Ultradźwiękowe przygotowanie próbek C. elegans

C. elegans, nicień, jest organizmem modelowym szeroko stosowanym w biologii. Przygotowanie próbek przed analizą wymaga lizy, ekstrakcji białek i lipidów oraz fragmentacji RNA, które można niezawodnie przeprowadzić za pomocą sonikacji. Ultradźwiękowe urządzenia do rozbijania komórek są niezawodnymi, zaawansowanymi i łatwymi w obsłudze urządzeniami do szybkiego przygotowywania próbek C. elegans.

Ultradźwiękowe przygotowanie próbek C. elegans

Caenorhabditis elegans to nicienie szeroko stosowane w laboratoriach badawczych do badań nad genomiką, biologią rozwoju i chorobami. Wiele genów w genomie C. elegans ma funkcjonalne odpowiedniki u człowieka. Dzięki temu nicień ten jest niezwykle użytecznym modelem chorób człowieka. Inne zalety sprzyjające szerokiemu wykorzystaniu C. elegans to łatwa i tania hodowla na płytkach zawierających bakterie (np. E. coli), przezroczystość, wygoda pracy z tym organizmem, a także możliwość zamrażania i przechowywania nicieni przez dłuższy czas.
Analiza białek i lipidów należy do rutynowych procedur laboratoryjnych, a ultradźwiękowe przygotowanie próbek jest uznaną metodą lizy nicieni C. elegans na każdym etapie rozwoju (tj. zarodków, larw L1–L4 i osobników dorosłych). Ponieważ C. elegans wykorzystuje się również jako system ekspresji białek do nadekspresji docelowych białek, potrzebna jest niezawodna, powtarzalna metoda lizy i ekstrakcji białek, zapewniająca wysoką wydajność pozyskiwania białka. Ultradźwiękowe systemy rozbijania komórek i ekstrakcji są dostępne jako homogenizatory z sonotrodą oraz sonikatory do wielu próbek. Hielscher Ultrasonics oferuje idealne ultradźwiękowe urządzenie do rozbijania komórek do Twojej procedury laboratoryjnej, zapewniając wygodne przygotowanie próbek o wszelkich wielkościach i w dowolnej liczbie.

Protokoły ultradźwiękowego rozbijania i lizy C. elegans

Ultradźwiękową homogenizację i lizę C. elegans, a następnie ekstrakcję białek i lipidów można przeprowadzać według różnych procedur, stosując różne bufory do homogenizacji i lizy itp. Wspólną cechą wszystkich protokołów lizy jest konieczność ciągłego utrzymywania próbek na lodzie, aby zapobiec degradacji białek. Poniżej przedstawiamy kilka niezawodnych i szybkich protokołów ultradźwiękowej lizy i ekstrakcji, służących do przygotowywania wysokiej jakości próbek C. elegans zawierających białka lub lipidy.

Zalety ultradźwiękowej lizy C. elegans

• niezawodność
• powtarzalność
• precyzyjna kontrola temperatury
• niezawodna kontrola procesu
• łagodna metoda
• łatwość stosowania
• bezpieczeństwo

Ultradźwiękowa ekstrakcja białek z próbek C. elegans

Ultradźwiękową lizę i ekstrakcję białek z nicieni C. elegans można przeprowadzać według różnych protokołów. Poniżej przedstawiamy kilka niezawodnych i szybkich protokołów lizy, zapewniających powtarzalne wyniki ekstrakcji białek.

Szybkie przygotowanie ekstraktu cytozolowego z nicieni C. elegans za pomocą sonikacji

Poniższy protokół umożliwia przygotowanie lizatów C. elegans w czasie krótszym niż 30 minut.
Zbieranie C. elegans
Przenieś wybrane nicienie C. elegans do probówki 1,5ml zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub spłucz je z płytki za pomocą 1,5ml PBS. Wiruj przez 1min przy 2000rpm, aby uzyskać osad. Przez cały czas utrzymuj próbki na lodzie.
Następnie dwukrotnie przemyj nicienie PBS.
Potem dwukrotnie przemyj nicienie ddH₂O.
Ponownie zawieś nicienie w co najmniej 500ul buforu do homogenizacji (HB). Próbki nicieni są teraz gotowe do lizy ultradźwiękowej.
Aby uzyskać ekstrakt białkowy wyższej jakości, możesz zmniejszyć zanieczyszczenie bakteryjne, przemywając nicienie każdorazowo przez 5min w PBS oraz w sterylnej, ultraczystej wodzie (ddH₂O) lub przeprowadzając flotację w sacharozie. Stale utrzymuj próbki nicieni na lodzie.

