Ultradźwiękowa ekstrakcja białek z tkanek i hodowli komórkowych
- Ekstrakcja białek jest niezbędnym etapem przygotowania próbek w proteomice.
- Białka można ekstrahować z tkanek roślinnych i zwierzęcych, drożdży oraz mikroorganizmów.
- Sonikacja jest niezawodną, wydajną metodą ekstrakcji białek, zapewniającą wysoki uzysk białek w krótkim czasie ekstrakcji.
Ekstrakcja białek z tkanek i komórek
Ekstrakcja białek z tkanek i komórek hodowanych jest niezbędnym etapem przygotowania próbek, wykonywanym w ramach wielu technik biochemicznych i analitycznych, takich jak ELISA, PAGE, Western blotting, spektrometria mas lub oczyszczanie białek. Ultradźwiękowe rozbijanie komórek, liza i ekstrakcja stanowią nietermiczną technikę, którą można precyzyjnie kontrolować, aby zapewnić wysoki uzysk białek.
Ekstrakcja białek z komórek za pomocą sondy ultradźwiękowej UP200St
- Szybkość
- Wysoki uzysk
- Wysoka wydajność
- Precyzyjna kontrola parametrów
- Powtarzalne wyniki
- Liniowa skalowalność
Ogólne instrukcje dotyczące ultradźwiękowej lizy i ekstrakcji białek
- Kontrola temperatury: Aby zapewnić wysoki uzysk białek bez denaturacji termicznej, należy kontrolować temperaturę podczas ekstrakcji. Najnowocześniejsze homogenizatory ultradźwiękowe Hielscher – nazywane również dezintegratorami ultradźwiękowymi lub sonikatorami – umożliwiają precyzyjną kontrolę. Są wyposażone w podłączany czujnik temperatury. W ustawieniach homogenizatora ultradźwiękowego można określić maksymalną temperaturę. Po osiągnięciu tej maksymalnej temperatury sonikator automatycznie zatrzymuje się do czasu schłodzenia próbki.
- Bufor: Dobór odpowiedniego buforu i jego właściwej objętości zależy od rodzaju tkanki i wymaga ustalenia metodą prób i błędów.
- Izolacja / oczyszczanie: Lizaty białkowe mogą zawierać nadmiar biomolekuł, takich jak DNA lub węglowodany, które można usunąć przez wytrącanie białek (deoksycholan–kwas trichlorooctowy) lub wymianę buforu.
Chittapalo i Noomhorm (2009) wykazali w swoim badaniu, że zastosowanie sonikacji zwiększyło uzysk białek oraz że proces ultradźwiękowej homogenizacji i lizy tkanek może znacząco usprawnić istniejące procesy ekstrakcji – otwierając nowe możliwości ekstrakcji na skalę komercyjną.
Ultradźwiękowy CupHorn do jednoczesnego, wysoce skutecznego przygotowania wielu próbek w tych samych warunkach na potrzeby izolacji białek i fragmentacji DNA.
Ekstrakcja białek z tkanek zwierzęcych
Podczas przygotowywania tkanki w całości (np. nerki, serca, płuca, mięśnia itp.) należy pociąć ją czystymi narzędziami na bardzo małe kawałki, najlepiej na lodzie i możliwie najszybciej, aby zapobiec degradacji przez proteazy (np. bufor do lizy, taki jak RIPA, lub hipotoniczny bufor do lizy zawierający mieszaninę inhibitorów proteaz i fosfataz). Po pocięciu próbkę zanurza się w ciekłym azocie w celu błyskawicznego zamrożenia. Próbkę można przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego użycia lub trzymać na lodzie w celu natychmiastowej homogenizacji. Bezpośrednio przed ekstrakcją ultradźwiękową do probówki z próbką szybko dodaje się lodowato zimny bufor do lizy (z inhibitorami proteaz: DTT, leupeptyną i aprotyniną) (na ~10 mg tkanki zaleca się około ~600 μL buforu). Zaleca się około 20–60mg tkanki na probówkę z próbką.
Ultradźwiękową homogenizację, lizę i ekstrakcję przeprowadza się za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego, takiego jak UP100H lub UP200Ht, wyposażonego w sonotrodę z mikrokońcówką. Czas sonikacji wynosi 60–90 sec. w trybie cyklicznym: 15 sec. sonikacji i 10 sec. przerwy. Próbkę należy przez cały czas utrzymywać w lodzie.
