Białko ultradźwiękowy ekstrakcji z tkanek i kultur komórkowych
- ekstrakcji białek jest podstawowym etapem przygotowania próbki w proteomiki.
- Białka można ekstrahować z tkanki roślinne i zwierzęce, drożdże i mikroorganizmów.
- Sonikacja jest niezawodny i skuteczny sposób ekstrakcji białka daje wysoką wydajność białka w ciągu krótkiego czasu ekstrakcji.
Ekstrakcja białka z tkanek i komórek
ekstrakcji białka z hodowli tkanek lub komórek jest podstawowym etapem przygotowania próbki, która jest wykonywana w wielu biochemicznych i technik analitycznych, takich jak ELISA PAGE western blotSpektrometria masowa, lub oczyszczania białek. Ultradźwiękowy uszkodzenia komórek lizy i ekstrakcji jest precyzyjnie kontrolowana techniki w celu zapewnienia wysokiej wydajności białka.
ekstrakcji białka z tkanki zwierzęcej
W celu przygotowania pełnowymiarowych tkanek (np. Nerek, serca, płuc, mięśni itp.), Tkankę należy wypreparować na bardzo małe kawałki za pomocą czystych narzędzi, najlepiej na lód i tak szybko jak to możliwe, aby zapobiec degradacji przez proteazy (np. bufor do lizy, taki jak RIPA lub hipotoniczny bufor do lizy zawierający koktajl inhibitora proteazy i fosfatazy). Po sekcji, próbkę zanurza się w ciekłym azocie, aby zatrzymać zamrożenie. Próbkę można przechowywać w temperaturze -80 ° C do późniejszego użycia lub pozostawić na lodzie do natychmiastowej homogenizacji. Bezpośrednio przed ekstrakcją ultradźwiękową szybko dodaje się lodowaty bufor do lizy (z inhibitorami proteazy DTT, leupeptyną i aprotyniną) do probówki (na ~ 10 mg tkanki zaleca się około 600 μl buforu). Około. Zaleca się 20-60 mg tkanki na próbówkę.
Ultradźwiękowy homogenizacji, rozpad i ekstrakcję prowadzi się za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego, takie jak UP200Ht lub UP200St, Wyposażony w sonotrodę mikro czubka. Sonikacja czas jest 60-90 sek. w ultradźwiękowej cyklu obróbki 15 sekund. sonikacji i 10 sek. czas odpoczynku. Próbka powinna być przechowywana w lodzie przez cały czas.
Po ultradźwiękowym homogenizacji / ekstrakcji, lizat wiruje się w 27,000g ok. 20 minut. Następnie supernatant zbiera się, tak, że stężenie białka może być określona za pomocą oznaczenia białka, takich jak Pierce do oznaczania białka BCA.
Ekstrakcja białka ultradźwiękowego z komórek za pomocą UP200St
ekstrakcji białek z surowicy krwi
Do jednorodnej mieszaniny w surowicy krwi i w buforze fosforanowym, próbkę wiruje się zanim ultradźwiękowego lizy komórek. Do ultradźwiękowego lizy, próbkę poddaje się działaniu ultradźwięków w ultradźwiękowym laboratoryjnym homogenizatorze takie jak UP100H 8 cykli w 20% amplitudy dla cykli co 5 sekund, a 15 sekund przerwy. Sonocation przeprowadza sonicationg cyklicznie i umieszczając próbkę na lodzie, dzięki czemu unika się przegrzanie i degradacji termicznej próbki. Ponieważ surowica zawiera dużą ilość białek o wysokiej masie cząsteczkowej (takie jak albumina, alfa-1 antytrypsyny, transferyna haptoglobulin, immunoglobulinę G i immunoglobuliny A), które mają wpływ na rozdzielenie białek o niskiej masie cząsteczkowej, podczas IEF, zaleca się, aby ich wyczerpać z surowicy stosując kolumnę niszczenia.