Protokół ultradźwiękowej lizy C. elegans

• Przygotuj sonikator z wyprzedzeniem, tak aby homogenizator ultradźwiękowy był gotowy do użycia (zamontowana sonotroda, wstępnie ustawiony program sonikacji). 

Jeśli sonikator jest zamontowany na statywie, umieść kąpiel lodową z probówkami zawierającymi próbki pod sonotrodą i wprowadź sonotrodę do probówki 1,5ml.

• W przypadku lizy C. elegans za pomocą UP200St lub UP200Ht sonikację należy przeprowadzać z użyciem mikrokońcówki (np. sonotrody S26d2 o średnicy 2mm; patrz zdjęcie po lewej) przy amplitudzie 40% przez 1sec, z przerwami po 30sec. Do lizy C. elegans idealnie nadaje się 5 cykli sonikacji po 1 sekundzie, z przerwami po 30sec. Jeśli przeprowadzasz lizę po raz pierwszy, możesz sprawdzać jej postęp pod mikroskopem w małych porcjach próbki po każdym impulsie.
• Liza zostaje pomyślnie zakończona, gdy nicienie ulegną rozbiciu. Nadmierna sonikacja prowadzi do rozbijania jąder komórkowych, co staje się widoczne, gdy próbka nabiera lepkości lub się pieni. Aby zapobiec degradacji próbki, w razie potrzeby zastosuj więcej impulsów. Aby uzyskać wysokiej jakości ekstrakty białkowe, nie wydłużaj czasu trwania poszczególnych cykli impulsów ultradźwiękowych.
• Sklaruj lizat komórkowy, wirując nicienie poddane lizie ultradźwiękowej przy 14 000rpm przez 10min w temperaturze 4ºC.
• Następnie przenieś supernatant do nowej probówki i przygotuj go do immunoprecypitacji lub innych testów.

Uwaga dotycząca buforu do homogenizacji: Przygotuj bufor do homogenizacji do powyższego protokołu lizy ultradźwiękowej w następujący sposób:

Wysokoprzepustowa liza C. elegans na płytkach 96-dołkowych przy użyciu sonikatora do płytek UIP400MTP

Liza C. elegans (dorosłe nicienie)
UIP400MTP, amplituda 80%, 20 cykli (każdy cykl sonikacji: 30 sec pracy, 30 sec przerwy)
Bufor do lizy:

• Opcja 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opcja 2) do koimmunoprecypitacji (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (koktajl inhibitorów proteinaz Complete)

Wysokoprzepustowa fragmentacja DNA
DNA C. elegans (dorosłych nicieni) 200–300bp: sonikator do płytek UIP400MTP – ustaw amplitudę 80%, 30 impulsów – każdy po 30sec pracy i 30sec przerwy

Sonikator do płytek UIP400MTP do wysokoprzepustowego przygotowywania próbek równomiernie poddaje sonikacji próbki na płytkach wielodołkowych, mikrotitracyjnych i 96-dołkowych