Po ultradźwiękowej homogenizacji / ekstrakcji lizat wiruje się przy 27 000g przez około 20 min. Następnie zbiera się supernatant, aby określić stężenie białek za pomocą testu oznaczania białka, takiego jak test BCA firmy Pierce.
Ekstrakcja białek z surowicy krwi
Aby uzyskać jednorodną mieszaninę surowicy i buforu fosforanowego, próbkę najpierw miesza się na mieszadle wirowym przed ultradźwiękową lizą komórek. W celu przeprowadzenia lizy ultradźwiękowej próbkę poddaje się sonikacji za pomocą laboratoryjnego homogenizatora ultradźwiękowego, takiego jak UP100H, przez 8 cykli przy amplitudzie 20%, przy czym każdy cykl obejmuje 5 sekund pracy i 15 sekund przerwy. Ekstrakcję białek przeprowadza się przez sonikację w cyklach (tryb pulsacyjny) i umieszczenie próbki na lodzie, aby uniknąć przegrzania oraz degradacji termicznej próbki. Ponieważ surowica zawiera dużą ilość białek o wysokiej masie cząsteczkowej (takich jak albumina, α1-antytrypsyna, transferyna, haptoglobulina, immunoglobulina G i immunoglobulina A), które zakłócają rozdział białek o niskiej masie cząsteczkowej podczas IEF, zaleca się usunięcie ich z surowicy za pomocą kolumny do usuwania tych białek.
Ekstrakcja białek z tkanek roślinnych
Świeżą, miękką tkankę roślinną, np. mech itp., można łatwo rozbić, umieszczając rozdrobniony materiał próbki w buforze do lizy i poddając go sonikacji. Twarde, zdrewniałe tkanki roślinne, takie jak nasiona, igły jodły itp., należy mielić na sucho. Niektóre twarde, zdrewniałe materiały roślinne muszą zostać zamrożone i zmielone w ciekłym azocie przed ekstrakcją przez sonikację. W przypadku zawiesin hodowli komórek roślinnych zazwyczaj wystarcza obróbka ultradźwiękowa trwająca od 30 do 150 sekund w buforze do lizy. Twardszy materiał, taki jak nasiona dyni, wymaga intensywniejszej sonikacji, zgodnie z opisem poniżej.
Protokół ultradźwiękowej ekstrakcji albuminy z nasion dyni
W celu ultradźwiękowej ekstrakcji albuminy z drobno zmielonych nasion dyni do szklanej zlewki o pojemności 250mL dodaje się 10 g odtłuszczonego proszku z nasion dyni i 100 mL wody dejonizowanej jako rozpuszczalnika. Ekstrakcja białek składa się z dwóch etapów: najpierw próbkę poddaje się sonikacji za pomocą sonikatora sondowego UP400St (400W, 24kHz) wyposażonego w sonotrodę S24d7. Podczas homogenizacji ultradźwiękowej szklaną zlewkę umieszcza się w zimnej łaźni wodnej. Podłączany czujnik temperatury i ustawienia kontroli temperatury sonikatora UP400St zapewniają, że temperatura próbki jest zawsze utrzymywana poniżej 30°C. Precyzyjna kontrola temperatury podczas sonikacji pozwala uniknąć denaturacji albuminy. W drugim etapie ekstrakcję przeprowadzono za pomocą mieszadła przy prędkości 200 rpm i temperaturze 30°C. Następnie zlewkę przenosi się do wytrząsarki termostatycznej. Globulinę usuwa się przez dializę z użyciem wody destylowanej. Po usunięciu globuliny można pobrać próbkę ekstraktu białkowego w celu określenia profilu albuminy, a następnie ekstrakt doprowadza się do pI=3,0 za pomocą 0,1 M HCl w celu koagulacji albuminy. Fazę stałą oddziela się przez wirowanie przy 5000g i 20°C, po czym ponownie rozpuszcza w wodzie dejonizowanej. Koagulację albuminy przeprowadza się dwukrotnie, aby zwiększyć udział białka w koncentracie albuminy.
Ultradźwiękowa alkaliczna ekstrakcja białek w celu przygotowania koncentratu białkowego z otrąb ryżowych pokazuje, że obróbka ultradźwiękowa zapewnia wyższy uzysk białek w znacznie krótszym czasie ekstrakcji – w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ekstrakcji.
