Technologia ultradźwiękowa firmy Hielscher

Białko ultradźwiękowy ekstrakcji z tkanek i kultur komórkowych

  • ekstrakcji białek jest podstawowym etapem przygotowania próbki w proteomiki.
  • Białka można ekstrahować z tkanki roślinne i zwierzęce, drożdże i mikroorganizmów.
  • Sonikacja jest niezawodny i skuteczny sposób ekstrakcji białka daje wysoką wydajność białka w ciągu krótkiego czasu ekstrakcji.

 

Ekstrakcja białka z tkanek i komórek

ekstrakcji białka z hodowli tkanek lub komórek jest podstawowym etapem przygotowania próbki, która jest wykonywana w wielu biochemicznych i technik analitycznych, takich jak ELISA PAGE western blotSpektrometria masowa, lub oczyszczania białek. Ultradźwiękowy uszkodzenia komórek lizy i ekstrakcji jest precyzyjnie kontrolowana techniki w celu zapewnienia wysokiej wydajności białka.

ekstrakcji białka z tkanki zwierzęcej

W celu przygotowania pełnowymiarowych tkanek (np. Nerek, serca, płuc, mięśni itp.), Tkankę należy wypreparować na bardzo małe kawałki za pomocą czystych narzędzi, najlepiej na lód i tak szybko jak to możliwe, aby zapobiec degradacji przez proteazy (np. bufor do lizy, taki jak RIPA lub hipotoniczny bufor do lizy zawierający koktajl inhibitora proteazy i fosfatazy). Po sekcji, próbkę zanurza się w ciekłym azocie, aby zatrzymać zamrożenie. Próbkę można przechowywać w temperaturze -80 ° C do późniejszego użycia lub pozostawić na lodzie do natychmiastowej homogenizacji. Bezpośrednio przed ekstrakcją ultradźwiękową szybko dodaje się lodowaty bufor do lizy (z inhibitorami proteazy DTT, leupeptyną i aprotyniną) do probówki (na ~ 10 mg tkanki zaleca się około 600 μl buforu). Około. Zaleca się 20-60 mg tkanki na próbówkę.
Ultradźwiękowy homogenizacji, rozpad i ekstrakcję prowadzi się za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego, takie jak UP200Ht lub UP200St, Wyposażony w sonotrodę mikro czubka. Sonikacja czas jest 60-90 sek. w ultradźwiękowej cyklu obróbki 15 sekund. sonikacji i 10 sek. czas odpoczynku. Próbka powinna być przechowywana w lodzie przez cały czas.
Po ultradźwiękowym homogenizacji / ekstrakcji, lizat wiruje się w 27,000g ok. 20 minut. Następnie supernatant zbiera się, tak, że stężenie białka może być określona za pomocą oznaczenia białka, takich jak Pierce do oznaczania białka BCA.

Sonizacja białkowa jest ważną metodą przygotowywania próbek.

Ekstrakcja białka ultradźwiękowego z komórek za pomocą UP200St

Zapytanie o informacje




Zwróć uwagę na nasze Polityka prywatności.


ekstrakcji białek z surowicy krwi

Do jednorodnej mieszaniny w surowicy krwi i w buforze fosforanowym, próbkę wiruje się zanim ultradźwiękowego lizy komórek. Do ultradźwiękowego lizy, próbkę poddaje się działaniu ultradźwięków w ultradźwiękowym laboratoryjnym homogenizatorze takie jak UP100H 8 cykli w 20% amplitudy dla cykli co 5 sekund, a 15 sekund przerwy. Sonocation przeprowadza sonicationg cyklicznie i umieszczając próbkę na lodzie, dzięki czemu unika się przegrzanie i degradacji termicznej próbki. Ponieważ surowica zawiera dużą ilość białek o wysokiej masie cząsteczkowej (takie jak albumina, alfa-1 antytrypsyny, transferyna haptoglobulin, immunoglobulinę G i immunoglobuliny A), które mają wpływ na rozdzielenie białek o niskiej masie cząsteczkowej, podczas IEF, zaleca się, aby ich wyczerpać z surowicy stosując kolumnę niszczenia.

ekstrakcji białka z tkanki roślinnej

Świeże, miękkie tkanki roślinnej, np mech itp, mogą być łatwo przerwane przez zwykłe umieszczenie posiekaną próbki materiału w buforze do lizy ultradźwięków. Twardy, ligenous tkanki roślin, takie jak nasiona, igły jodły itp należy suchego podłoża. Niektóre materiały twarde, zdrewniałe rośliny muszą być zamrożone i mielono w ciekłym azocie, ekstrahowano ultradźwięków. Do zawiesiny hodowli komórek roślinnych, na działanie ultradźwięków pomiędzy 30 i 150 sekund, w buforze do lizy jest przeważnie niewystarczające. Twardszy materiał, taki jak nasiona dyni wymagają bardziej intensywnej sonikacji, jak opisano poniżej.

Protokół do ekstrakcji ultradźwiękowej albuminy z nasion dyni

Ultradźwiękowy homogenizator tkankowy UP400St z S24d40 - do ekstrakcji białek z roślin i tkanek zwierzęcych (kliknij aby powiększyć!)Do ultradźwiękowego ekstrakcji białka albuminy z drobno zmielony proszek z nasion dyni 10 g odtłuszczonego proszku z nasion dyni i 100 ml dejonizowanej wody jako rozpuszczalnika, dodaje się 250 ml szklanej zlewki. Ekstrakcja białka składa się w dwóch etapach: Po pierwsze, próbkę poddaje się działaniu ultradźwięków z sondą typu ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) z zamontowanym sonotrody S24d7. Zlewkę szklaną umieszcza się w zimnej łaźni wodnej w czasie ultradźwiękowego homogenizacji. The ustawienie ultrasonicator UP400St dzięki podłączanemu czujnikowi temperatury temperatura próbki jest zawsze utrzymywana poniżej 30 ° C. Poprzez dokładną kontrolę temperatury podczas sonikacji unika się denaturacji albuminy. Po drugie, ekstrakcję przeprowadzono za pomocą miksera z szybkością 200 obrotów na minutę iw temperaturze 30 ° C. Następnie zlewkę przenosi się do wytrząsarki termostatycznej. Globulę usuwa się za pomocą dializy z wodą destylowaną. Po usunięciu globuliny można pobrać próbkę białka w celu oznaczenia profilu albuminy, a następnie dostosować ją do pI = 3,0, używając 0,1 M HCl do koagulacji albuminy. Fazę stałą oddzielono przez odwirowanie przy 5000 g, 20 ° C i ponownie rozpuszczono w dejonizowanej wodzie. Krążenie albuminowe wykonuje się dwukrotnie w celu zwiększenia stosunku białka w koncentracie albuminy.

Ultradźwiękowy ekstrakcji białek o zasadowym pH do wytwarzania koncentratu białkowego z otrąb ryżowych, pokazuje, że ultradźwiękowy leczenie skutkuje wyższą wydajnością białek w znacznie krótszym czasie ekstrakcji – w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ekstrakcji.

Ultradźwiękowy VialTweeter urządzenie do ekstrakcji białka z próbek tkanek (kliknij aby powiększyć!)

VialTweeter dla ultradźwiękami pośredniego.

Zalety

  • szybki
  • wysokie wydajności
  • wysoce wydajny
  • Precyzyjna kontrola nad parametrami
  • powtarzalne wyniki
  • liniową skalowalność

Przykładowy protokół Przygotowanie funkcjonalnego enzymu iNOS

W celu uzyskania w pełni funkcjonalny enzym iNOS (na przykład w celu badania przesiewowego leków), przy czym zaleca się następującą procedurę: zawiesina komórek powinna znajdować się na lód i sonifikowano ze związkiem UP100H przy amplitudzie 10 | im w trybie cyklu 5 s. sonikacji i 25 sek. spocząć na lodzie. Procedurę należy powtarzać ok. 3 razy. Czas odpoczynku pomiędzy cyklami sonikacji zmniejsza wzrost temperatury, a tym samym do zmniejszenia ryzyka denaturacji.

Ultradźwiękowy Protein rozpuszczający

Sonikacja może przyspieszyć proces rozpuszczania białek, które zwykle wymagają kilku godzin. W celu uniknięcia przegrzania próbki i zapobiegać degradacji białka i modyfikacje w roztworach zawierających mocznik, ultradźwiękowe pęka nie powinno trwać dłużej niż kilka sekund.