Ultradźwiękowa liza C. elegans do ilościowych testów oczyszczania powinowactwa

Zarodki C. elegans (∼2 miliony na powtórzenie) zebrano bezpośrednio przed eksperymentem w trzech powtórzeniach biologicznych poprzez traktowanie młodych hermafrodytów zawierających jaja roztworem wybielacza i poddano sonikacji na lodzie (cykl: 0,5 s, amplituda: 40–45%, 5 impulsów/sesję, 5 sesji, odstęp między sesjami: 30 s; procesor ultradźwiękowy UP200S z mikrokońcówką S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) w buforze do lizy (całkowita objętość: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerolu, mieszanina inhibitorów proteaz, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Po sonikacji dodano Nonidet P-40 Substitute do stężenia 1%, a lizaty inkubowano, obracając probówki koniec do końca, w temperaturze 4°C przez 30 min, po czym wirowano przy 20 000 × g przez 20 min w temperaturze 4°C. Następnie sklarowany lizat odessano bez naruszania górnej warstwy lipidowej i podzielono na dwie równe części, dodając jedną do kulek agarozowych anty-GFP, a drugą do zablokowanych kulek kontrolnych (40–50 μl). Po obracaniu probówek koniec do końca w temperaturze 4°C przez 60–90 min kulki przemyto raz buforem do lizy zawierającym 0,1% Nonidet P-40 Substitute, a następnie dwukrotnie buforem I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) lub buforem II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), lub obydwoma buforami. W przypadku izolacji GFP:MBK-2 metodą pull-down przeprowadzono dwa oddzielne eksperymenty z zastosowaniem różnych warunków przemywania. Białka eluowano przez wytrząsanie orbitalne w 50 μl roztworu 6 m mocznika/2 M tiomocznika w temperaturze pokojowej. W eksperymentach izolacji MBK-1::GFP metodą pull-down białka eluowano dwukrotnie przez wytrząsanie w 50μl roztworu 8 m chlorku guanidyny w temperaturze 90°C, po czym przeprowadzono wytrącanie etanolem. Wyeluowane próbki białek poddano następnie trawieniu w roztworze.
(por. Chen et al., 2016)

Ultradźwiękowa homogenizacja i liza nicieni

Do procedury lizy i ekstrakcji białek z C.elegans zebrano po 30 000 nicieni na odpowiednim etapie rozwoju na próbkę, przemyto je lodowato zimnym podłożem S-basal, zagęszczono przez wirowanie przy 1500 rpm przez 2 min., przemyto sześciokrotnie lodowato zimnym podłożem S-basal w celu usunięcia pozostałych bakterii, a następnie przechowywano na lodzie do czasu użycia. Do ekstrakcji białek po ostatnim przemyciu podłożem S-basal umożliwiono dorosłym nicieniom zawierającym jaja utworzenie zwartego osadu. Osady nicieni ponownie zawieszono następnie w 1 ml lodowato zimnego buforu ekstrakcyjnego [20 mM fosforanu potasu, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitory proteaz (Sigma P2714)] i natychmiast poddano obróbce.
∼30 000 dorosłych nicieni zawierających jaja (co odpowiada ∼100 mg mokrej masy) poddano sonikacji na lodzie przy użyciu sonikatora z sonotrodą (np. UP50H z mikrokońcówką MS2) przy amplitudzie 40% przez 10 cykli po 3 sec pracy i 30 sec przerwy, w 1 ml lodowato zimnego buforu ekstrakcyjnego. (por. Baskharan et al. 2012)

Ultradźwiękowa ekstrakcja lipidów z C. elegans

W lipidomice, dziedzinie metabolomiki, charakteryzuje się i analizuje pełny zestaw lipidów układów biologicznych. C. elegans są szeroko stosowane w lipidomice do badania wzajemnego oddziaływania lipidów metabolicznych oraz ich wpływu na zdrowie i długość życia.
Ultradźwiękową lizę i ekstrakcję stosuje się do uwalniania lipidów, takich jak sfingolipidy, z zarodków, larw i dorosłych nicieni C. elegans. Sonikacja służy do przygotowania homogenatów nicieni, a następnie do ekstrakcji lipidów z próbki.
Protokół ultradźwiękowej ekstrakcji lipidów z C. elegans
Rozmroź osad C. elegans na lodzie i ponownie zawieś go w 0,5 ml ultrawater. 
Poddaj próbki C. elegans sonikacji w probówkach 1,5mL, stale utrzymując je na lodzie.
Sonikację można przeprowadzić przy użyciu sonikatora z sonotrodą, takiego jak UP200Ht, urządzenia do ultradźwiękowego przygotowywania próbek VialTweeter (jednoczesna sonikacja 10 próbek) lub urządzenia UIP400MTP (do sonikacji płytek wielodołkowych, takich jak płytki 96-dołkowe).
Do lizy ultradźwiękowej przy użyciu UP200Ht zastosuj mikrokońcówkę S26d2. Wstępnie ustaw tryb cykli ultradźwiękowych w menu cyfrowym. Ustaw amplitudę na 10% i tryb cykli sonikacji na 20 cykli impulsów po 2 sec z przerwą 30 sec. między kolejnymi seriami impulsów ultradźwiękowych.
Przenieś supernatanty do szklanych probówek z zakrętkami. 
Przeprowadź ekstrakcję metodą Folcha, dodając do każdej szklanej probówki 1 ml ultrawater, a następnie 6 ml 
mieszaniny chloroformu/metanolu (stosunek = 2:1).
Mieszaj każdą szklaną probówkę na worteksie przez 30 sec, powtarzając czynność 4 razy. 
Wiruj probówki przy 1 258 x g przez 15 min (Eppendorf, 5810 R), aby dodatkowo poprawić rozdział faz. 
Przenieś dolną frakcję hydrofobową do czystej szklanej probówki za pomocą szklanej pipety Pasteura. 
Wysusz dolną frakcję hydrofobową w strumieniu azotu w wyparce azotowej. 
Przechowuj wysuszony osad w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu użycia. 


