Ultradźwiękowa fragmentacja DNA dla sekwencjonowania nowej generacji

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) wymaga niezawodnego ścinania i fragmentacji genomowego DNA w celu sekwencjonowania genomowych nici DNA i tworzenia bibliotek genomowych. Kontrolowana fragmentacja DNA na fragmenty DNA jest niezbędnym etapem przygotowania próbki wymaganym przed sekwencjonowaniem DNA. Ultradźwięki okazały się skuteczną i niezawodną techniką fragmentacji DNA o określonej długości. Ultradźwiękowe protokoły fragmentacji DNA osiągają powtarzalne wyniki fragmentacji. Ultradźwięki firmy Hielscher są w stanie wytworzyć szeroki zakres rozkładów wielkości fragmentów genomowego DNA, precyzyjnie kontrolowanych za pomocą parametrów roboczych. Ponieważ ultradźwiękowe systemy ścinania DNA firmy Hielscher są dostępne dla pojedynczych i wielu fiolek, a także dla mikropłytek, przygotowanie próbek staje się bardzo wydajne.

Sekwencjonowanie nowej generacji: Ultradźwiękowa fragmentacja DNA w celu przygotowania biblioteki

Aby przeprowadzić sekwencjonowanie nowej generacji, należy wykonać trzy podstawowe etapy: (1) przygotowanie biblioteki, (2) sekwencjonowanie i (3) analizę danych. Podczas przygotowywania biblioteki DNA jest fragmentowane, a następnie końce fragmentów są naprawiane (polerowane) przez dodanie pojedynczej zasady adeninowej, a docelowe fragmenty są przekształcane w dwuniciowe DNA. Na koniec dołączane są tak zwane adaptery poprzez ligację, PCR lub tagowanie, dzięki czemu końcowy produkt DNA biblioteki może być oznaczony ilościowo do sekwencjonowania.
Fragmentacja DNA przy użyciu sonikacji: Zwłaszcza w przypadku technologii sekwencjonowania z krótkim odczytem, takich jak Illumina, które nie są w stanie łatwo odczytać dłuższych fragmentów DNA, podstawki DNA muszą zostać pofragmentowane do określonego rozmiaru, który można osiągnąć niezawodnie za pomocą ultradźwięków.
Ultradźwięki mogą być niezawodnie stosowane do fragmentacji DNA, RNA i chromatyny.

Sekwencjonowanie nowej generacji – przygotowanie biblioteki

Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest powszechnie stosowana w przygotowywaniu bibliotek sekwencjonowania DNA dla platform sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Technika ta jest wykorzystywana do rozbijania cząsteczek DNA na mniejsze fragmenty o pożądanym zakresie wielkości, co ułatwia kolejne etapy przygotowania biblioteki. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest zwykle wymagana na etapie przygotowywania biblioteki przepływów pracy NGS w celu fragmentacji genomowego DNA na mniejsze fragmenty odpowiednie do dalszego przetwarzania i sekwencjonowania. Odgrywa kluczową rolę w zapewnieniu sukcesu eksperymentu sekwencjonowania poprzez generowanie fragmentów DNA o odpowiednim zakresie wielkości dla konkretnej używanej platformy sekwencjonowania.

Sekwencjonowanie nowej generacji – Etapy procesu:

• Ultradźwiękowa fragmentacja DNA: Przed budową biblioteki genomowe DNA jest fragmentowane na mniejsze, łatwiejsze do zarządzania kawałki. Fragmentacja ultradźwiękowa polega na wykorzystaniu fal dźwiękowych o wysokiej częstotliwości do ścinania cząsteczek DNA na fragmenty o pożądanym zakresie wielkości. Krok ten ma kluczowe znaczenie, ponieważ pomaga zapewnić, że wygenerowane później odczyty sekwencjonowania będą miały odpowiednią długość dla używanej platformy sekwencjonowania. Zakres wielkości fragmentów można dostosować w oparciu o konkretne wymagania eksperymentu sekwencjonowania.
• Amplifikacja klonalna metodą PCR: Po fragmentacji ultradźwiękowej, fragmenty DNA poddawane są naprawie końcowej, ligacji adaptera i amplifikacji PCR w celu wygenerowania ostatecznych bibliotek sekwencjonowania DNA. Etapy te przygotowują pofragmentowane cząsteczki DNA do procesu sekwencjonowania poprzez dodanie sekwencji adaptera niezbędnych do wiązania z platformą sekwencjonowania i zapewnienie miejsc starterowych do amplifikacji PCR.
• Sekwencjonowanie DNA przez syntezę: Po przygotowaniu bibliotek sekwencjonowania rozpoczyna się proces sekwencjonowania DNA przez syntezę (SBS). Podczas SBS sekwencja DNA jest określana przez sekwencyjne dodawanie nukleotydów do nici komplementarnej. Etap ten obejmuje cykliczne reakcje przyłączania nukleotydów, obrazowania i rozszczepiania, umożliwiając określenie sekwencji DNA na podstawie sygnałów fluorescencyjnych emitowanych przez przyłączone nukleotydy.
• Sekwencjonowanie masowo równoległe: W ostatnim etapie, przestrzennie posegregowane, amplifikowane szablony DNA są sekwencjonowane jednocześnie w sposób masowo równoległy. To wysokowydajne podejście do sekwencjonowania umożliwia generowanie milionów do miliardów odczytów sekwencjonowania w jednym przebiegu sekwencjonowania, umożliwiając wydajne i szybkie określanie sekwencji DNA.

