Ultradźwiękowa ekstrakcja białek z tkanek i kultur komórkowych
- Ekstrakcja białek jest niezbędnym etapem przygotowania próbki w proteomice.
- Białka mogą być ekstrahowane z tkanek roślinnych i zwierzęcych, drożdży i mikroorganizmów.
- Sonikacja jest niezawodną, wydajną metodą ekstrakcji białek, zapewniającą wysoką wydajność białka w krótkim czasie ekstrakcji.
Ekstrakcja białek z tkanek i komórek
Ekstrakcja białek z tkanek i hodowanych komórek jest niezbędnym etapem przygotowania próbki, który jest wykonywany podczas wielu technik biochemicznych i analitycznych, takich jak ELISA, PAGE, Western blotting, spektrometria masowa lub oczyszczanie białek. Ultradźwiękowe rozbijanie, liza i ekstrakcja komórek jest precyzyjnie kontrolowaną, nietermiczną techniką zapewniającą wysoką wydajność białek.
Ekstrakcja białek z komórek za pomocą sonda ultradźwiękowa UP200St
- Szybki
- wysokie zyski
- Wysoka wydajność
- Precyzyjna kontrola nad parametrami
- powtarzalne wyniki
- liniowa skalowalność
Ogólne instrukcje dotyczące lizy ultradźwiękowej i ekstrakcji białek
- Kontrola temperatury: Aby zapewnić wysoką wydajność białka bez denaturacji termicznej, temperatura podczas ekstrakcji musi być kontrolowana. Najnowocześniejsze homogenizatory ultradźwiękowe firmy Hielscher – zwany również dezintegratorem ultradźwiękowym lub ultrasonifikatorem – są precyzyjnie sterowane. Są one wyposażone w podłączany czujnik temperatury. W opcjach ustawień homogenizatora ultradźwiękowego można ustawić maksymalną temperaturę. Po osiągnięciu tej maksymalnej temperatury ultradźwiękowy homogenizator automatycznie zatrzymuje się, aż próbka ostygnie.
- Bufor: Wybór odpowiedniego buforu i właściwej objętości buforu różni się w zależności od tkanki i musi być ustalony metodą prób i błędów.
- Izolacja / oczyszczanie: Lizaty białkowe mogą zawierać nadmiar biomolekuł, takich jak DNA lub węglowodany, które można usunąć przez wytrącenie białka (kwas dezoksycholanowo-trichlorooctowy) lub wymianę buforu.
Chittapalo i Noomhorm (2009) poinformowali w swoich badaniach, że wydajność białka wzrosła przy użyciu sonikacji i że ultradźwiękowy proces homogenizacji i lizy tkanek może znacznie poprawić istniejące procesy ekstrakcji – umożliwienie nowych komercyjnych możliwości wydobycia.
Ultradźwiękowy CupHorn do jednoczesnego, wysoce wydajnego przygotowania wielu próbek w tych samych warunkach do izolacji białek i fragmentacji DNA.
Ekstrakcja białek z tkanek zwierzęcych
W celu przygotowania całych tkanek (np. nerek, serca, płuc, mięśni itp.), tkanka powinna zostać pocięta na bardzo małe kawałki za pomocą czystych narzędzi, najlepiej na lodzie i tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec degradacji przez proteazy (np. bufor lizujący, taki jak RIPA lub hipotoniczny bufor lizujący zawierający koktajl inhibitorów proteaz i fosfataz). Po sekcji próbka jest zanurzana w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80°C do późniejszego wykorzystania lub przechowywana na lodzie w celu natychmiastowej homogenizacji. Bezpośrednio przed ekstrakcją ultradźwiękową, lodowaty bufor lizujący (z inhibitorami proteazy DTT, leupeptyną i aprotyniną) jest szybko dodawany do próbówki (na ~ 10 mg tkanki zaleca się około ~ 600 μl buforu). Zaleca się około 20-60 mg tkanki na próbówkę.
Homogenizację ultradźwiękową, lizę i ekstrakcję przeprowadza się za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego, takiego jak UP100H lub UP200Ht, wyposażonego w sonotrodę z mikrokońcówką. Czas trwania sonikacji wynosi 60-90 sek. w trybie cyklu ultradźwiękowego 15 sek. sonikacji i 10 sek. czasu spoczynku. Próbka powinna być przechowywana w lodzie przez cały czas.
