Ultradźwiękowe przygotowanie próbki do testów ELISA
Testy takie jak ELISA są szeroko stosowane w diagnostyce in vitro, wykrywaniu białek związanych z chorobami i kontroli jakości (np. monitorowanie alergenów pokarmowych). Ultradźwiękowe przygotowanie próbek jest szybką, niezawodną i powtarzalną techniką lizowania komórek i izolowania białek wewnątrzkomórkowych, DNA, RNA i organelli. Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania ultradźwiękowe do wygodnego przygotowywania pojedynczych próbek, wielu fiolek, a także płytek mikrotitracyjnych i płytek 96-dołkowych.
ELISA – Test immunoenzymatyczny połączony z enzymem
ELISA oznacza test immunoenzymatyczny i jest szeroko stosowaną techniką analizy biochemicznej z kategorii testów wiążących ligand. W teście ELISA ciekła próbka jest dodawana do stacjonarnej fazy stałej o specjalnych właściwościach wiążących. Zwykle stacjonarna faza stała jest nakładana jako powłoka na płytkę studzienkową lub płytkę ELISA. Następnie różne płynne odczynniki są sekwencyjnie dodawane, inkubowane i płukane, tak aby ostatecznie nastąpiła zmiana optyczna (np. zmiana koloru przez produkt reakcji enzymatycznej) w końcowej cieczy w studzience. Zmiana optyczna pozwala zmierzyć ilość analitu za pomocą tak zwanej metody ilościowej. “odczyt". Do odczytu ilościowego stosuje się spektrofotometr, fluorometr lub luminometr do wykrywania i pomiaru intensywności przepuszczanego światła. Na czułość wykrywania wpływa wzmocnienie sygnału podczas reakcji analitycznych. Ponieważ reakcje enzymatyczne są dobrze zbadanymi i niezawodnymi procesami amplifikacji, enzymy są wykorzystywane do tworzenia sygnału. Enzymy są połączone z odczynnikami wykrywającymi w ustalonych proporcjach, aby umożliwić dokładną kwantyfikację, co wyjaśnia również nazwę "enzymatyczny" test immunosorbcyjny.
Ponieważ testy ELISA są wykonywane na płytkach mikrotitracyjnych / 96-dołkowych, jest to znana technika testów płytkowych i jest stosowana np. w diagnostyce klinicznej in vitro, badaniach, opracowywaniu leków itp. do wykrywania i ilościowego oznaczania przeciwciał, peptydów, białek i hormonów.
Technika ELISA jest często stosowana jako narzędzie diagnostyczne w medycynie, biotechnologii, patologii roślin, a także jako ważny pomiar kontroli jakości w wielu gałęziach przemysłu.
Ultradźwiękowe urządzenie do przygotowywania próbek VialTweeter służy do lizy komórek i ekstrakcji białek przed testami ELISA
Ultradźwiękowe przygotowanie próbki przed testem ELISA
Przed wykonaniem testu ELISA próbki wymagają etapów przygotowania, takich jak liza komórek i ekstrakcja białek wewnątrzkomórkowych, DNA, RNA itp. Zaletą ultradźwiękowej lizy komórek i izolacji białek jest jej wysoka wydajność, niezawodność i powtarzalność. Wszystkie te czynniki są ważne w celu uzyskania wysokiej jakości diagnostyki i wyników badań
- Jednorodna obróbka próbki
- Całkowita liza
- Pełna ekstrakcja białek (np. przeciwciał, DNA)
- Optymalna adaptacja do typu komórek
- Dla dowolnej wielkości próby
- powtarzalny
- kontrolowana temperatura
- Automatyczne protokołowanie danych na karcie SD
Protokół ultradźwiękowej lizy komórek przed testem ELISA
- Dla kultur komórkowych: Przed ultradźwiękową lizą komórek, odwirować komórki przez 5 minut przy 270 x g w mikrowirówce. Usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić komórki w 30-100 μl buforu RIPA. Następnie inkubować osad komórkowy na lodzie przez 30 minut.
- Teraz próbka komórek jest gotowa do lizy ultradźwiękowej:
Użyj ultrasonografu z sondą (np. UP200Ht z sondą S26d2) lub ultradźwiękowe urządzenie do wielu próbek (np. VialTweeter do jednoczesnej sonikacji do 10 fiolek lub UIP400MPT do płytek mikrotitracyjnych / 96-dołkowych) w zależności od ilości próbek, które należy przygotować.
