Ultradźwiękowe przygotowanie próbek do testów ELISA

Testy takie jak ELISA są szeroko stosowane w diagnostyce in vitro, wykrywaniu białek związanych z chorobami oraz kontroli jakości (np. monitorowaniu alergenów pokarmowych). Ultradźwiękowe przygotowanie próbek to szybka, niezawodna i powtarzalna technika lizy komórek oraz izolacji wewnątrzkomórkowych białek, DNA, RNA i organelli. Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania ultradźwiękowe umożliwiające wygodne przygotowanie pojedynczych próbek, wielu fiolek, a także płytek mikrotitracyjnych i płytek 96-dołkowych.

ELISA – enzymatyczny test immunosorpcyjny

ELISA oznacza enzymatyczny test immunosorpcyjny i jest szeroko stosowaną techniką analizy biochemicznej należącą do kategorii testów wiązania ligandów. W teście ELISA płynną próbkę nanosi się na nieruchomą fazę stałą o specjalnych właściwościach wiążących. Zazwyczaj nieruchomą fazę stałą nanosi się jako powłokę na płytkę z dołkami lub płytkę ELISA. Następnie kolejno dodaje się różne płynne odczynniki, przeprowadza inkubację i płukanie, tak aby ostatecznie w końcowej cieczy w dołku wystąpiła zmiana optyczna (np. pojawienie się barwy wskutek powstania produktu reakcji enzymatycznej). Zmiana optyczna umożliwia pomiar ilości analitu za pomocą tak zwanego „odczytu” ilościowego. Do odczytu ilościowego wykorzystuje się spektrofotometr, fluorometr lub luminometr w celu wykrycia i pomiaru natężenia światła przechodzącego. Na czułość wykrywania wpływa wzmocnienie sygnału podczas reakcji analitycznych. Ponieważ reakcje enzymatyczne są dobrze zbadanymi i niezawodnymi procesami wzmacniania, do generowania sygnału wykorzystuje się enzymy. Enzymy są połączone z odczynnikami detekcyjnymi w stałych proporcjach, co umożliwia dokładne oznaczanie ilościowe i wyjaśnia również określenie testu immunosorpcyjnego jako „sprzężonego z enzymem”.
Ponieważ testy ELISA wykonuje się na płytkach mikrotitracyjnych / płytkach 96-dołkowych, technika ta jest znana jako technika oznaczeń płytkowych i jest stosowana np. w klinicznej diagnostyce in vitro, badaniach naukowych, opracowywaniu leków itp. do wykrywania i oznaczania ilościowego przeciwciał, peptydów, białek i hormonów.
Technika ELISA jest często wykorzystywana jako narzędzie diagnostyczne w medycynie, biotechnologii i fitopatologii, a także stanowi ważny pomiar w kontroli jakości w wielu branżach.

Ultradźwiękowe przygotowanie próbek przed testem ELISA

Przed wykonaniem testu ELISA próbki wymagają przygotowania obejmującego takie etapy jak liza komórek oraz ekstrakcja wewnątrzkomórkowych białek, DNA, RNA itp. Zaletą ultradźwiękowej lizy komórek i izolacji białek jest wysoka skuteczność, niezawodność i powtarzalność. Wszystkie te czynniki są ważne dla uzyskania wysokiej jakości wyników diagnostycznych i badawczych

Protokół ultradźwiękowej lizy komórek przed testem ELISA

• Dla hodowli komórkowych: Przed ultradźwiękową lizą komórek odwirować komórki przez 5 min przy 270 x g w mikrowirówce. Usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić komórki w 30 – 100 μL buforu RIPA. Następnie inkubować osad komórkowy na lodzie przez 30 min.
• Próbka komórek jest teraz gotowa do lizy ultradźwiękowej:
  Użyć sonikatora z sondą (np. UP200Ht z sondą S26d2) lub ultradźwiękowego urządzenia do wielu próbek (np. VialTweeter do jednoczesnej sonikacji do 10 fiolek lub UIP400MPT do płytek mikrotitracyjnych / płytek 96-dołkowych), zależnie od liczby próbek wymagających przygotowania.
  Do sonikacji pojedynczej próbki za pomocą sondy umieścić komórki w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,5 mL.
• W menu cyfrowym sonikatora ustawić wcześniej czas działania ultradźwięków, całkowitą dostarczaną energię, tryb cykliczny i/lub graniczne wartości temperatury. Zapewnia to wysoce niezawodną sonikację i powtarzalność.
• Wprowadzić sonotrodę i włączyć urządzenie ultradźwiękowe. Delikatnie przesuwać mikrokońcówkę sondy ultradźwiękowej w próbce, aby poddać ją równomiernej sonikacji.
  W przypadku większości komórek liza ultradźwiękowa będzie zakończona po 2–4 cyklach sonikacji trwających po 10 s.
• Po sonikacji wyjąć sonotrodę z próbki. Próbki należy inkubować na lodzie przez 5 min. Następnie wirować przy 10 000 x g przez 20 min, aby osadzić resztki komórkowe. Przenieść supernatanty do nowej probówki mikrowirówkowej. Oznakować anality i przechowywać w temperaturze -20°C.
• Sonotrodę ultradźwiękową można wyczyścić, dokładnie przecierając ją alkoholem lub poddając sonikacji w zlewce wypełnionej alkoholem, np. 70% etanolem. Wszystkie sondy ultradźwiękowe wykonane z tytanu można sterylizować w autoklawie.