Po homogenizacji / ekstrakcji ultradźwiękowej lizat odwirowuje się przy 27 000 g przez około 20 minut. Następnie zbierany jest supernatant, dzięki czemu stężenie białka można określić za pomocą testu białkowego, takiego jak test białkowy BCA firmy Pierce.
Ekstrakcja białek z surowicy krwi
W celu uzyskania jednorodnej mieszaniny surowicy i buforu fosforanowego, próbka jest najpierw worteksowana przed ultradźwiękową lizą komórek. W przypadku lizy ultradźwiękowej próbka jest poddawana sonikacji za pomocą ultradźwiękowego homogenizatora laboratoryjnego, takiego jak UP100H, przez 8 cykli przy amplitudzie 20%, dla cykli po 5 sekund włączonych i 15 sekund wyłączonych. Ekstrakcję białek przeprowadza się przez sonikację w cyklach (tryb pulsacyjny) i umieszczenie próbki na lodzie, aby uniknąć przegrzania i degradacji termicznej próbki. Ponieważ surowica zawiera dużą ilość białek o wysokiej masie cząsteczkowej (takich jak albumina, α1-antytrypsyna, transferyna, haptoglobulina, immunoglobulina G i immunoglobulina A), które zakłócają oddzielanie białek o niskiej masie cząsteczkowej podczas IEF, zaleca się ich usunięcie z surowicy za pomocą kolumny zubożającej.
Ekstrakcja białek z tkanek roślinnych
Świeżą, miękką tkankę roślinną, np. mech itp., można łatwo rozbić, po prostu umieszczając posiekany materiał próbki w buforze lizującym do sonikacji. Twarde, rdzenne tkanki roślinne, takie jak nasiona, igły jodły itp. powinny być zmielone na sucho. Niektóre twarde, zdrewniałe materiały roślinne muszą być zamrożone i zmielone w ciekłym azocie przed ekstrakcją za pomocą sonikacji. W przypadku zawiesin hodowli komórek roślinnych wystarczająca jest obróbka ultradźwiękowa trwająca od 30 do 150 sekund w buforze lizującym. Twardsze materiały, takie jak nasiona dyni, wymagają bardziej intensywnej sonikacji, jak opisano poniżej.
Protokół ultradźwiękowej ekstrakcji albuminy z pestek dyni
Do ultradźwiękowej ekstrakcji białka albuminy z drobno zmielonego proszku z pestek dyni, 10 g odtłuszczonego proszku z pestek dyni i 100 ml wody dejonizowanej jako rozpuszczalnika dodaje się do szklanej zlewki o pojemności 250 ml. Ekstrakcja białka składa się z dwóch etapów: Po pierwsze, próbka jest sonikowana za pomocą ultrasonograf sondowy UP400St (400W, 24kHz) wyposażony w sonotrodę S24d7. Szklana zlewka jest umieszczana w zimnej łaźni wodnej podczas homogenizacji ultradźwiękowej. Podłączany czujnik temperatury i ustawienia kontroli temperatury ultrasonografu UP400St zapewniają, że temperatura próbki jest zawsze utrzymywana poniżej 30°C. Dzięki precyzyjnej kontroli temperatury podczas sonikacji unika się denaturacji albuminy. Po drugie, ekstrakcję przeprowadzono za pomocą mieszadła z prędkością 200 obr/min i w temperaturze 30°C. Następnie zlewkę przenosi się do wytrząsarki termostatycznej. Globulina jest usuwana poprzez dializę wodą destylowaną. Po usunięciu globuliny, ekstrakt białkowy może być próbkowany w celu określenia profilu albuminy, a następnie jest dostosowywany do pI=3,0 przy użyciu 0,1 M HCl do koagulacji albuminy. Faza stała jest oddzielana przez odwirowanie przy 5000g, 20°C i ponownie rozpuszczana w wodzie dejonizowanej. Koagulację albumin przeprowadza się dwukrotnie, aby zwiększyć stosunek białek w koncentracie albumin.