W przypadku sonikacji pojedynczej próbki należy umieścić komórki w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml. - Wstępne ustawienie czasu trwania ultradźwięków, całkowitego poboru energii, trybu cyklu i/lub limitów temperatury w menu cyfrowym ultrasonografu. Zapewnia to wysoce niezawodną sonikację i powtarzalność.
- Włożyć sonotrodę i włączyć urządzenie ultradźwiękowe. Delikatnie przesuń mikro-końcówkę sondy ultradźwiękowej przez próbkę, aby równomiernie sonifikować próbkę.
W przypadku większości komórek liza ultradźwiękowa zostanie zakończona po 2 -4 cyklach 10-sekundowej sonikacji. - Po sonikacji usunąć sonotrodę z próbki. Próbki należy inkubować na lodzie przez 5 minut. Następnie odwirować z prędkością 10 000 x g przez 20 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń. Przenieść supernatanty do nowej probówki do mikrowirówki. Oznaczyć anality i przechowywać w temperaturze -20°C.
- Sonotrodę ultradźwiękową można czyścić, przecierając ją odpowiednio alkoholem lub sonikacją w zlewce wypełnionej alkoholem, np. 70% etanolem. Wszystkie sondy ultradźwiękowe wykonane z tytanu można sterylizować w autoklawie.
Ekstrakcja białka z komórek E.coli za pomocą sonda ultradźwiękowa UP200St
- Przepłukać tkankę lodowatym PBS (0,01M, pH=7,4), aby dokładnie usunąć nadmiar krwi hemolizacyjnej.
- Zważyć tkankę (nerkę, serce, płuco, śledzionę itp.) i zmacerować ją na małe kawałki, które są homogenizowane w PBS. Wymagana objętość PBS jest związana z masą tkanki. Z reguły 1 g tkanki wymaga około 9 ml PBS. Zaleca się dodanie do PBS inhibitora proteazy. (Alternatywnie można użyć RIPA lub hipotonicznego buforu lizującego zawierającego koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy).
- W zależności od wielkości tkanki, krótki zabieg vortex (ok. 1-2 min. w 15-sekundowych impulsach) może być pomocny we wstępnej obróbce tkanki.
- Zamontować mikro-końcówkę, np. S26d2, do ultrasonografu. Umieścić próbówkę z tkanką w łaźni lodowej.
- Sonikacja próbki za pomocą ultradźwiękowca, np. UP200St (80% amplitudy) przez 1 min. w trybie impulsowym (15 sekund włączenia, 15 sekund przerwy). Przechowywać próbkę w łaźni lodowej.
- Homogenaty są następnie odwirowywane w celu uzyskania określonych pul (cytozolowych, jądrowych, mitochondrialnych lub lizosomalnych) w celu wzbogacenia białka do analizy. Przez wirowanie próbki przez 5 minut przy 5000×g, supernatant jest pobierany.
Sonotroda MTP-24-8-96 posiada osiem sond ultradźwiękowych do sonikacji studzienek płytek mikrotitracyjnych.
Niezawodna kontrola temperatury podczas sonikacji
Temperatura jest kluczowym czynnikiem wpływającym na proces, który jest szczególnie ważny w przypadku obróbki próbek biologicznych, np. w celu zapobiegania degradacji termicznej białek. Podobnie jak wszystkie mechaniczne techniki przygotowania próbek, sonikacja wytwarza ciepło. Jednak temperatura próbek może być dobrze kontrolowana podczas korzystania z urządzeń Hielscher Ultrasonics. Przedstawiamy różne opcje monitorowania i kontrolowania temperatury próbek podczas przygotowywania ich za pomocą ultrasonografu typu sondowego lub VialTweeter przedanalitycznie.
- Monitorowanie temperatury próbki: Wszystkie cyfrowe procesory ultradźwiękowe Hielscher są wyposażone w inteligentne oprogramowanie i podłączany czujnik temperatury. Podłącz czujnik temperatury do urządzenia ultradźwiękowego (np, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP) i włożyć końcówkę czujnika temperatury do jednej z próbówek. Za pomocą cyfrowego kolorowego wyświetlacza dotykowego można ustawić w menu procesora ultradźwiękowego określony zakres temperatur dla sonikacji próbki. Ultradźwięk automatycznie zatrzyma się po osiągnięciu maksymalnej temperatury i zatrzyma się, aż temperatura próbki spadnie do niższej wartości ustawionej temperatury ∆. Następnie sonikacja rozpocznie się automatycznie ponownie. Ta inteligentna funkcja zapobiega degradacji spowodowanej ciepłem.
- Jeśli chodzi o ultradźwiękową jednostkę wielopróbkową VialTweeter, blok tytanowy, który utrzymuje próbówki, może być wstępnie schłodzony. Umieszczenie bloku VialTweeter (tylko sonotrody bez przetwornika!) w lodówce lub zamrażarce w celu wstępnego schłodzenia bloku tytanowego pomaga opóźnić wzrost temperatury próbki. Jeśli to możliwe, sama próbka może być również wstępnie schłodzona.
- Użyj łaźni lodowej lub suchego lodu do schłodzenia podczas sonikacji. Umieść probówkę (probówki) z próbką podczas sonikacji w łaźni lodowej. W przypadku VialTweeter należy użyć płytkiej tacy wypełnionej suchym lodem i umieścić VialTweeter na suchym lodzie, aby ciepło mogło szybko się rozproszyć.
Klienci na całym świecie używają ultrasonografów Hielscher typu sondowego, a także wielopróbkowych jednostek sonikacyjnych VialTweeter i UIP400MTP do codziennego przygotowywania próbek w laboratoriach biologicznych, biochemicznych, medycznych i klinicznych. Inteligentne oprogramowanie i kontrola temperatury procesorów Hielscher, temperatura jest niezawodnie kontrolowana i unika się degradacji próbki wywołanej ciepłem. Ultradźwiękowe przygotowanie próbek z rozwiązaniami ultradźwiękowymi Hielscher zapewnia wysoce wiarygodne i powtarzalne wyniki!
Dowiedz się więcej o wysokowydajnej sonikacji za pomocą sonikatora wielodołkowego UIP400MTP do testów!
Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!
Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe do mieszania, dyspersji, emulgowania i ekstrakcji na skalę laboratoryjną, pilotażową i przemysłową.
Literatura / Referencje
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Fakty, które warto znać
Jakie są rodzaje testów ELISA?
Istnieje kilka rodzajów testów ELISA, które wyróżniają się zasadą działania. Są one znane jako bezpośredni test ELISA, pośredni test ELISA, test kanapkowy ELISA, konkurencyjny test ELISA i odwrotny test ELISA. Poniżej przedstawiamy przegląd różnych typów testów ELISA oraz ich główne cechy i różnice.
Test ELISA może być wykonywany w formacie jakościowym lub ilościowym. Wyniki jakościowe zapewniają prosty wynik pozytywny lub negatywny, podczas gdy w ilościowym teście ELISA gęstość optyczna (OD) próbki jest porównywana z krzywą standardową, która jest zwykle seryjnym rozcieńczeniem roztworu docelowej cząsteczki o znanym stężeniu.
Bezpośredni test ELISA
Bezpośredni test ELISA jest najprostszą formą testu Elisa, w której stosuje się tylko przeciwciało pierwotne znakowane enzymem, a przeciwciała wtórne nie są wymagane. Znakowane enzymem przeciwciało pierwotne wiąże się bezpośrednio z celem, tj. antygenem. Buforowany roztwór antygenu jest dodawany do każdej studzienki płytki mikromiareczkowej (zwykle płytki 96-dołkowe, płytki ELISA), gdzie przylega do plastikowej powierzchni poprzez interakcje ładunkowe. Gdy enzym połączony z pierwotnym przeciwciałem reaguje ze swoim substratem, wytwarza widoczny sygnał, który można zmierzyć za pomocą spektrofotometru, fluorometru lub luminometru.
Pośredni test ELISA
W przypadku pośredniego testu ELISA wymagane jest zarówno przeciwciało pierwotne, jak i przeciwciało wtórne. Jednak w przeciwieństwie do bezpośredniego testu ELISA, nie przeciwciało pierwotne, ale przeciwciało wtórne jest znakowane enzymem. Antygen jest unieruchamiany na płytce dołkowej i wiązany przez przeciwciało pierwotne. Następnie znakowane enzymem przeciwciało wtórne wiąże się z przeciwciałem pierwotnym. Wreszcie, enzym związany z przeciwciałem wtórnym reaguje ze swoim substratem, wytwarzając widoczny sygnał, który można wykryć.
