Ultradźwiękowa fragmentacja DNA do sekwencjonowania nowej generacji

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) wymaga niezawodnego ścinania i fragmentacji genomowego DNA w celu sekwencjonowania nici genomowego DNA i tworzenia bibliotek genomowych. Kontrolowana fragmentacja DNA na fragmenty DNA jest niezbędnym etapem przygotowania próbek przed sekwencjonowaniem DNA. Sonikacja jest sprawdzoną, wydajną i niezawodną techniką fragmentacji DNA na fragmenty o określonej długości. Protokoły ultradźwiękowej fragmentacji DNA zapewniają odtwarzalne wyniki fragmentacji. Sonikatory Hielscher umożliwiają uzyskiwanie szerokiego zakresu rozkładów wielkości fragmentów genomowego DNA, które można precyzyjnie kontrolować za pomocą parametrów pracy. Ponieważ ultradźwiękowe systemy Hielscher do ścinania DNA są dostępne zarówno dla pojedynczych i wielu fiolek, jak i dla mikropłytek, przygotowanie próbek staje się wysoce wydajne.

Sekwencjonowanie nowej generacji: ultradźwiękowa fragmentacja DNA do przygotowania bibliotek

Aby przeprowadzić sekwencjonowanie nowej generacji, należy wykonać trzy podstawowe etapy: (1) przygotowanie biblioteki, (2) sekwencjonowanie i (3) analizę danych. Podczas przygotowania biblioteki DNA jest fragmentowane, następnie końce fragmentów są naprawiane (wygładzane) przez dodanie pojedynczej zasady adeninowej, a docelowe fragmenty są przekształcane w dwuniciowe DNA. Na koniec tak zwane adaptery są dołączane poprzez ligację, PCR lub tagmentację, aby można było ilościowo oznaczyć końcowy produkt DNA biblioteki do sekwencjonowania.
Fragmentacja DNA za pomocą sonikacji: Zwłaszcza przy stosowaniu technologii sekwencjonowania krótkich odczytów, takich jak Illumina, które nie mogą łatwo odczytywać dłuższych fragmentów DNA, nici DNA muszą zostać pofragmentowane do określonej wielkości, co można niezawodnie osiągnąć za pomocą sonikacji.
Sonikację można niezawodnie stosować do fragmentacji DNA, RNA i chromatyny.

Sekwencjonowanie nowej generacji – przygotowanie bibliotek

Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest powszechnie stosowana podczas przygotowywania bibliotek do sekwencjonowania DNA na platformach sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Technika ta służy do rozbijania cząsteczek DNA na mniejsze fragmenty w pożądanym zakresie wielkości, co ułatwia kolejne etapy przygotowania biblioteki. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest zazwyczaj wymagana na etapie przygotowania biblioteki w procedurach NGS w celu pofragmentowania genomowego DNA na mniejsze fragmenty odpowiednie do dalszego przetwarzania i sekwencjonowania. Odgrywa ona kluczową rolę w zapewnieniu powodzenia eksperymentu sekwencjonowania poprzez wytwarzanie fragmentów DNA w zakresie wielkości odpowiednim dla konkretnej używanej platformy sekwencjonowania.

Sekwencjonowanie nowej generacji – etapy procesu:

• Ultradźwiękowa fragmentacja DNA: Przed utworzeniem biblioteki genomowe DNA jest fragmentowane na mniejsze, łatwiejsze do przetwarzania fragmenty. Fragmentacja ultradźwiękowa polega na wykorzystaniu fal dźwiękowych o wysokiej częstotliwości do ścinania cząsteczek DNA na fragmenty w pożądanym zakresie wielkości. Ten etap ma kluczowe znaczenie, ponieważ pomaga zapewnić, że odczyty sekwencjonowania uzyskane później będą miały długość odpowiednią dla używanej platformy sekwencjonowania. Zakres wielkości fragmentów można dostosować do konkretnych wymagań eksperymentu sekwencjonowania.
• Amplifikacja klonalna metodą PCR: Po fragmentacji ultradźwiękowej fragmenty DNA są poddawane naprawie końców, ligacji adapterów i amplifikacji PCR w celu uzyskania końcowych bibliotek do sekwencjonowania DNA. Etapy te przygotowują pofragmentowane cząsteczki DNA do procesu sekwencjonowania poprzez dodanie sekwencji adapterowych niezbędnych do wiązania z platformą sekwencjonowania oraz zapewnienie miejsc wiązania starterów do amplifikacji PCR.
• Sekwencjonowanie DNA przez syntezę: Po przygotowaniu bibliotek do sekwencjonowania rozpoczyna się proces sekwencjonowania DNA przez syntezę (SBS). Podczas SBS sekwencja DNA jest określana poprzez kolejne dodawanie nukleotydów do nici komplementarnej. Etap ten obejmuje cykliczne reakcje włączania nukleotydów, obrazowania i odszczepiania, umożliwiające określenie sekwencji DNA na podstawie sygnałów fluorescencyjnych emitowanych przez włączone nukleotydy.
• Masowo równoległe sekwencjonowanie: W ostatnim etapie przestrzennie rozdzielone, amplifikowane matryce DNA są sekwencjonowane jednocześnie w sposób masowo równoległy. To podejście do sekwencjonowania o wysokiej wydajności umożliwia uzyskanie od milionów do miliardów odczytów sekwencjonowania w jednym przebiegu, pozwalając na wydajne i szybkie określanie sekwencji DNA.