• Przepłukać tkankę lodowato zimnym PBS (0,01M, pH=7,4), aby dokładnie usunąć nadmiar zhemolizowanej krwi.
• Zważyć tkankę (nerkę, serce, płuco, śledzionę itp.) i rozdrobnić ją przez macerację na małe kawałki, które homogenizuje się w PBS. Wymagana objętość PBS zależy od masy tkanki. Orientacyjnie 1g tkanki wymaga około 9mL PBS. Zaleca się dodanie do PBS inhibitora proteaz. (Alternatywnie można zastosować bufor RIPA lub hipotoniczny bufor do lizy zawierający mieszaninę inhibitorów proteaz i fosfataz.)
• W zależności od wielkości tkanki krótka obróbka na mieszadle wirowym (około 1–2 min w impulsach po 15 s) może być pomocna we wstępnym przygotowaniu tkanki.
• Zamontować mikrokońcówkę, np. S26d2, w sonikatorze. Umieścić probówkę z próbką tkanki w łaźni lodowej.
• Poddawać próbkę sonikacji za pomocą sonikatora, np. UP200St (80% amplitudy), przez 1 min w trybie impulsowym (15s pracy, 15s przerwy). Utrzymywać próbkę w łaźni lodowej.
• Homogenaty następnie wiruje się w celu uzyskania określonych frakcji (cytozolowej, jądrowej, mitochondrialnej lub lizosomalnej), aby wzbogacić białko do analizy. Wirowanie próbki przez 5 minut przy 5000×g pozwala uzyskać supernatant.

Niezawodna kontrola temperatury podczas sonikacji

Temperatura jest kluczowym czynnikiem wpływającym na proces, szczególnie ważnym przy obróbce próbek biologicznych, np. dla zapobiegania termicznej degradacji białek. Podobnie jak wszystkie mechaniczne techniki przygotowania próbek, sonikacja generuje ciepło. Jednak podczas stosowania urządzeń Hielscher Ultrasonics można skutecznie kontrolować temperaturę próbek. Przedstawiamy różne możliwości monitorowania i kontrolowania temperatury próbek podczas ich przygotowania przed analizą za pomocą sonikatora z sondą lub urządzenia VialTweeter.

1. Monitorowanie temperatury próbki: Wszystkie cyfrowe procesory ultradźwiękowe Hielscher są wyposażone w inteligentne oprogramowanie i podłączany czujnik temperatury. Podłączyć czujnik temperatury do urządzenia ultradźwiękowego (np. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonikatora do płytek wielodołkowych UIP400MTP) i wprowadzić końcówkę czujnika temperatury do jednej z probówek z próbkami. Za pomocą cyfrowego kolorowego wyświetlacza dotykowego można ustawić w menu procesora ultradźwiękowego określony zakres temperatury sonikacji próbki. Sonikator automatycznie zatrzyma się po osiągnięciu maksymalnej temperatury i pozostanie wstrzymany, aż temperatura próbki spadnie do dolnej wartości ustawionej temperatury ∆. Następnie sonikacja ponownie rozpocznie się automatycznie. Ta inteligentna funkcja zapobiega degradacji wywołanej ciepłem.
2. W przypadku ultradźwiękowego urządzenia VialTweeter do wielu próbek blok tytanowy, w którym umieszcza się probówki z próbkami, można wstępnie schłodzić. Umieszczenie bloku VialTweeter (tylko sonotrody bez przetwornika!) w lodówce lub zamrażarce w celu wstępnego schłodzenia bloku tytanowego pomaga opóźnić wzrost temperatury próbki. Jeśli to możliwe, można również wstępnie schłodzić samą próbkę.
3. Do chłodzenia podczas sonikacji użyć łaźni lodowej lub suchego lodu. Podczas sonikacji umieścić probówkę lub probówki z próbkami w łaźni lodowej. W przypadku VialTweeter użyć płytkiej tacy wypełnionej suchym lodem i umieścić VialTweeter na suchym lodzie, aby ciepło mogło szybko się rozpraszać.

Klienci na całym świecie korzystają z sonikatorów Hielscher z sondą oraz urządzeń VialTweeter i UIP400MTP do sonikacji wielu próbek podczas codziennego przygotowania próbek w laboratoriach biologicznych, biochemicznych, medycznych i klinicznych. Dzięki inteligentnemu oprogramowaniu i kontroli temperatury w procesorach Hielscher temperatura jest niezawodnie kontrolowana, a degradacja próbek wywołana ciepłem jest eliminowana. Ultradźwiękowe przygotowanie próbek za pomocą rozwiązań ultradźwiękowych Hielscher zapewnia wysoce niezawodne i powtarzalne wyniki!
Dowiedz się więcej o sonikacji o wysokiej wydajności przetwarzania próbek z użyciem sonikatora do płytek wielodołkowych UIP400MTP do testów!