Ultradźwiękowa alkaliczna ekstrakcja białka do przygotowania koncentratu białkowego z otrębów ryżowych pokazuje, że obróbka ultradźwiękowa skutkuje wyższą wydajnością białka w znacznie krótszym czasie ekstrakcji. – w porównaniu do konwencjonalnych metod ekstrakcji.
Protokół przygotowania próbki dla funkcjonalnego enzymu iNOS
Aby uzyskać w pełni funkcjonalny enzym iNOS (np. do badań przesiewowych leków), zalecany jest następujący protokół: Zawiesinę komórek należy umieścić na lodzie i poddać sonikacji urządzeniem UP100H przy amplitudzie 10µm w trybie cyklu 5 sek. sonikacji i 25 sek. odpoczynku na lodzie. Procedurę należy powtórzyć ok. 3 razy. Czas odpoczynku pomiędzy cyklami sonikacji zmniejsza wzrost temperatury, a tym samym zmniejsza ryzyko denaturacji.
Ultradźwiękowa solubilizacja białek
Sonikacja może przyspieszyć proces solubilizacji białek, który zwykle wymaga kilku godzin. Aby nie przegrzać próbki i zapobiec degradacji białka i modyfikacji w roztworach zawierających mocznik, ultradźwiękowe wybuchy nie powinny trwać dłużej niż kilka sekund.
Ultradźwiękowy UP200Ht z 2 mm mikrokońcówką S26d2 do sonikacji małych próbek.
Sprzęt ultradźwiękowy do ekstrakcji białek
Hielscher Ultrasonics oferuje szeroką gamę homogenizatorów ultradźwiękowych do dezintegracji komórek, tkanek, bakterii, mikroorganizmów, drożdży i zarodników.
Ultradźwięki laboratoryjne Hielscher są wydajne i łatwe w obsłudze. Zbudowane do pracy w trybie 24/7, zostały zaprojektowane jako solidne i wydajne urządzenia laboratoryjne i stołowe. W przypadku wszystkich urządzeń moc wyjściowa i amplituda mogą być precyzyjnie kontrolowane. Szeroka gama akcesoriów otwiera dalsze opcje konfiguracji. Cyfrowe ultradźwięki, takie jak VialTweeter, UP200Ht, UP200St i UP400St, mają zintegrowaną kontrolę temperatury i wbudowaną kartę SD do automatycznego rejestrowania danych.
Do pośredniej, wolnej od zanieczyszczeń krzyżowych i jednoczesnej sonikacji wielu próbek oferujemy VialTweeter lub ultradźwiękowy CupHorn.
Poniższa tabela zawiera przegląd naszych ultrasonografów do przygotowywania próbek, rozbijania komórek i ekstrakcji. Kliknij na typ urządzenia, aby uzyskać więcej informacji na temat każdego homogenizatora ultradźwiękowego. Nasz dobrze wyszkolony i długoletni personel techniczny chętnie pomoże w wyborze najbardziej odpowiedniego ultrasonografu do przygotowania próbki!
| Wielkość partii | natężenie przepływu | Polecane urządzenia |
|---|---|---|
| do 10 fiolek lub probówek | b.d. | VialTweeter |
| Płytki wielodołkowe / mikrotitracyjne | b.d. | UIP400MTP |
| Wiele rur / zbiorników | b.d. | cuphorn |
| 1 do 500mL | 10-200mL/min | UP100H |
| 10 do 1000 ml | 20 do 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 do 2000mL | 20-400mL/min | UP400St |
W zależności od zastosowania, materiału i objętości próbki, zalecimy najbardziej odpowiednią konfigurację do przygotowania próbki. Skontaktuj się z nami już dziś!
Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!
Cyfrowe ultradźwięki Hielscher są wyposażone w zdalne sterowanie przez przeglądarkę i automatyczne protokołowanie danych na zintegrowanej karcie SD.
VialTweeter do sonikacji pośredniej.