Jak działa ultradźwiękowa fragmentacja DNA?

Sonikacja, znana również jako akustyczne przetwarzanie próbek, jest szeroko stosowaną metodą fragmentacji DNA. W celu ultradźwiękowego ścinania DNA próbki są poddawane działaniu fal ultradźwiękowych w kontrolowanych warunkach. Zasada działania ultradźwiękowej fragmentacji DNA opiera się na drganiach i kawitacji generowanych przez fale ultradźwiękowe. Siły ścinające powstające w wyniku kawitacji ultradźwiękowej (akustycznej) rozrywają cząsteczki DNA o dużej masie cząsteczkowej. Ustawienia sonikacji, takie jak intensywność (amplituda, czas trwania), tryb pulsacyjny i temperatura, umożliwiają precyzyjną fragmentację DNA na fragmenty o określonej pożądanej długości. Chociaż za pomocą sonikacji DNA jest często skracane do 100 do 600 bp, przy zastosowaniu łagodniejszych warunków sonikacji można uzyskać dłuższe fragmenty DNA, do 1300 bp.

Kontrola temperatury zapobiegająca degradacji DNA

Dwuniciowa struktura cząsteczkowa DNA jest bardzo wrażliwa na podwyższoną temperaturę, dlatego dokładna kontrola temperatury podczas etapów przygotowania próbek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników analizy.
Niezależnie od tego, czy używasz sonikatorów sondowych Hielscher, VialTweeter czy UIP400MTP – ciągłe monitorowanie i kontrola temperatury są zapewnione dzięki podłączanemu czujnikowi temperatury i inteligentnemu oprogramowaniu urządzenia. Aby utrzymać temperaturę w określonym zakresie, można ustawić górną i dolną granicę temperatury. W rezultacie sonikator wstrzyma pracę natychmiast po przekroczeniu tej granicy temperatury i automatycznie wznowi sonikację, gdy temperatura obniży się o ustawioną wartość ∆T.
Zaawansowane oprogramowanie sonikatorów Hielscher zapewnia niezawodne utrzymywanie idealnych warunków obróbki próbek.

Fragmentacja DNA w dużej liczbie próbek za pomocą sonikatora do płytek wielodołkowych UIP400MTP

Liczba próbek w naukach o życiu znacznie wzrosła w ciągu ostatniej dekady. Oznacza to, że bardzo duże liczby próbek (np. 384, 1536 lub 3456 dołków na mikropłytkę) muszą być przetwarzane podczas przygotowania i analizy próbek w stale jednakowych warunkach, aby uzyskać porównywalne i miarodajne wyniki. Dzięki UIP400MTP firma Hielscher Ultrasonics podąża za trendem przetwarzania dużej liczby próbek. UIP400MTP to sonikator do przygotowania próbek z wykorzystaniem mikropłytek. UIP400MTP może przetwarzać płytki z 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 lub 3456 dołkami. W zależności od rodzaju mikropłytki każdy dołek może zazwyczaj pomieścić próbkę o objętości od dziesiątek nanolitrów do kilku mililitrów. Szeroko stosowany w badaniach z zakresu nauk o życiu UIP400MTP jest bardzo często wykorzystywany do przygotowania próbek przed testami takimi jak ELISA (test immunoenzymatyczny) lub PCR, przed analizą białek, a także do przygotowania chromatyny przed CHiP i CHiP-seq, identyfikacji modyfikacji histonów oraz innymi procedurami analitycznymi (np. elektroforezą żelową, spektrometrią mas).
Dowiedz się więcej o przetwarzaniu płytek PCR z wysoką wydajnością!

VialTweeter do przygotowania próbek w maksymalnie 10 fiolkach

VialTweeter to szeroko stosowany laboratoryjny sonikator VialTweeter, który umożliwia skuteczną i wygodną sonikację do 10 fiolek jednocześnie. Ponieważ fiolki i probówki (np. fiolki Eppendorf, fiolki kriogeniczne, probówki wirówkowe) są poddawane sonikacji pośredniej, unika się wszelkiego zanieczyszczenia krzyżowego. Ponieważ każda próbka otrzymuje ultradźwięki o tej samej intensywności, wszystkie wyniki sonikacji są jednorodne i odtwarzalne. VialTweeter oferuje wszystkie inteligentne funkcje dostępne w naszych pozostałych urządzeniach cyfrowych (np. inteligentne menu, programowalne ustawienia, kontrolę temperatury, zdalne sterowanie itp.), zapewniając najwyższy komfort użytkowania.