Ogólne instrukcje

Kontrola temperatury: W celu zapewnienia wysokiego uzysku białka bez denaturacji termicznej, temperaturę podczas ekstrakcji musi być kontrolowane. state-of-art homogenizatory ultradźwiękowe Hielscher za – zwany także ultradźwiękowy rozsadzający lub sonificator – są dokładnie kontrolowany. Pochodzą one z czujnikiem temperatury wtykane. W opcji Ustawienie ultradźwiękowy homogenizator, temperatura maksymalna może być ustawiona. Gdy to maksymalna temperatura jest osiągnięta, ultrasonicator zatrzymuje się automatycznie aż oziębieniu próbki.
Bufor: Wyborem odpowiedniego bufora i odpowiedniej objętości buforu wynosi od tkanki dla tkanki, która musi być wzorzysty, przez badania metodą prób i błędów.
Izolacja / Oczyszczanie: lizaty białkowe mogą zawierać nadmiar biomolekuł, takich jak DNA lub węglowodanów, które mogą być usunięte przez strącanie białka (kwas trójchlorooctowy, deoksycholanu) lub wymianie buforu.

Chittapalo i Noomhorm (2009) podali, że wydajność białka wzrósł z użyciem ultradźwięków i, że ultradźwiękowy procesu homogenizacji tkanki i rozpadu może poprawić istniejące procesy ekstrakcji znacznie – umożliwienie nowych handlowych możliwości wydobywczych.

Dźwięk z ochrony akustycznej obudowy Hielscher za SPB-L i urządzenia ultradźwiękowego UP200St. (Kliknij, aby powiększyć!)

Ultradźwiękowy homogenizator tkankowy UP200St dla wydajnej ekstrakcji białek

Precyzyjna kontrola obróbki ultradźwiękowej (kliknij aby powiększyć!)

kontrola przeglądarka do precyzyjnego działania i monitorowanie procesu sonikacyjnym

Sprzęt ultradźwiękowy dla Protein Extraction

Hielscher Ultrasonics oferują szeroki zakres homogenizatorów ultradźwiękowych do dezintegracji komórek, tkanek, bakterii, mikroorganizmów, i drożdże, zarodniki.
Hielscher ultrasonicators laboratoryjne są potężne i łatwe w obsłudze. Zbudowany do pracy 24/7, są one zaprojektowane jako solidnych i wydajnych urządzeń laboratoryjnych i ławki-top. Dla wszystkich urządzeń, produkcja energii i amplituda może być precyzyjnie kontrolowany. Szeroka gama Wyposażenie otwiera dalsze opcje konfiguracji. Urządzenia elektroniczne, takie jak VialTweeter, UP200Ht, UP200St, i UP400St posiada zintegrowany regulator temperatury oraz wbudowaną kartę SD do automatycznego zapisu danych.
Dla pośrednich, zanieczyszczenia krzyżowego-wolne i jednoczesnej ultradźwiękami wielu próbek, oferujemy VialTweeter lub ultradźwiękowy cuphorn.
W zależności od aplikacji, materiałów i objętości próbki, będziemy polecić najbardziej odpowiednią konfigurację dla przygotowania próbki. Skontaktuj się z nami!

Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!

Skorzystaj z formularza poniżej, jeśli chcesz zażądać dodatkowych informacji na temat ultradźwiękowej homogenizacji. Chętnie zaoferujemy Państwu system ultradźwiękowy, spełniający Państwa wymagań.









Proszę zwrócić uwagę na nasze Polityka prywatności.


Literatura / Referencje

  • Chittapalo T Noomhorm A (2009): ultradźwiękowe wspomaga ekstrakcję alkaliczną białka z odtłuszczonych otrębów ryżowych i właściwości koncentratów białkowych. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes André E.S:; Pereira, Dianę M.; Amaral, Joan.; Nunes Ana, M.; Gomes, Sofia E.; Roberts, Peter M.; Lo Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Sterować Clifford. J; Thibodeau Stephen C,; Borralho Peter M.; Rodrigues Cecilia M. P. (2013): skuteczne odzyskiwanie białek z wielu próbek źródła po Trizol lub Trizol LS ekstrakcji RNA i długotrwałego przechowywania. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Fakty Warto wiedzieć

proteomiki

Proteomiki jest dziedziną badań, które bada białka i proteomu. Białka fullfil szeroki wachlarz funkcji życiowych w organizmach. Proteomie jest cały zestaw białek wyrażanych przez genomu komórki, tkanki lub organizmu, w określonym czasie. Proteomie zależy od wymagań czasowych i oryginalny, czy naprężeń, że komórka lub organizm ulega. Bardziej szczegółowo, jest zestawem wyrażanych białek danego rodzaju komórki lub organizmu, w danym momencie, w określonych warunkach. Termin ten jest mieszanką białek i genomu. Proteomiki jest badanie proteomie.