Protokół przygotowania próbki funkcjonalnego enzymu iNOS
Aby uzyskać w pełni funkcjonalny enzym iNOS (np. do badań przesiewowych leków), zaleca się następujący protokół: zawiesinę komórek należy umieścić na lodzie i poddać sonikacji za pomocą UP100H przy amplitudzie 10µm w trybie cyklicznym obejmującym 5 sec. sonikacji i 25 sec. przerwy na lodzie. Procedurę należy powtórzyć około 3 razy. Przerwa między cyklami sonikacji ogranicza wzrost temperatury, a tym samym zmniejsza ryzyko denaturacji.
Ultradźwiękowa solubilizacja białek
Sonikacja może przyspieszyć proces solubilizacji białek, który zwykle wymaga kilku godzin. Aby nie przegrzać próbki oraz zapobiec degradacji i modyfikacjom białek w roztworach zawierających mocznik, impulsy ultradźwiękowe nie powinny trwać dłużej niż kilka sekund.
Sonikator UP200Ht z mikrokońcówką S26d2 o średnicy 2mm do sonikacji małych próbek.
Urządzenia ultradźwiękowe do ekstrakcji białek
Hielscher Ultrasonics oferuje szeroką gamę homogenizatorów ultradźwiękowych do dezintegracji komórek, tkanek, bakterii, mikroorganizmów, drożdży i zarodników.
Laboratoryjne sonikatory Hielscher mają dużą moc i są łatwe w obsłudze. Przystosowane do pracy 24/7, zostały zaprojektowane jako wytrzymałe i wydajne urządzenia laboratoryjne do ustawienia na blacie. We wszystkich urządzeniach można precyzyjnie kontrolować energię wyjściową i amplitudę. Szeroka gama akcesoriów zapewnia dodatkowe możliwości konfiguracji. Cyfrowe sonikatory, takie jak VialTweeter, UP200Ht, UP200St i UP400St, mają zintegrowaną kontrolę temperatury oraz wbudowaną kartę SD do automatycznego zapisu danych.
Do pośredniej, jednoczesnej sonikacji wielu próbek bez zanieczyszczenia krzyżowego oferujemy VialTweeter lub ultradźwiękowy CupHorn.
Poniższa tabela przedstawia przegląd naszych sonikatorów do przygotowania próbek, rozbijania komórek i ekstrakcji. Kliknij typ urządzenia, aby uzyskać więcej informacji o każdym homogenizatorze ultradźwiękowym. Nasz dobrze wyszkolony personel techniczny z wieloletnim doświadczeniem chętnie pomoże Ci wybrać sonikator najlepiej dostosowany do przygotowania Twoich próbek!
| Objętość partii | Natężenie przepływu | Zalecane urządzenia |
|---|---|---|
| do 10 fiolek lub probówek | nie dotyczy | VialTweeter |
| płytki wielodołkowe / mikrotitracyjne | nie dotyczy | UIP400MTP |
| wiele probówek / naczyń | nie dotyczy | CupHorn |
| od 1 do 500mL | od 10 do 200mL/min | UP100H |
| od 10 do 1000mL | od 20 do 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| od 10 do 2000mL | od 20 do 400mL/min | UP400St |
W zależności od zastosowania, materiału i objętości próbki zalecimy konfigurację najlepiej dostosowaną do przygotowania Twoich próbek. Skontaktuj się z nami już dziś!
Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!
Cyfrowe sonikatory Hielscher oferują zdalne sterowanie przez przeglądarkę i automatyczne rejestrowanie danych na zintegrowanej karcie SD.
VialTweeter do sonikacji pośredniej.
Warto wiedzieć
Proteomika
Proteomika jest dziedziną badań zajmującą się białkami i proteomem. Białka pełnią w organizmach bardzo wiele funkcji niezbędnych do życia. Proteom to cały zestaw białek ulegających ekspresji z genomu lub w komórce, tkance bądź organizmie w określonym czasie. Proteom zmienia się z czasem oraz w zależności od określonych potrzeb lub stresów, którym podlega komórka lub organizm. Dokładniej jest to zestaw białek ulegających ekspresji w danym typie komórki lub organizmie, w danym czasie i w określonych warunkach. Termin ten powstał z połączenia słów „białka” i „genom”. Proteomika zajmuje się badaniem proteomu.