Sondy wielopalcowe do płytek z mikrodołkami

Dostępne dla sondowych homogenizatorów ultradźwiękowych UP200Ht i UP200St sondy wielopalcowe z 4 lub 8 palcami stanowią wygodne rozwiązanie do sonikacji wielu próbek jednocześnie w tych samych warunkach. Na przykład sonotroda MTP-24-8-96 jest sondą ośmiopalcową, idealną do integracji z systemami zautomatyzowanymi lub do wydajnego ręcznego przygotowania próbek w dołkach płytek wielodołkowych. Sonotroda wielopalcowa idealnie nadaje się do automatyzacji w laboratoriach, w których przetwarza się głównie zlewki i probówki przy użyciu standardowej sonotrody ultradźwiękowej. Sondy wielopalcowe i standardowe można szybko wymienić w ciągu kilku minut, przekształcając sonikator z pojedynczą sondą w wielosondowy ultradźwiękowy aparat do rozbijania komórek.

Sonikatory Hielscher do fragmentacji DNA

Hielscher Ultrasonics oferuje różne platformy wykorzystujące ultradźwięki do fragmentacji DNA, RNA i chromatyny. Te różne platformy obejmują sondy ultradźwiękowe (sonotrody), rozwiązania do sonikacji pośredniej umożliwiające jednoczesne przygotowanie próbek w wielu probówkach lub płytkach wielodołkowych (np. płytkach 96-dołkowych, płytkach mikrotitracyjnych), sonoreaktory i ultradźwiękowe sonotrody kubkowe. Wszystkie platformy do ścinania DNA są zasilane przez wysokowydajne procesory ultradźwiękowe z dostrojoną częstotliwością, które umożliwiają precyzyjną kontrolę i zapewniają odtwarzalne wyniki.

Procesory ultradźwiękowe do próbek o dowolnej liczbie i wielkości

Dzięki sonikatorom Hielscher do wielu próbek VialTweeter (do 10 probówek) i UIP400MTP (do mikropłytek/ płytek wielodołkowych) można skrócić czas przetwarzania próbek dzięki intensywnej i precyzyjnie kontrolowanej sonikacji, uzyskując jednocześnie pożądany rozkład wielkości fragmentów DNA i wydajność ich uzyskiwania. Ultradźwiękowa fragmentacja DNA sprawia, że przygotowanie próbek jest wydajne, niezawodne i skalowalne. Protokoły można skalować liniowo od jednej do wielu próbek poprzez zastosowanie stale kontrolowanych ultradźwięków.
Sonikatory sondowe z jednym do pięciu palców idealnie nadają się do przygotowania mniejszej liczby próbek. Laboratoryjne sonikatory Hielscher są dostępne w różnych rozmiarach, dzięki czemu możemy polecić idealne urządzenie do Twojego zastosowania i wymagań.

Precyzyjna kontrola procesu

Możliwość precyzyjnej kontroli ustawień sonikacji ma kluczowe znaczenie, ponieważ nadmierna sonikacja może zniszczyć DNA, RNA i chromatynę, natomiast niewystarczające ścinanie ultradźwiękowe prowadzi do powstawania zbyt długich fragmentów DNA i chromatyny. W cyfrowych sonikatorach Hielscher można łatwo ustawić precyzyjne parametry sonikacji. Określone ustawienia sonikacji można również zapisać jako ustawienia zaprogramowane w celu szybkiego powtórzenia tej samej procedury.
Wszystkie procesy sonikacji są automatycznie rejestrowane i zapisywane jako plik CSV na wbudowanej karcie SD. Umożliwia to dokładne dokumentowanie przeprowadzonych prób i łatwy przegląd przebiegów sonikacji.
Dzięki zdalnemu sterowaniu przez przeglądarkę wszystkie cyfrowe sonikatory można obsługiwać i monitorować za pomocą dowolnej standardowej przeglądarki. Instalacja dodatkowego oprogramowania nie jest wymagana, ponieważ połączenie LAN umożliwia bardzo prostą konfigurację typu plug-n-play.


Najwyższa łatwość obsługi podczas ultradźwiękowego przygotowania próbek

Wszystkie sonikatory Hielscher zostały zaprojektowane tak, aby dostarczać ultradźwięki o wysokiej wydajności, a jednocześnie zawsze pozostawać bardzo przyjazne dla użytkownika i łatwe w obsłudze. Wszystkie ustawienia są przejrzyście uporządkowane w czytelnym menu, do którego można łatwo uzyskać dostęp za pomocą kolorowego ekranu dotykowego lub zdalnego sterowania przez przeglądarkę. Inteligentne oprogramowanie z programowalnymi ustawieniami i automatyczną rejestracją danych zapewnia optymalne ustawienia sonikacji dla uzyskania wiarygodnych i odtwarzalnych wyników. Przejrzysty i łatwy w użyciu interfejs menu sprawia, że sonikatory Hielscher są przyjaznymi dla użytkownika i wydajnymi urządzeniami.
Poniższa tabela przedstawia orientacyjną wydajność przetwarzania naszych laboratoryjnych sonikatorów, które idealnie nadają się do przygotowania próbek, obejmującego fragmentację DNA i RNA, lizę komórek oraz ekstrakcję białek: