągu godziny lub dnia są podstawowymi czynnikami umożliwiającymi znalezienie odpowiedniego ultradźwiękowego rozbijacza komórek do danego zastosowania.
Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania do jednoczesnej sonikacji wielu próbek (do 10 fiolek z VialTweeter) i próbek masowych (tj. płytek mikrotitracyjnych / płytek ELISA z UIP400MTP), a także klasyczny ultrasonograf laboratoryjny typu sondowego o różnych poziomach mocy od 50 do 400 watów do w pełni przemysłowych procesorów ultradźwiękowych o mocy do 16 000 watów na jednostkę do komercyjnego rozbijania komórek i ekstrakcji białek w dużej produkcji. Wszystkie ultradźwięki Hielscher są zbudowane do pracy 24/7/365 pod pełnym obciążeniem. Solidność i niezawodność to podstawowe cechy naszych urządzeń ultradźwiękowych.
Wszystkie cyfrowe homogenizatory ultradźwiękowe są wyposażone w inteligentne oprogramowanie, kolorowy wyświetlacz dotykowy i automatyczne protokołowanie danych, które sprawiają, że urządzenie ultradźwiękowe jest wygodnym narzędziem pracy w laboratorium i zakładach produkcyjnych.
Daj nam znać, jaki rodzaj komórek, jaka objętość, z jaką częstotliwością i z jakim celem musisz przetworzyć swoje próbki biologiczne. Polecimy Ci najbardziej odpowiedni ultradźwiękowy rozbijacz komórek dla Twoich wymagań procesowych.
Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych systemów ultradźwiękowych, od kompaktowych ręcznych homogenizatorów i ultradźwięków MultiSample po przemysłowe procesory ultradźwiękowe do zastosowań komercyjnych:
| Wielkość partii | natężenie przepływu | Polecane urządzenia |
|---|---|---|
| Płytki 96-dołkowe / mikrotitracyjne | b.d. | UIP400MTP |
| 10 fiolek o pojemności od 0,5 do 1,5 ml | b.d. | VialTweeter na UP200St |
| 0.01 do 250 ml | 5 do 100 ml/min | UP50H |
| 0.01 do 500 ml | 10-200mL/min | UP100H |
| 10 do 2000mL | 20-400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 do 20L | 0.2 do 4L/min | UIP2000hdT |
| 10-100L | 2 do 10L/min | UIP4000hdT |
| b.d. | 10-100L/min | UIP16000 |
| b.d. | większe | klaster UIP16000 |
Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!
Sonikator płytowy UIP400MTP do wysokowydajnego niszczenia komórek w 96-dołkowych płytkach
ultrasonicator UP200Ht z 2 mm mikrotipem S26d2 do sonikacji małych próbek
Dowiedz się więcej o tym, jak możesz wykorzystać ultradźwiękowy homogenizator tkanek do wydajnego i niezawodnego przygotowywania roztworów buforowych!
Fakty, które warto znać
Bakterie Escherichia Coli
Escherichia coli to rodzaj bakterii, które nie tworzą przetrwalników, są Gram-ujemne i charakteryzują się formą prostej pałeczki. Bakterie E. coli są obecne w środowisku, żywności i jelitach ludzi i zwierząt. Bakterie E. coli są zwykle ruchliwe dzięki wykorzystaniu wici perytrichowych, ale istnieją również typy niemotylne. E. coli to tak zwane fakultatywnie beztlenowe organizmy chemoorganotroficzne, co oznacza, że są one zdolne zarówno do metabolizmu oddechowego, jak i fermentacyjnego. Większość typów bakterii E. coli jest łagodna i pełni użyteczne funkcje w organizmie, np. hamuje wzrost szkodliwych gatunków bakterii, syntetyzuje witaminy itp.
Komórki bakterii Escherichia coli tak zwanego typu B są specjalną kategorią szczepów E.coli, które są szeroko stosowane w badaniach nad mechanizmami takimi jak wrażliwość na bakteriofagi lub systemy modyfikacji restrykcyjnej. Ponadto, bakterie E. coli są cenione jako niezawodny koń roboczy do ekspresji białek w laboratoriach biotechnologicznych i life science. Przykładowo, bakterie E. coli są wykorzystywane do syntezy związków takich jak białka i oligosacharydy na skalę przemysłową. Ze względu na specyficzne cechy, takie jak niedobór proteaz, niska produkcja octanu przy wysokim poziomie glukozy i zwiększona przepuszczalność, komórki E. coli B są najczęściej wykorzystywanymi komórkami gospodarza do produkcji genetycznie modyfikowanych białek.
Białko rekombinowane
Białka rekombinowane (rProt) zyskują na znaczeniu w wielu branżach, w tym w produkcji chemicznej, farmaceutycznej, kosmetycznej, medycynie ludzkiej i zwierzęcej, rolnictwie, przemyśle spożywczym, a także w przetwarzaniu odpadów.
Produkcja rekombinowanego białka wymaga użycia systemu ekspresji. Jako systemy komórek ekspresyjnych do produkcji rekombinowanego DNA można stosować zarówno komórki prokariotyczne, jak i eukariotyczne. Podczas gdy komórki bakteryjne są najczęściej wykorzystywane do ekspresji białek ze względu na takie czynniki, jak niski koszt, łatwa skalowalność i proste warunki pożywki, ssaki, drożdże, algi, owady i systemy bezkomórkowe są uznanymi alternatywami. Rodzaj białka, aktywność funkcjonalna, a także wymagana wydajność wyrażonego białka wpływają na wybór systemu komórkowego stosowanego do ekspresji białek.
W celu ekspresji rekombinowanego białka, konkretna komórka musi zostać transfekowana wektorem DNA zawierającym matrycę rekombinowanego DNA. Komórki transfekowane matrycą są następnie hodowane. W wyniku mechanizmu komórkowego, komórki transkrybują i tłumaczą interesujące je białko, wytwarzając w ten sposób docelowe białko.
Ponieważ wyrażone białka są uwięzione w macierzy komórkowej, komórka musi zostać poddana lizie (przerwaniu i rozbiciu) w celu uwolnienia białek. W kolejnym etapie oczyszczania białko jest oddzielane i oczyszczane.
Pierwszym rekombinowanym białkiem zastosowanym w leczeniu była rekombinowana ludzka insulina w 1982 roku. Obecnie na całym świecie produkuje się ponad 170 rodzajów białek rekombinowanych do celów medycznych. Powszechnie stosowanymi białkami rekombinowanymi w medycynie są na przykład rekombinowane hormony, interferony, interleukiny, czynniki wzrostu, czynniki martwicy nowotworów, czynniki krzepnięcia krwi, leki trombolityczne i enzymy stosowane w leczeniu poważnych chorób, takich jak cukrzyca, karłowatość, zawał mięśnia sercowego, zastoinowa niewydolność serca, udar mózgu, stwardnienie rozsiane, neutropenia, trombocytopenia, niedokrwistość, zapalenie wątroby, reumatoidalne zapalenie stawów, astma, choroba Leśniowskiego-Crohna i terapie nowotworowe. (por. Phuc V. Pham, w Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatura / Referencje
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Sonikator VialTweeter do jednoczesnej sonikacji 10 próbek, np. w celu rozbicia komórek BL21
Ultradźwięki o wysokiej wydajności! Asortyment produktów firmy Hielscher obejmuje pełne spektrum, od kompaktowych ultradźwiękowych urządzeń laboratoryjnych, przez urządzenia stołowe, po w pełni przemysłowe systemy ultradźwiękowe.