Fakty, które warto znać
proteomika
Proteomika to dziedzina badań zajmująca się białkami i proteomem. Białka pełnią szereg istotnych funkcji w organizmach. Proteom to cały zestaw białek wyrażanych przez genom, komórkę, tkankę lub organizm w określonym czasie. Proteom zmienia się w zależności od czasu i różnych wymagań lub stresów, którym poddawana jest komórka lub organizm. Mówiąc dokładniej, jest to zestaw białek wyrażonych w danym typie komórki lub organizmu, w danym czasie, w określonych warunkach. Termin ten jest połączeniem białek i genomu. Proteomika to badanie proteomu.
białko
Białka to duże biomolekuły, tak zwane makrocząsteczki – które składają się z jednego lub więcej długich łańcuchów reszt aminokwasowych. Białka są obecne we wszystkich organizmach zarówno pochodzenia roślinnego, jak i zwierzęcego i mają kluczowe znaczenie dla większości funkcji biologicznych. Ponieważ białka zawierają wiele informacji biologicznych, są one ekstrahowane do celów analitycznych, np. do badań proteomicznych. Najważniejsze funkcje pełnione przez białka obejmują katalizę reakcji metabolicznych, replikację DNA, odpowiedź na bodźce i transport cząsteczek z jednego miejsca do drugiego. Białka różnią się od siebie przede wszystkim sekwencją aminokwasów, która jest podyktowana sekwencją nukleotydów ich genów i która zwykle powoduje fałdowanie białka w określoną trójwymiarową strukturę, która determinuje jego aktywność. Białka są – oprócz peptydów – jeden z kluczowych składników żywności. Dlatego proteomika jest potężnym narzędziem w nauce o żywności do optymalizacji procesów, bezpieczeństwa żywności i oceny wartości odżywczej.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction to procedura przedanalityczna służąca do oddzielania i wstępnej koncetracji analitów. W połączeniu z ultradźwiękami, ekstrakcja punktu zmętnienia może być zintensyfikowana, dzięki czemu proces jest bardziej wydajny, szybszy i przyjazny dla środowiska. Dzięki ultradźwiękom ekstrakcja punktu zmętnienia jest znacznie bardziej wydajną metodą przygotowania analitu. Przeczytaj więcej o ekstrakcji punktów chmury wspomaganej ultradźwiękami!Elektroforeza żelowa
Elektroforeza żelowa jest główną metodą rozdzielania i analizy makrocząsteczek, takich jak DNA, RNA i białka, a także ich fragmentów, na podstawie ich wielkości i ładunku. Jest stosowana w chemii klinicznej do rozdzielania białek według ładunku i/lub wielkości (agaroza IEF, zasadniczo niezależna od wielkości) oraz w biochemii, biologii molekularnej i proteomice do rozdzielania mieszanej populacji fragmentów DNA i RNA według długości, do szacowania wielkości fragmentów DNA i RNA lub do rozdzielania białek według ładunku.
kultury komórkowe
Hodowla komórkowa to kontrolowany proces wzrostu, w którym komórki są hodowane w kontrolowanych warunkach. Warunki hodowli komórek różnią się w zależności od ich typu. Ogólnie rzecz biorąc, środowisko hodowli komórkowej składa się z odpowiedniego naczynia (np. szalki Petriego) z podłożem lub pożywką, która dostarcza niezbędnych składników odżywczych (aminokwasów, węglowodanów, witamin, minerałów), czynników wzrostu, hormonów i gazów (CO2, O2) i reguluje środowisko fizyko-chemiczne (bufor pH, ciśnienie osmotyczne, temperatura). Większość komórek wymaga powierzchni lub sztucznego podłoża, podczas gdy inne kultury komórkowe mogą być hodowane w stanie swobodnego unoszenia się w pożywce (hodowla zawiesinowa, zawiesina komórkowa).
Masowe hodowle zwierzęcych linii komórkowych są wykorzystywane w przemysłowej produkcji szczepionek wirusowych i innych produktów pochodzenia biotechnologicznego. Ludzkie komórki macierzyste są hodowane w celu zwiększenia liczby komórek i różnicowania komórek w różne typy komórek somatycznych do celów transplantacji.
Próbki tkanek
Termin "tkanka" opisuje komórkową strukturę pośrednią, w której materiał komórkowy znajduje się na poziomie organizacyjnym pomiędzy komórkami a kompletnym narządem. W tkance gromadzone są podobne komórki tego samego pochodzenia, które wspólnie pełnią określoną funkcję. Dzięki funkcjonalnemu zgrupowaniu wielu tkanek powstają złożone struktury narządów.