Jak działa ultradźwiękowa fragmentacja DNA?

Sonikacja, znana również jako akustyczne przetwarzanie próbek, jest szeroko stosowaną metodą fragmentacji DNA. W przypadku ultradźwiękowego ścinania DNA próbki są poddawane działaniu fal ultradźwiękowych w kontrolowanych warunkach. Zasada działania ultradźwiękowej fragmentacji DNA opiera się na wibracjach i kawitacji generowanych przez fale ultradźwiękowe. Siły ścinające wynikające z kawitacji ultradźwiękowej (akustycznej) rozbijają cząsteczki DNA o wysokiej masie cząsteczkowej. Ustawienie sonikacji, takie jak intensywność (amplituda, czas trwania), tryb pulsacji i temperatura pozwalają na precyzyjną fragmentację DNA do określonej pożądanej długości fragmentów DNA. Podczas gdy DNA często jest redukowane do 100 do 600 bp za pomocą ultradźwięków, dłuższe fragmenty DNA do 1300 bp można uzyskać, gdy stosowane są łagodniejsze warunki ultradźwiękowe.

Kontrola temperatury w celu zapobiegania degradacji DNA

Dwuniciowy kształt molekularny DNA jest bardzo wrażliwy na podwyższone temperatury, więc dokładna kontrola temperatury podczas etapów przygotowania próbki jest kluczowym czynnikiem dla uzyskania wiarygodnych wyników analizy.
Niezależnie od tego, czy używasz ultradźwiękowych sond firmy Hielscher, VialTweeter czy UIP400MTP – Ciągłe monitorowanie i kontrola temperatury są zapewnione dzięki podłączanemu czujnikowi temperatury i inteligentnemu oprogramowaniu urządzenia. Aby utrzymać temperaturę w określonym zakresie, można ustawić górną i dolną granicę temperatury. W rezultacie ultradźwiękowiec zatrzyma się, gdy tylko limit temperatury zostanie przekroczony i automatycznie będzie kontynuował sonikację, gdy temperatura spadnie o ustawioną wartość ∆T.
Zaawansowane oprogramowanie ultrasonografów Hielscher zapewnia niezawodne utrzymanie idealnych warunków obróbki próbek.

Fragmentacja DNA próbki masowej za pomocą ultradźwiękowego urządzenia UIP400MTP z płytką wielodołkową

Liczba próbek w naukach przyrodniczych znacznie wzrosła w ciągu ostatniej dekady. Oznacza to, że bardzo duża liczba próbek (np. 384, 1536 lub 3456 dołków na mikropłytkę) musi być przetwarzana podczas przygotowywania i analizy próbek w niezmiennie równych warunkach w celu uzyskania porównywalnych i prawidłowych wyników. Dzięki UIP400MTP firma Hielscher Ultrasonics podąża za trendem masowego przetwarzania próbek. UIP400MTP to ultrasonograf do przygotowywania próbek przy użyciu mikropłytek. UIP400MTP może przetwarzać płytki z 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 lub 3456 dołkami. W zależności od typu mikropłytki, każda studzienka może zazwyczaj pomieścić próbki o objętości od kilkudziesięciu nanolitrów do kilku mililitrów. Mikropłytki UIP400MTP są szeroko stosowane w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych do przygotowywania próbek przed testami, takimi jak ELISA (test immunoenzymatyczny) lub PCR, przed analizą białek, a także do przygotowywania chromatyny przed CHiP i CHiP-seq, identyfikacji modyfikacji histonów i innych zabiegów analitycznych (np. elektroforeza żelowa, spektrometria masowa).

VialTweeter do przygotowywania próbek z maksymalnie 10 fiolek

VialTweeter to szeroko stosowany ultrasonograf laboratoryjny VialTweeter, który pozwala na skuteczną i wygodną sonikację do 10 fiolek jednocześnie. Ponieważ fiolki i probówki (np. fiolki Eppendorf, fiolki krio, probówki wirówkowe) są sonikowane pośrednio, unika się jakiegokolwiek zanieczyszczenia krzyżowego. Ponieważ ta sama intensywność ultradźwięków jest dostarczana do każdej próbki, wszystkie wyniki sonikacji są jednorodne i powtarzalne. VialTweeter oferuje wszystkie inteligentne funkcje, takie jak nasze inne urządzenia cyfrowe (np. inteligentne menu, programowalne ustawienia, kontrola temperatury, zdalne sterowanie itp.), dzięki czemu zapewniony jest najwyższy komfort użytkowania.