ekstrakcji białka z tkanki roślinnej
Świeże, miękkie tkanki roślinnej, np mech itp, mogą być łatwo przerwane przez zwykłe umieszczenie posiekaną próbki materiału w buforze do lizy ultradźwięków. Twardy, ligenous tkanki roślin, takie jak nasiona, igły jodły itp należy suchego podłoża. Niektóre materiały twarde, zdrewniałe rośliny muszą być zamrożone i mielono w ciekłym azocie, ekstrahowano ultradźwięków. Do zawiesiny hodowli komórek roślinnych, na działanie ultradźwięków pomiędzy 30 i 150 sekund, w buforze do lizy jest przeważnie niewystarczające. Twardszy materiał, taki jak nasiona dyni wymagają bardziej intensywnej sonikacji, jak opisano poniżej.
Protokół do ekstrakcji ultradźwiękowej albuminy z nasion dyni
Do ultradźwiękowego ekstrakcji białka albuminy z drobno zmielony proszek z nasion dyni 10 g odtłuszczonego proszku z nasion dyni i 100 ml dejonizowanej wody jako rozpuszczalnika, dodaje się 250 ml szklanej zlewki. Ekstrakcja białka składa się w dwóch etapach: Po pierwsze, próbkę poddaje się działaniu ultradźwięków z sondą typu ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) z zamontowanym sonotrody S24d7. Zlewkę szklaną umieszcza się w zimnej łaźni wodnej w czasie ultradźwiękowego homogenizacji. The ustawienie ultrasonicator UP400St dzięki podłączanemu czujnikowi temperatury temperatura próbki jest zawsze utrzymywana poniżej 30 ° C. Poprzez dokładną kontrolę temperatury podczas sonikacji unika się denaturacji albuminy. Po drugie, ekstrakcję przeprowadzono za pomocą miksera z szybkością 200 obrotów na minutę iw temperaturze 30 ° C. Następnie zlewkę przenosi się do wytrząsarki termostatycznej. Globulę usuwa się za pomocą dializy z wodą destylowaną. Po usunięciu globuliny można pobrać próbkę białka w celu oznaczenia profilu albuminy, a następnie dostosować ją do pI = 3,0, używając 0,1 M HCl do koagulacji albuminy. Fazę stałą oddzielono przez odwirowanie przy 5000 g, 20 ° C i ponownie rozpuszczono w dejonizowanej wodzie. Krążenie albuminowe wykonuje się dwukrotnie w celu zwiększenia stosunku białka w koncentracie albuminy.
Ultradźwiękowy ekstrakcji białek o zasadowym pH do wytwarzania koncentratu białkowego z otrąb ryżowych, pokazuje, że ultradźwiękowy leczenie skutkuje wyższą wydajnością białek w znacznie krótszym czasie ekstrakcji – w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ekstrakcji.
VialTweeter dla ultradźwiękami pośredniego.
- szybki
- wysokie wydajności
- wysoce wydajny
- Precyzyjna kontrola nad parametrami
- powtarzalne wyniki
- liniową skalowalność
Przykładowy protokół Przygotowanie funkcjonalnego enzymu iNOS
W celu uzyskania w pełni funkcjonalny enzym iNOS (na przykład w celu badania przesiewowego leków), przy czym zaleca się następującą procedurę: zawiesina komórek powinna znajdować się na lód i sonifikowano ze związkiem UP100H przy amplitudzie 10 | im w trybie cyklu 5 s. sonikacji i 25 sek. spocząć na lodzie. Procedurę należy powtarzać ok. 3 razy. Czas odpoczynku pomiędzy cyklami sonikacji zmniejsza wzrost temperatury, a tym samym do zmniejszenia ryzyka denaturacji.
Ultradźwiękowy Protein rozpuszczający
Sonikacja może przyspieszyć proces rozpuszczania białek, które zwykle wymagają kilku godzin. W celu uniknięcia przegrzania próbki i zapobiegać degradacji białka i modyfikacje w roztworach zawierających mocznik, ultradźwiękowe pęka nie powinno trwać dłużej niż kilka sekund.
Ogólne instrukcje
Kontrola temperatury: W celu zapewnienia wysokiego uzysku białka bez denaturacji termicznej, temperaturę podczas ekstrakcji musi być kontrolowane. state-of-art homogenizatory ultradźwiękowe Hielscher za – zwany także ultradźwiękowy rozsadzający lub sonificator – są dokładnie kontrolowany. Pochodzą one z czujnikiem temperatury wtykane. W opcji Ustawienie ultradźwiękowy homogenizator, temperatura maksymalna może być ustawiona. Gdy to maksymalna temperatura jest osiągnięta, ultrasonicator zatrzymuje się automatycznie aż oziębieniu próbki.
Bufor: Wyborem odpowiedniego bufora i odpowiedniej objętości buforu wynosi od tkanki dla tkanki, która musi być wzorzysty, przez badania metodą prób i błędów.
Izolacja / Oczyszczanie: lizaty białkowe mogą zawierać nadmiar biomolekuł, takich jak DNA lub węglowodanów, które mogą być usunięte przez strącanie białka (kwas trójchlorooctowy, deoksycholanu) lub wymianie buforu.
Chittapalo i Noomhorm (2009) podali, że wydajność białka wzrósł z użyciem ultradźwięków i, że ultradźwiękowy procesu homogenizacji tkanki i rozpadu może poprawić istniejące procesy ekstrakcji znacznie – umożliwienie nowych handlowych możliwości wydobywczych.
Ultradźwiękowy homogenizator tkankowy UP200St dla wydajnej ekstrakcji białek
kontrola przeglądarka do precyzyjnego działania i monitorowanie procesu sonikacyjnym
Sprzęt ultradźwiękowy dla Protein Extraction
Hielscher Ultrasonics oferują szeroki zakres homogenizatorów ultradźwiękowych do dezintegracji komórek, tkanek, bakterii, mikroorganizmów, i drożdże, zarodniki.
Hielscher ultrasonicators laboratoryjne są potężne i łatwe w obsłudze. Zbudowany do pracy 24/7, są one zaprojektowane jako solidnych i wydajnych urządzeń laboratoryjnych i ławki-top. Dla wszystkich urządzeń, produkcja energii i amplituda może być precyzyjnie kontrolowany. Szeroka gama Wyposażenie otwiera dalsze opcje konfiguracji. Urządzenia elektroniczne, takie jak VialTweeter, UP200Ht, UP200St, i UP400St posiada zintegrowany regulator temperatury oraz wbudowaną kartę SD do automatycznego zapisu danych.
Dla pośrednich, zanieczyszczenia krzyżowego-wolne i jednoczesnej ultradźwiękami wielu próbek, oferujemy VialTweeter lub ultradźwiękowy cuphorn.
W zależności od aplikacji, materiałów i objętości próbki, będziemy polecić najbardziej odpowiednią konfigurację dla przygotowania próbki. Skontaktuj się z nami!
Literatura / Referencje
- Chittapalo T Noomhorm A (2009): ultradźwiękowe wspomaga ekstrakcję alkaliczną białka z odtłuszczonych otrębów ryżowych i właściwości koncentratów białkowych. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
- Simoes André E.S:; Pereira, Dianę M.; Amaral, Joan.; Nunes Ana, M.; Gomes, Sofia E.; Roberts, Peter M.; Lo Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Sterować Clifford. J; Thibodeau Stephen C,; Borralho Peter M.; Rodrigues Cecilia M. P. (2013): skuteczne odzyskiwanie białek z wielu próbek źródła po Trizol lub Trizol LS ekstrakcji RNA i długotrwałego przechowywania. BMC Genomics, 2013, 14: 181.
Fakty Warto wiedzieć
proteomiki
Proteomiki jest dziedziną badań, które bada białka i proteomu. Białka fullfil szeroki wachlarz funkcji życiowych w organizmach. Proteomie jest cały zestaw białek wyrażanych przez genomu komórki, tkanki lub organizmu, w określonym czasie. Proteomie zależy od wymagań czasowych i oryginalny, czy naprężeń, że komórka lub organizm ulega. Bardziej szczegółowo, jest zestawem wyrażanych białek danego rodzaju komórki lub organizmu, w danym momencie, w określonych warunkach. Termin ten jest mieszanką białek i genomu. Proteomiki jest badanie proteomie.