Białko
Białka są dużymi biomolekułami, tak zwanymi makrocząsteczkami – złożonymi z jednego lub kilku długich łańcuchów reszt aminokwasowych. Białka występują we wszystkich organizmach zarówno roślinnych, jak i zwierzęcych, i mają kluczowe znaczenie dla większości funkcji biologicznych. Ponieważ białka zawierają wiele informacji biologicznych, ekstrahuje się je do celów analitycznych, np. do badań proteomicznych. Do najważniejszych funkcji białek należą katalizowanie reakcji metabolicznych, replikacja DNA, odpowiedź na bodźce i transport cząsteczek z jednego miejsca do drugiego. Białka różnią się od siebie przede wszystkim sekwencją aminokwasów, która jest określona przez sekwencję nukleotydową ich genów i zwykle prowadzi do zwijania się białka w określoną strukturę trójwymiarową, decydującą o jego aktywności. Białka są – obok peptydów – jednym z kluczowych składników żywności. Dlatego proteomika jest skutecznym narzędziem w nauce o żywności, służącym do optymalizacji procesów, bezpieczeństwa żywności i oceny wartości odżywczej.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction jest procedurą przedanalityczną służącą do rozdzielania i wstępnego zatężania analitów. W połączeniu z sonikacją ekstrakcję w punkcie zmętnienia można zintensyfikować, dzięki czemu proces staje się wydajniejszy, szybszy i bardziej przyjazny dla środowiska. Przy zastosowaniu sonikacji ekstrakcja w punkcie zmętnienia jest znacznie wydajniejszą metodą przygotowania analitów. Przeczytaj więcej o ekstrakcji w punkcie zmętnienia wspomaganej ultradźwiękami!
Elektroforeza żelowa
Elektroforeza żelowa jest główną metodą rozdzielania i analizy makrocząsteczek, takich jak DNA, RNA i białka, a także ich fragmentów, na podstawie ich wielkości i ładunku. W chemii klinicznej stosuje się ją do rozdzielania białek według ładunku i/lub wielkości (IEF w agarozie, zasadniczo niezależne od wielkości), a w biochemii, biologii molekularnej i proteomice do rozdzielania mieszanej populacji fragmentów DNA i RNA według długości, szacowania wielkości fragmentów DNA i RNA lub rozdzielania białek według ładunku.
Hodowle komórkowe
Hodowla komórkowa jest kontrolowanym procesem wzrostu, w którym komórki są hodowane w kontrolowanych warunkach. Warunki hodowli komórkowej różnią się dla poszczególnych typów komórek. Ogólnie środowisko hodowli komórkowej składa się z odpowiedniego naczynia (np. szalki Petriego) z podłożem lub pożywką; podłoże lub pożywka dostarcza niezbędnych składników odżywczych (aminokwasów, węglowodanów, witamin, składników mineralnych), czynników wzrostu, hormonów i gazów (CO2, O2) oraz reguluje środowisko fizykochemiczne (bufor pH, ciśnienie osmotyczne, temperaturę). Większość komórek wymaga powierzchni lub sztucznego podłoża, natomiast inne hodowle komórkowe można prowadzić z komórkami swobodnie zawieszonymi w pożywce hodowlanej (hodowla zawiesinowa, zawiesina komórek).
Hodowle linii komórek zwierzęcych na dużą skalę są wykorzystywane w przemysłowej produkcji szczepionek wirusowych i innych produktów otrzymywanych biotechnologicznie. Ludzkie komórki macierzyste hoduje się w celu zwiększenia liczby komórek i ich różnicowania w różne typy komórek somatycznych do celów transplantacyjnych.
Próbki tkanek
Termin „tkanka” opisuje pośredni poziom organizacji komórkowej, w którym materiał komórkowy znajduje się między pojedynczymi komórkami a całym narządem. W tkance skupione są podobne komórki o tym samym pochodzeniu, które wspólnie pełnią określoną funkcję. Funkcjonalne połączenie wielu tkanek tworzy złożone struktury narządów.
Tkanki pobiera się do badań w dziedzinie biologii, histologii/histopatologii, parazytologii, biochemii i immunohistochemii, a także do hodowli i ekstrakcji DNA. Można wyróżnić tkanki zwierzęce (podgrupa: tkanki ssaków) i roślinne. Tkanki zwierzęce dzieli się na cztery podstawowe typy: tkankę łączną, mięśniową, nerwową i nabłonkową. Tkanki roślinne dzieli się na następujące trzy systemy tkankowe: skórkę, tkanki podstawowe i tkanki przewodzące.
Próbki tkanek można przygotować z części zwierząt lub roślin, np. kości, mięśni, liści itp.
Płyny ustrojowe
Krew, surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, ślina i płyn stawowy to płyny ustrojowe, które stanowią bogate źródło informacji istotnych diagnostycznie. Dlatego ważne jest zaawansowane przygotowanie próbek płynów ustrojowych do analizy. Pierwsza trudność wiąże się z szerokim zakresem dynamicznym stężeń składników obecnych w płynach ustrojowych.
Oznaczanie stężenia białek
Metoda Bradforda, metoda Lowry’ego i metoda z użyciem kwasu bicynchoninowego (BCA) są powszechnie stosowanymi metodami oznaczania stężenia białek. Albumina surowicy bydlęcej (BSA) jest jednym z najczęściej stosowanych wzorców białkowych.
Bufor do lizy
Bufor do lizy należy dobrać odpowiednio do materiału komórkowego lub tkanki (hodowla tkankowa, rośliny, bakterie, grzyby itp.), a także z uwzględnieniem tego, czy komórki tworzą strukturę i jaki jest jej rodzaj. Szeroka gama buforów do lizy służących do ekstrakcji białek, błon i organelli zawiera jeden lub kilka detergentów. Detergent zazwyczaj dobiera się metodą prób i błędów lub – jeśli jest dostępny – zgodnie z istniejącym protokołem ekstrakcji białek. Detergent musi być zgodny z rodzajem tkanki i białkami. Zasadniczo wybiera się najłagodniejszy detergent, który działa w przypadku danej tkanki / białka, aby zachować maksymalną funkcjonalność ekstraktu. Ponadto w przypadku ekstrakcji błon i organelli łagodny detergent zachowuje nienaruszoną błonę. Detergenty powszechnie stosowane w buforach do lizy są przeważnie niejonowe lub obojnacze, np. CHAPS, deoksycholan, Triton™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na przykład tkanki takie jak mózg, wątroba, jelito, nerka, śledziona itp. można po prostu umieścić w buforze RIPA – należy jednak uwzględnić inhibitory proteaz i DTT (np. do elektroforezy żelowej).
Bufor do lizy tkanki mięśni szkieletowych (lodowato zimny): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerolu, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolu, z dodatkiem mieszaniny inhibitorów proteaz i fosfataz
Tabela powszechnie stosowanych buforów i ich zakresów pH. Zasadniczo bufory te są zwykle stosowane w stężeniach 20–50 mM.
| Bufor | Zakres pH |
|---|---|
| Kwas cytrynowy – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Cytrynian sodu – kwas cytrynowy | 3,0 – 6,2 |
| Octan sodu – kwas octowy | 3,6 – 5,6 |
| Sól sodowa kwasu kakodylowego – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Diwodorofosforan sodu – wodorofosforan disodu | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Chlorowodorek trietanoloaminy – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Trycyna – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Tetraboran sodu – kwas borowy | 7,6 – 9,2 |
| Bicyna – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glicyna – NaOH | 8,6 – 10,6 |
W przypadku większości buforów pH zależy od temperatury. Dotyczy to zwłaszcza buforów Tris. Wartość pKa zmienia się z 8,06 w temperaturze 25°C do 8,85 w temperaturze 0°C.
(pH i pKa buforu: pH mierzy stężenie jonów wodorowych w roztworze wodnym. pKa (= stała dysocjacji kwasu) jest powiązaną, lecz bardziej szczegółową miarą, ponieważ pomaga przewidzieć, jak cząsteczka będzie się zachowywać przy określonej wartości pH.)
TRIzol
TRIzol jest roztworem chemicznym stosowanym do ekstrakcji RNA/DNA/białek podczas ekstrakcji z użyciem tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu. Zastosowanie ekstrakcji TRIzol wspomaganej ultradźwiękami zapewnia wysoki uzysk DNA, RNA i białek z tej samej próbki, przewyższając tym samym inne metody ekstrakcji.
Literatura / źródła
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.