Białko

Białka są są duże biomolekuł, tak zwane makrocząsteczki – które składają się z jednego lub więcej długich łańcuchów reszt aminokwasowych. Białka są obecne we wszystkich organizmach zarówno pochodzenia roślinnego, jak i zwierzęcego i mają kluczowe znaczenie dla większości funkcji biologicznych. Ponieważ białka zawierają wiele informacji biologicznych, są one ekstrahowane do celów analitycznych, np. Do badań proteomicznych. Najważniejszą funkcją wykonywaną przez białka są: kataliza reakcji metabolicznych, replikacja DNA, reakcja na bodźce i transport cząsteczek z jednego miejsca do drugiego. Białka różnią się od siebie przede wszystkim sekwencją aminokwasów, która jest podyktowana sekwencją nukleotydową ich genów i która zazwyczaj powoduje fałdowanie białka w specyficzną trójwymiarową strukturę, która determinuje jego aktywność. Białka są – Poza peptydów – jeden z kluczowych składników żywności. Dlatego proteomiki jest potężnym narzędziem do nauki o żywności w celu optymalizacji procesów, bezpieczeństwa żywności oraz ocenę stanu odżywienia.

żel do elektroforezy

Elektroforeza w żelu jest głównym sposobem rozdzielania i analizy makrocząsteczek, takich jak DNA, RNA i białek, jak również ich fragmentów, w zależności od ich wielkości i ładunku. Jest on stosowany w chemii klinicznej do oddzielenia białek o zmianę i / lub wielkości (IEF agarozowym w istocie rozmiar niezależnie) w biochemii, biologii molekularnej i proteomiką w celu oddzielenia mieszanych populacji fragmentów DNA i RNA o długości w celu oszacowania wielkości DNA oraz fragmenty RNA lub w celu oddzielenia białek od ładunku.

Hodowle komórkowe

kultura komórek jest sterowany proces wzrostu, w którym komórki hoduje się w warunkach kontrolowanych. Warunki hodowli komórek są różne dla każdego typu komórek. Na ogół, środowisko hodowli komórek składa się z odpowiedniego pojemnika (na przykład na płytkę Petriego) z podłoża lub nośnika, który dostarcza niezbędnych składników odżywczych (aminokwasy, węglowodany, witaminy, sole mineralne), czynniki wzrostu, hormony i gazów (CO2The2) I reguluje środowisko fizyko-chemiczną (bufor pH, ciśnienie osmotyczne, temperatura). Większość komórek potrzebują powierzchni lub sztucznym podłożu, podczas gdy inne hodowle komórkowe mogą być uprawiane darmo pływające w pożywce hodowlanej (hodowli w zawiesinie, zawiesina komórek).
Masa hodowli linii komórek zwierzęcych są stosowane w przemysłowej produkcji szczepionek wirusowych i innych produktów pochodnych na drodze biotechnologicznej. Ludzkie komórki macierzyste są hodowane w celu zwiększenia liczby komórek i różnicowanie komórek w wielu typach komórek somatycznych w celach transplantacyjnych.

Próbki tkanek

Tkankę określenie opisuje komórkowy produkt pośredni, w którym materiał komórkowy znajduje się na poziomie organizacyjnym między komórkami i pełnego narządu. W tkance podobnych komórek, z tego samego pochodzenia, które razem wykonywania określonych funkcji są zmontowane. Przez funkcjonalnej grupowania wielu tkanek, powstają złożone struktury narządów.
Tkankę pobrano próbki do badań biologii, histologii / histopatologii, parazytologii, biochemii, immunohistochemię, jak również hodowlę i wyodrębnić DNA. można go odróżnić od zwierząt (pola: tkanek ssaków) i tkanki roślinnej. tkanek zwierzęcych są pogrupowane w cztery podstawowe typy łącznej, mięśni, układu nerwowego, i tkanki nabłonkowej. tkanka roślinna jest podzielony na trzech następujących systemów tkanki: naskórka, tkankę gruntu i tkanki naczyniowej.
Próbki tkanki można otrzymać z części zwierząt i roślin, na przykład kości, mięśni, liście, itd.