Test kanapkowy ELISA
Podczas gdy w bezpośrednich i pośrednich testach ELISA antygen jest unieruchomiony i powleczony na powierzchni płytki dołkowej, w kanapkowym teście ELISA przeciwciało jest unieruchomione na plastikowej powierzchni płytki ELISA. Unieruchomione przeciwciała w kanapkowym teście ELISA są znane jako przeciwciała wychwytujące. Oprócz przeciwciał wychwytujących, w kanapkowym teście ELISA wymagane są również tak zwane przeciwciała wykrywające. Przeciwciała wykrywające obejmują nieznakowane pierwotne przeciwciało wykrywające i znakowane enzymem wtórne przeciwciało wykrywające.
Stopniowo, antygen będący przedmiotem zainteresowania wiąże się z przeciwciałem wychwytującym unieruchomionym na płytce. Następnie pierwotne przeciwciało wykrywające wiąże się z antygenem. Następnie wtórne przeciwciało wykrywające wiąże się z pierwotnym przeciwciałem wykrywającym. W ostatnim etapie reakcji enzym reaguje ze swoim substratem, wytwarzając widoczny sygnał, który można wykryć optycznie.
Konkurencyjny test ELISA
Konkurencyjny test ELISA, znany również jako test ELISA z inhibicją, jest najbardziej złożonym typem testu ELISA, ponieważ wymaga użycia antygenu inhibitorowego. Każdy z trzech formatów, bezpośredni, pośredni i kanapkowy ELISA, można dostosować do konkurencyjnego formatu ELISA. W konkurencyjnym teście ELISA antygen inhibitorowy i antygen będący przedmiotem zainteresowania konkurują o wiązanie z pierwotnym przeciwciałem.
W przypadku konkurencyjnego testu ELISA nieznakowane przeciwciało jest inkubowane w obecności antygenu, tj. próbki. Związane kompleksy przeciwciało/antygen są następnie dodawane do studzienki pokrytej antygenem.
Płytka jest płukana, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Konkurencyjny test ELISA zawdzięcza swoją nazwę temu, że im więcej antygenu znajduje się w próbce, tym więcej powstaje kompleksów antygen-przeciwciało. Oznacza to, że jest mniej niezwiązanych przeciwciał dostępnych do wiązania się z antygenem w studzience, a antygeny muszą konkurować o dostępne przeciwciało. Dodawane jest przeciwciało drugorzędowe, pasujące do przeciwciała pierwszorzędowego. To drugie przeciwciało jest związane z enzymem. Po dodaniu substratu pozostałe enzymy wytwarzają sygnał chromogenny lub fluorescencyjny.
W tym momencie reakcja jest zatrzymywana, aby uniknąć ostatecznego nasycenia sygnału.
Niektóre konkurencyjne zestawy ELISA zawierają antygen związany z enzymem zamiast przeciwciała związanego z enzymem. Znakowany antygen konkuruje o miejsca wiązania pierwotnego przeciwciała z antygenem próbki (nieznakowanym). Im mniej antygenu w próbce, tym więcej znakowanego antygenu jest zatrzymywane w studzience i tym silniejszy jest sygnał.
Odwrotny test ELISA
Odwrócony test ELISA nie wykorzystuje płytek ze studzienkami, ale pozostawia antygeny zawieszone w płynie testowym. Odwrócony test ELISA mierzy ilość związanego przeciwciała poprzez antygen. Został on opracowany specjalnie w celu wykrycia i zbadania białka otoczki wirusa Zachodniego Nilu oraz sposobu, w jaki jest on w stanie znaleźć przeciwciała specyficzne dla wirusa.
Jakie markery enzymatyczne są używane w testach ELISA?
Poniższa lista zawiera najpopularniejsze markery enzymatyczne stosowane w testach ELISA, które umożliwiają pomiar wyników testu po jego zakończeniu.
- OPD (dichlorowodorek o-fenylenodiaminy) zmienia kolor na bursztynowy w celu wykrycia HRP (peroksydazy chrzanowej), która jest często używana jako sprzężone białko.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyna) zmienia kolor na niebieski podczas wykrywania HRP i zmienia kolor na żółty po dodaniu kwasu siarkowego lub fosforowego.
- ABTS (2,2′-sól [kwasu 3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowego]-diammonium) zmienia kolor na zielony podczas wykrywania HRP.
- PNPP (p-Nitrofenylofosforan, sól disodowa) zmienia kolor na żółty podczas wykrywania fosfatazy alkalicznej.