Białko
Białka są są duże biomolekuł, tak zwane makrocząsteczki – które składają się z jednego lub więcej długich łańcuchów reszt aminokwasowych. Białka są obecne we wszystkich organizmach zarówno pochodzenia roślinnego, jak i zwierzęcego i mają kluczowe znaczenie dla większości funkcji biologicznych. Ponieważ białka zawierają wiele informacji biologicznych, są one ekstrahowane do celów analitycznych, np. Do badań proteomicznych. Najważniejszą funkcją wykonywaną przez białka są: kataliza reakcji metabolicznych, replikacja DNA, reakcja na bodźce i transport cząsteczek z jednego miejsca do drugiego. Białka różnią się od siebie przede wszystkim sekwencją aminokwasów, która jest podyktowana sekwencją nukleotydową ich genów i która zazwyczaj powoduje fałdowanie białka w specyficzną trójwymiarową strukturę, która determinuje jego aktywność. Białka są – Poza peptydów – jeden z kluczowych składników żywności. Dlatego proteomiki jest potężnym narzędziem do nauki o żywności w celu optymalizacji procesów, bezpieczeństwa żywności oraz ocenę stanu odżywienia.
żel do elektroforezy
Elektroforeza w żelu jest głównym sposobem rozdzielania i analizy makrocząsteczek, takich jak DNA, RNA i białek, jak również ich fragmentów, w zależności od ich wielkości i ładunku. Jest on stosowany w chemii klinicznej do oddzielenia białek o zmianę i / lub wielkości (IEF agarozowym w istocie rozmiar niezależnie) w biochemii, biologii molekularnej i proteomiką w celu oddzielenia mieszanych populacji fragmentów DNA i RNA o długości w celu oszacowania wielkości DNA oraz fragmenty RNA lub w celu oddzielenia białek od ładunku.
Hodowle komórkowe
kultura komórek jest sterowany proces wzrostu, w którym komórki hoduje się w warunkach kontrolowanych. Warunki hodowli komórek są różne dla każdego typu komórek. Na ogół, środowisko hodowli komórek składa się z odpowiedniego pojemnika (na przykład na płytkę Petriego) z podłoża lub nośnika, który dostarcza niezbędnych składników odżywczych (aminokwasy, węglowodany, witaminy, sole mineralne), czynniki wzrostu, hormony i gazów (CO2The2) I reguluje środowisko fizyko-chemiczną (bufor pH, ciśnienie osmotyczne, temperatura). Większość komórek potrzebują powierzchni lub sztucznym podłożu, podczas gdy inne hodowle komórkowe mogą być uprawiane darmo pływające w pożywce hodowlanej (hodowli w zawiesinie, zawiesina komórek).
Masa hodowli linii komórek zwierzęcych są stosowane w przemysłowej produkcji szczepionek wirusowych i innych produktów pochodnych na drodze biotechnologicznej. Ludzkie komórki macierzyste są hodowane w celu zwiększenia liczby komórek i różnicowanie komórek w wielu typach komórek somatycznych w celach transplantacyjnych.
Próbki tkanek
Tkankę określenie opisuje komórkowy produkt pośredni, w którym materiał komórkowy znajduje się na poziomie organizacyjnym między komórkami i pełnego narządu. W tkance podobnych komórek, z tego samego pochodzenia, które razem wykonywania określonych funkcji są zmontowane. Przez funkcjonalnej grupowania wielu tkanek, powstają złożone struktury narządów.
Tkankę pobrano próbki do badań biologii, histologii / histopatologii, parazytologii, biochemii, immunohistochemię, jak również hodowlę i wyodrębnić DNA. można go odróżnić od zwierząt (pola: tkanek ssaków) i tkanki roślinnej. tkanek zwierzęcych są pogrupowane w cztery podstawowe typy łącznej, mięśni, układu nerwowego, i tkanki nabłonkowej. tkanka roślinna jest podzielony na trzech następujących systemów tkanki: naskórka, tkankę gruntu i tkanki naczyniowej.
Próbki tkanki można otrzymać z części zwierząt i roślin, na przykład kości, mięśni, liście, itd.
Płyny ustrojowe
Krew, surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, ślina i płyn stawowy są płyny ustrojowe, które oferują doskonałe źródło diagnostycznie istotnych informacji. Dlatego wyrafinowane przygotowanie próbek do analizy płynów ciała jest bardzo ważne. Pierwsza trudność związana jest z szerokim zakresem dynamiki składników obecnych w płynach ustrojowych.
Oznaczanie stężenia białek
Próba Bradforda, test Lowry i testu z kwasem bicynchoninowym (BCA) są powszechne testy w celu określenia stężenia protein. Albumina surowicy bydlęcej (BSA) jest jednym z najczęściej stosowany standard białka.
Bufor do lizy
Bufor do lizy muszą być wybrane zgodnie z materiału komórki lub tkanki (tkanek, hodowli roślin, bakterii, grzybów, itd.) i tego, czy komórki są w konstrukcji i rodzaju konstrukcji. Szeroki zakres buforów do lizy do ekstrakcji białek błony i organelle są formułowane z jednym lub więcej detergentów. Detergent jest zwykle wybrany przez badań prób i błędów lub – Jeśli możliwe – według istniejącego protokołu ekstrakcji białek. Detergent może być kompatybilny ze źródłem tkanki, jak i białek. Na ogół, najłagodniejsze detergentu, który działa dla określonej tkanki / białko jest wybrane w celu utrzymania maksymalnej funkcjonalności ekstraktu. Ponadto, w przypadku ekstrakcji błon i organelli, łagodny detergent trzyma membranę nienaruszone. Powszechnie stosowane detergenty buforów do lizy są najczęściej niejonowe lub obojniaczojonowe, np CHAPS, deoksycholan Triton ™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na przykład, tkanki, takie jak mózg, jelito, wątroba, nerka, śledziona etc. można łatwo buforowany RIPA – Jednakże inhibitory proteazy i DTT (na przykład przez elektroforezę w żelu) powinny być uwzględnione.
Bufor do lizy tkanki mięśni szkieletowych (lodowatego): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glicerol, 1 mM EDTA 1 mM ditiotreitolu z dodatkiem inhibitorów proteazy i fosfatazy koktajl
Tabela typowymi buforami, a ich zakres pH. Na ogół, te bufory zwykle stosuje się w stężeniu 20-50 mM.
| Bufor | Zakres pH |
|---|---|
| Kwas cytrynowy – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Cytrynianu sodowego – Kwas cytrynowy | 3.0 – 6.2 |
| Octan sodowy – kwas octowy | 3.6 – 5.6 |
| sól sodowa Kwas Kakodylowy – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MY – NaOH | 5.6 – 6,8 |
| Diwodorofosforan sodowy – wodorofosforan disodu | 5.8 – 8.0 |
| imidazolu – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| chlorowodorek trietanoloamina – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| tetraboran sodu – kwas borowy | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glicyna – NaOH | 8.6 – 10,6 |
Większość bufory pH wykazują zależność od temperatury. Jest to szczególnie prawdziwe w odniesieniu do buforem Tris. PKa od 8.06 zmienia się w 25 ° C do 8,85 w temperaturze 0 ° C.
(PH i pKa buforu: pH mierzy się stężenie jonów wodoru w roztworze wodnym pKa (= dysocjacji kwasowej) jest powiązany, ale konkretny środek, na tym, że przyczynia się do przewidzenia, jak cząsteczka będzie działać w określonej. wartość PH.)
TRIzolu
TRIzolu jest roztworem chemicznym do ekstrakcji RNA / DNA / białka podczas ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny-fenol-chloroform. Zastosowanie ultradźwięków wspomaganego Trizol Wyniki ekstrakcji w wysokiej DNA, RNA, białek i plonów z tej samej próbki i przewyższa co inne metody ekstrakcji.