Tkanki są pobierane do badań z zakresu biologii, histologii/histopatologii, parazytologii, biochemii, immunohistochemii, a także do hodowli i ekstrakcji DNA. Można wyróżnić tkanki zwierzęce (podział: tkanki ssaków) i roślinne. Tkanki zwierzęce są pogrupowane w cztery podstawowe typy tkanki łącznej, mięśniowej, nerwowej i nabłonkowej. Tkanka roślinna jest podzielona na następujące trzy układy tkankowe: naskórek, tkanka gruntowa i tkanka naczyniowa.
Próbki tkanek mogą być przygotowane z części zwierzęcych lub roślinnych, np. kości, mięśni, liści itp.
Płyny ustrojowe
Krew, surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, ślina i płyn maziowy to płyny ustrojowe, które stanowią doskonałe źródło istotnych diagnostycznie informacji. Dlatego ważne jest zaawansowane przygotowanie próbek płynów ustrojowych do analizy. Pierwsza trudność związana jest z szerokim zakresem dynamicznym składników obecnych w płynach ustrojowych.
Oznaczanie stężenia białka
Test Bradforda, test Lowry'ego i test kwasu bicinchoninowego (BCA) są powszechnie stosowanymi testami do oznaczania stężenia białek. Albumina surowicy bydlęcej (BSA) jest jednym z najczęściej stosowanych wzorców białek.
bufor lizujący
Bufor do lizy musi być wybrany zgodnie z materiałem komórkowym lub tkanką (hodowla tkankowa, roślina, bakterie, grzyby itp.) oraz tym, czy komórki są w strukturze i rodzaju struktury. Szeroka gama buforów lizujących do ekstrakcji białek, błon i organelli zawiera jeden lub więcej detergentów. Detergent jest zwykle wybierany za pomocą testów prób i błędów lub – jeśli dostępny – zgodnie z istniejącym protokołem ekstrakcji białek. Detergent musi być kompatybilny ze źródłem tkanki i białkami. Ogólnie rzecz biorąc, wybiera się najłagodniejszy detergent, który działa dla określonej tkanki / białka, w celu utrzymania maksymalnej funkcjonalności ekstraktu. Ponadto, w przypadku ekstrakcji błon i organelli, łagodny detergent utrzymuje błonę w stanie nienaruszonym. Powszechnie stosowanymi detergentami w buforach lizujących są głównie niejonowe lub zwitterionowe, np. CHAPS, deoksycholan, Triton™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na przykład tkanki takie jak mózg, wątroba, jelita, nerki, śledziona itp. mogą być po prostu buforowane za pomocą RIPA – Należy jednak uwzględnić inhibitory proteazy i DTT (np. do elektroforezy żelowej).
Bufor do lizy tkanki mięśni szkieletowych (lodowato zimny): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w/v) glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy
Tabela popularnych buforów i ich zakres pH. Ogólnie rzecz biorąc, bufory te są zwykle używane w stężeniach 20-50 mM.
| bufor | Zakres pH |
|---|---|
| Kwas cytrynowy – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Cytrynian sodu – Kwas cytrynowy | 3.0 – 6.2 |
| Octan sodu – kwas octowy | 3.6 – 5.6 |
| Sól sodowa kwasu kakodylowego – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Diwodorofosforan sodu – wodorofosforan disodu | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Chlorowodorek trietanoloaminy – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Tetraboran sodu – kwas borowy | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glicyna – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Większość buforów wykazuje zależność pH od temperatury. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku buforów Tris. Wartość pKa zmienia się z 8,06 w temperaturze 25°C do 8,85 w temperaturze 0°C.
(pH i pKa buforu: pH mierzy stężenie jonów wodorowych w roztworze wodnym. pKa (= stała dysocjacji kwasu) jest pokrewną, ale bardziej szczegółową miarą, ponieważ pomaga przewidzieć, jak cząsteczka będzie działać przy określonej wartości pH).
TRIzol
TRIzol jest roztworem chemicznym stosowanym do ekstrakcji RNA/DNA/białka podczas ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny-fenolem-chloroformem. Zastosowanie ultradźwiękowo wspomaganej ekstrakcji TRIzol skutkuje wysoką wydajnością DNA, RNA i białka z tej samej próbki i tym samym przewyższa inne metody ekstrakcji.
Literatura/Referencje
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.