Sondy wielopalcowe do płytek mikrostudzienek

Dostępne dla homogenizatorów ultradźwiękowych UP200Ht i UP200St, sondy wielopalcowe z 4 lub 8 palcami są wygodną opcją do sonikacji wielu próbek w tym samym czasie w tych samych warunkach. Na przykład sonotroda MTP-24-8-96 jest sondą z ośmioma palcami, która idealnie nadaje się do integracji z systemami automatycznymi lub do wydajnego ręcznego przygotowywania próbek w dołkach płytek wielodołkowych. Sonotroda wielopalcowa jest idealna do zautomatyzowanych laboratoriów, w których przetwarzane są głównie zlewki i probówki przy użyciu standardowej sonotrody ultradźwiękowej. Sondy wielopalcowe i standardowe mogą być szybko wymieniane w ciągu kilku minut, przekształcając ultrasonograf z pojedynczą sondą w ultradźwiękowy zakłócacz z wieloma sondami.

Ultradźwięki Hielscher do fragmentacji DNA

Hielscher Ultrasonics oferuje różne platformy oparte na ultradźwiękach do fragmentacji DNA, RNA i chromatyny. Te różne platformy obejmują sondy ultradźwiękowe (sonotrody), pośrednie rozwiązania sonikacyjne do jednoczesnego przygotowywania próbek z wielu probówek lub płytek wielodołkowych (np. płytek 96-dołkowych, płytek do mikromiareczkowania), sonoreaktorów i rogów ultradźwiękowych. Wszystkie platformy do ścinania DNA są zasilane przez dostrojone częstotliwościowo, wysokowydajne procesory ultradźwiękowe, które są precyzyjnie kontrolowane i zapewniają powtarzalne wyniki.

Procesory ultradźwiękowe dla dowolnej liczby i wielkości próbek

Dzięki wielopróbkowym ultrasonikatorom VialTweeter firmy Hielscher (do 10 probówek) i UIP400MTP (do mikropłytek/płytek wielodołkowych) staje się łatwo możliwe skrócenie czasu przetwarzania próbki dzięki intensywnej i precyzyjnie kontrolowanej ultrasonizacji przy jednoczesnym uzyskaniu pożądanego rozkładu wielkości fragmentów DNA i wydajności. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA sprawia, że przygotowanie próbki jest wydajne, niezawodne i skalowalne. Protokoły mogą być liniowo skalowane od jednej do wielu próbek poprzez zastosowanie stale kontrolowanych ultradźwięków.
Ultradźwięki sondy z jednym do pięciu palców są idealne do przygotowania mniejszych ilości próbek. Ultradźwięki laboratoryjne firmy Hielscher są dostępne w różnych rozmiarach, dzięki czemu możemy polecić idealne urządzenie do danego zastosowania i wymagań.

Precyzyjna kontrola procesu

Precyzyjnie kontrolowane ustawienia sonikacji są kluczowe, ponieważ wyczerpująca sonifikacja może zniszczyć DNA, RNA i chromatynę, ale nieodpowiednie ścinanie ultradźwiękowe skutkuje zbyt długimi fragmentami DNA i chromatyny. Cyfrowe ultrasonografy firmy Hielscher można łatwo ustawić na precyzyjny parametr sonikacji. Określone ustawienia sonikacji można również zapisać jako zaprogramowane ustawienie w celu szybkiego powtórzenia tej samej procedury.
Wszystkie sonikacje są automatycznie protokołowane i przechowywane jako plik CSV na wbudowanej karcie SD. Pozwala to na dokładną dokumentację przeprowadzonych prób i umożliwia łatwą zmianę przebiegu sonikacji.
Dzięki zdalnemu sterowaniu przez przeglądarkę, wszystkie cyfrowe ultrasonografy mogą być obsługiwane i monitorowane przez dowolną standardową przeglądarkę. Instalacja dodatkowego oprogramowania nie jest wymagana, ponieważ połączenie LAN umożliwia bardzo prostą konfigurację plug-n-play.

Najwyższa łatwość obsługi w ultradźwiękowym przygotowywaniu próbek

Wszystkie ultrasonografy Hielscher zostały zaprojektowane tak, aby zapewnić wysoką wydajność ultradźwięków, a jednocześnie zawsze były bardzo przyjazne dla użytkownika i łatwe w obsłudze. Wszystkie ustawienia są dobrze zorganizowane w przejrzystym menu, do którego można łatwo uzyskać dostęp za pomocą kolorowego wyświetlacza dotykowego lub pilota zdalnego sterowania. Inteligentne oprogramowanie z programowalnymi ustawieniami i automatycznym zapisem danych zapewnia optymalne ustawienia sonikacji dla wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Przejrzysty i łatwy w użyciu interfejs menu sprawia, że ultradźwięki Hielscher są przyjazne dla użytkownika i wydajne.
Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych ultrasonografów laboratoryjnych, które są idealne do zadań przygotowania próbek, takich jak fragmentacja DNA i RNA, liza komórek, a także ekstrakcja białek: