Ultrasoniczne przygotowanie próbek do testów ELISA

Badania takie jak ELISA są szeroko stosowane w diagnostyce in vitro, wykrywaniu białka związanego z chorobą i kontroli jakości (np. monitorowanie alergenów pokarmowych). Ultrasonograficzne przygotowanie próbki jest szybką, niezawodną i powtarzalną techniką służącą do lizania komórek i izolowania białek wewnątrzkomórkowych, DNA, RNA i organelli. Firma Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania ultradźwiękowe do wygodnego przygotowywania pojedynczych próbek, fiolek wielokrotnych, jak również do płytek mikromiareczkowych i płytek 96-dołkowych.

ELISA – Test immunosorpcji połączony z enzymem (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA to skrót od enzymatycznego testu immunosorpcyjnego i jest szeroko stosowaną techniką analizy biochemicznej w kategorii testów wiązania ligandów. W odczynie ELISA próbka ciekła jest dodawana do stacjonarnej fazy stałej o specjalnych właściwościach wiążących. Zwykle, stacjonarna faza stała jest nakładana jako powłoka na płytkę studzienną lub płytkę ELISA. Następnie różne odczynniki ciekłe są kolejno dodawane, inkubowane i płukane, tak aby w końcowej fazie ciekłej w studzience nastąpiła zmiana optyczna (np. rozwój koloru przez produkt reakcji enzymatycznej). Zmiana optyczna pozwala na pomiar ilości analitu za pomocą tzw. ilościowego “Czytanie". Do odczytów ilościowych stosuje się spektrofotometr, fluorometr lub luminometr do wykrywania i pomiaru natężenia przepuszczanego światła. Na czułość detekcji wpływa wzmocnienie sygnału podczas reakcji analitycznych. Ponieważ reakcje enzymatyczne są dobrze zbadane i niezawodne procesy amplifikacji, do tworzenia sygnału wykorzystuje się enzymy. Enzymy są połączone z odczynnikami detekcyjnymi w stałych proporcjach, aby umożliwić dokładną kwantyfikację, co wyjaśnia również nazwę "enzymatycznie powiązane" oznaczenie immunosorbentu.
Ponieważ test ELISA jest wykonywany w płytkach mikromiareczkowych / 96-dołkowych, jest on znany jako technika testu opartego na płytkach i jest stosowany np. w diagnostyce klinicznej in vitro, badaniach, rozwoju leków itp. do wykrywania i ilościowego określania przeciwciał, peptydów, białek i hormonów.
Technika ELISA jest często stosowana jako narzędzie diagnostyczne w medycynie, biotechnologii, patologii zakładów, a także jako ważny środek kontroli jakości w wielu branżach.

Przygotowanie próbki ultradźwiękowej przed testem ELISA

Przed wykonaniem testu ELISA próbki wymagają etapów przygotowania takiej analizy komórkowej oraz ekstrakcji białek wewnątrzkomórkowych, DNA, RNA itp. Zaletą lizy komórek ultradźwiękowych oraz izolacji białek jest ich wysoka skuteczność, wiarygodność oraz odtwarzalność. Wszystkie te czynniki są ważne w celu uzyskania wysokiej jakości diagnostyki i wyników badań.

Protokół do analizy ultrasonograficznej komórek przed wykonaniem testuELISA

• Dla Cell Cultures: Przed analizą ultrasonograficzną komórki należy wirować przez 5 minut przy 270 x g w mikrowirówce. Usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić komórki w 30 - 100 μl buforu RIPA. Następnie inkubować osad komórkowy na lodzie przez 30 min.
• Teraz, próbka komórek jest gotowa do analizy ultradźwiękowej:
  Należy użyć ultrasonografu typu sonda (np. UP200Ht z sondą S26d2) lub ultradźwiękowym urządzeniem do pobierania wielu próbek (np. VialTweeter do jednoczesnej sondy do 10 fiolek lub UIP400MPT do płytek mikrotitracyjnych / płytek 96-dołkowych) w zależności od ilości próbek, które należy przygotować.
  W celu sondowania pojedynczej próbki należy umieścić komórki w probówkach mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
• W cyfrowym menu ultrasonografu należy wstępnie ustawić czas trwania badania ultradźwiękowego, całkowity pobór energii, tryb cyklu i/lub limity temperatury. Zapewnia to wysoką niezawodność i powtarzalność dźwięku.
• Włożyć sonotrode i włączyć urządzenie ultradźwiękowe. Delikatnie przesunąć mikrokapsułkę sondy ultradźwiękowej przez próbkę, aby równomiernie ją usunąc.
  Dla większości komórek lizę ultradźwiękową wykonuje się po 2-4 cyklach po 10 sek. sonacji.
• Po przeprowadzeniu sondy należy usunąć sonotrodę z próbki. Próbki powinny być inkubowane na lodzie przez 5 minut. Następnie odwirować przy 10.000 x g przez 20 minut, aby odessać resztki. Przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej. Oznaczyć anality i przechowywać w temperaturze -20°C.
• Sonotrodę ultradźwiękową można czyścić przez odpowiednie przetarcie alkoholem lub sonikatem w zlewce wypełnionej alkoholem, np. 70% etanolem. Wszystkie sondy ultradźwiękowe wykonane z tytanu są autoklawowalne.

Dla Tissue Homogenates:

• Przepłukać tkankę lodowatym PBS (0,01M, pH=7,4), aby dokładnie usunąć nadmiar krwi hemolizującej.
• Zważyć tkankę (nerki, serce, płuca, śledzionę itp.) i macerkować ją na małe kawałki, które są homogenizowane w PBS. Wymagana objętość PBS jest zależna od masy tkanki. Z reguły 1g tkanki wymaga ok. 9ml PBS. Zaleca się dodanie do PBS inhibitora proteazy. (Alternatywnie można zastosować RIPA lub hipotoniczny bufor do lizy zawierający koktajl inhibitorów proteaz i fosfatazy).
• W zależności od wielkości tkanki pomocny może być krótki zabieg wirowy (ok. 1-2 min. w 15 sek. impulsów).
• Zamontuj mikrokapturek, np. S26d2, na ultradźwiękomierzu. Umieścić probówkę z tkankami w łaźni z lodem.
• UP200St (80% amplitudy) przez 1 minutę w trybie pulsacyjnym (15 sekund włączona, 15 sekundowa pauza). Przechowywać próbkę w łaźni z lodem.
• Następnie homogenaty są odwirowywane w celu uzyskania specyficznych puli (cytozolowych, nuklearnych, mitochondrialnych lub lizosomalnych) w celu wzbogacenia białka do analizy. Poprzez odwirowywanie próbki przez 5 minut w temperaturze 5000×g, supernatant jest odzyskiwany.

Niezawodna kontrola temperatury podczas sondowania

Temperatura jest kluczowym czynnikiem wpływającym na proces, który jest szczególnie istotny dla obróbki próbek biologicznych, np. w celu zapobiegania termicznej degradacji białek. Jak wszystkie mechaniczne techniki przygotowywania próbek, sonikacja wytwarza ciepło. Jednakże, temperatura próbek może być dobrze kontrolowana przy użyciu urządzeń Hielscher Ultrasonics. Przedstawiamy Państwu różne opcje monitorowania i kontroli temperatury próbek podczas ich przygotowania za pomocą sondy ultradźwiękowej lub analizatora VialTweeter.

1. Monitorowanie temperatury próbki: Wszystkie cyfrowe procesory ultradźwiękowe firmy Hielscher są wyposażone w inteligentne oprogramowanie i podłączany czujnik temperatury. Podłączyć czujnik temperatury do urządzenia ultradźwiękowego (np, UP200Ht, UP200St, VialTweeterUIP400MTP) i włożyć końcówkę czujnika temperatury do jednej z probówek. Za pomocą kolorowego, cyfrowego wyświetlacza dotykowego można ustawić w menu procesora ultradźwiękowego określony zakres temperatur dla danej próbki. Procesor ultradźwiękowy zatrzyma się automatycznie po osiągnięciu maksymalnej temperatury i wstrzyma się do momentu, gdy temperatura próbki spadnie do niższej wartości ustawionej temperatury ∆. Następnie sonikacja rozpocznie się ponownie automatycznie. Ta inteligentna funkcja zapobiega degradacji powodowanej przez ciepło.
2. W przypadku ultradźwiękowej jednostki multi-samplerzowej VialTweeter, blok tytanowy, który utrzymuje probówki, może być wstępnie schłodzony. Umieść blok VialTweeter (tylko sonotroda bez przetwornika!) w lodówce lub zamrażarce, aby wstępnie schłodzić blok tytanowy pomaga opóźnić wzrost temperatury w próbce. Jeśli to możliwe, sama próbka może być również wstępnie schłodzona.
3. Do schładzania podczas syreny należy używać kąpieli lodowej lub suchego lodu. Umieścić probówkę (probówki) z próbką podczas sonowania w łaźni z lodem. W przypadku miernika VialTweeter należy użyć płytkiej tacy wypełnionej suchym lodem i umieścić miernik VialTweeter na suchym lodzie, aby ciepło mogło się szybko rozproszyć.

Klienci na całym świecie używają sond ultradźwiękowych firmy Hielscher, jak również wielopróbkowych urządzeń sonacyjnych VialTweeter i UIP400MTP do codziennej pracy przy przygotowaniu próbek w laboratoriach biologicznych, biochemicznych, medycznych i klinicznych. Dzięki inteligentnemu oprogramowaniu i kontroli temperatury procesorów Hielscher, temperatura jest niezawodnie kontrolowana i unika się degradacji próbki wywołanej przez ciepło. Ultradźwiękowe przygotowanie próbki przy użyciu rozwiązań ultradźwiękowych firmy Hielscher zapewnia wysoce niezawodne i powtarzalne wyniki!