Płyny ustrojowe

Krew, surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, ślina i płyn stawowy są płyny ustrojowe, które oferują doskonałe źródło diagnostycznie istotnych informacji. Dlatego wyrafinowane przygotowanie próbek do analizy płynów ciała jest bardzo ważne. Pierwsza trudność związana jest z szerokim zakresem dynamiki składników obecnych w płynach ustrojowych.

Oznaczanie stężenia białek

Próba Bradforda, test Lowry i testu z kwasem bicynchoninowym (BCA) są powszechne testy w celu określenia stężenia protein. Albumina surowicy bydlęcej (BSA) jest jednym z najczęściej stosowany standard białka.

Bufor do lizy

Bufor do lizy muszą być wybrane zgodnie z materiału komórki lub tkanki (tkanek, hodowli roślin, bakterii, grzybów, itd.) i tego, czy komórki są w konstrukcji i rodzaju konstrukcji. Szeroki zakres buforów do lizy do ekstrakcji białek błony i organelle są formułowane z jednym lub więcej detergentów. Detergent jest zwykle wybrany przez badań prób i błędów lub – Jeśli możliwe – według istniejącego protokołu ekstrakcji białek. Detergent może być kompatybilny ze źródłem tkanki, jak i białek. Na ogół, najłagodniejsze detergentu, który działa dla określonej tkanki / białko jest wybrane w celu utrzymania maksymalnej funkcjonalności ekstraktu. Ponadto, w przypadku ekstrakcji błon i organelli, łagodny detergent trzyma membranę nienaruszone. Powszechnie stosowane detergenty buforów do lizy są najczęściej niejonowe lub obojniaczojonowe, np CHAPS, deoksycholan Triton ™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na przykład, tkanki, takie jak mózg, jelito, wątroba, nerka, śledziona etc. można łatwo buforowany RIPA – Jednakże inhibitory proteazy i DTT (na przykład przez elektroforezę w żelu) powinny być uwzględnione.
Bufor do lizy tkanki mięśni szkieletowych (lodowatego): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glicerol, 1 mM EDTA 1 mM ditiotreitolu z dodatkiem inhibitorów proteazy i fosfatazy koktajl
Tabela typowymi buforami, a ich zakres pH. Na ogół, te bufory zwykle stosuje się w stężeniu 20-50 mM.

Bufor Zakres pH
Kwas cytrynowy – NaOH 2.2 – 6.5
Cytrynianu sodowego – Kwas cytrynowy 3.0 – 6.2
Octan sodowy – kwas octowy 3.6 – 5.6
sól sodowa Kwas Kakodylowy – HCl 5.0 – 7.4
MY – NaOH 5.6 – 6,8
Diwodorofosforan sodowy – wodorofosforan disodu 5.8 – 8.0
imidazolu – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
chlorowodorek trietanoloamina – NaOH 6,8 – 8,8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricine – NaOH 7.6 – 8.6
tetraboran sodu – kwas borowy 7.6 – 9.2
Bicine – NaOH 7.7 – 8.9
Glicyna – NaOH 8.6 – 10,6

Większość bufory pH wykazują zależność od temperatury. Jest to szczególnie prawdziwe w odniesieniu do buforem Tris. PKa od 8.06 zmienia się w 25 ° C do 8,85 w temperaturze 0 ° C.
(PH i pKa buforu: pH mierzy się stężenie jonów wodoru w roztworze wodnym pKa (= dysocjacji kwasowej) jest powiązany, ale konkretny środek, na tym, że przyczynia się do przewidzenia, jak cząsteczka będzie działać w określonej. wartość PH.)

TRIzolu

TRIzolu jest roztworem chemicznym do ekstrakcji RNA / DNA / białka podczas ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny-fenol-chloroform. Zastosowanie ultradźwięków wspomaganego Trizol Wyniki ekstrakcji w wysokiej DNA, RNA, białek i plonów z tej samej próbki i przewyższa co inne metody ekstrakcji.