Ultradźwiękowe przygotowanie lizatów nicieni

Lizat nicieni: Nicienie w stadium L4 zebrano i przemyto trzykrotnie buforem M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl i 0,87 mM MgSO₄) w celu usunięcia wszystkich bakterii. Po usunięciu możliwie największej ilości buforu M9 nicienie ponownie zawieszono w buforze do lizy: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glicerofosforanu, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorku sodu, 1 mM ortowanadanu sodu, 5 mM pirofosforanu sodu, 0,2 mM fluorku fenylometylosulfonylu i inhibitor proteaz. Nicienie trzykrotnie zamrożono w ciekłym azocie i rozmrożono w temperaturze 37°C, a następnie poddano sonikacji na suchym lodzie przy użyciu ultradźwiękowego urządzenia VialTweeter do jednoczesnego przygotowywania 10 probówek z próbkami. Sonikację przeprowadzono przy amplitudzie 50% w 10 cyklach po 2 sec. z przerwami po 30 sec między seriami impulsów sonikacji. Następnie próbki wirowano przy 12 000 rpm w temperaturze 4°C przez 15 min. Zebrano supernatant i przechowywano go w temperaturze -70°C. Porcję wykorzystano do ilościowego oznaczenia białek metodą Bradforda.
Oznaczanie glutationu całkowitego, GSH i GSSG: W celu ilościowego oznaczenia glutationu lizaty przygotowano i oznaczenia wykonano tego samego dnia. Larwy L4 karmione glukozą oraz larwy kontrolne zebrano i przemyto trzykrotnie buforem M9. Po usunięciu możliwie największej ilości buforu M9 nicienie ponownie zawieszono w lodowato zimnym kwasie metafosforowym (5% w/v), a następnie poddano sonikacji w lodzie przy użyciu ultradźwiękowego urządzenia VialTweeter przy amplitudzie 50% w dziesięciu cyklach sonikacji po 2 sec. z przerwami po 30 sec. między cyklami. Następnie wirowano przy 12 000 rpm w temperaturze 4 ̊C przez 15 min.
(por. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Przygotowanie próbek C. elegans przed immunoprecypitacją i analizą Western blot

W skrócie, w celu uzyskania ekstraktów zarodkowych larwy L1 C. elegans hodowano w dużych hodowlach płynnych w podłożu S aż do osiągnięcia dorosłości. Zarodki zebrano standardową metodą z użyciem wybielacza i zawieszono w buforze do lizy (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerolu, 0,05% NP-40, 1􏰅 koktajlu inhibitorów proteaz oraz 1􏰅 koktajlu inhibitorów fosfataz I i II), szybko zamrożono w ciekłym azocie i poddano lizie poprzez ultradźwiękowe rozbijanie komórek przy użyciu sonikatora z mikrokońcówką, takiego jak UP200Ht z S26d2, stosując 10 impulsów w ciągu 10 s przy amplitudzie 30%. Jeśli konieczne jest przygotowanie większej liczby próbek, zaleca się ultradźwiękowe urządzenie VialTweeter lub sonikator do wielu próbek UIP400MTP do płytek dołkowych. Po sonikacji ekstrakty wstępnie sklarowano przez wirowanie przy 30 000g przez 20 min w temperaturze 4°C. Wstępnie sklarowany ekstrakt (300µg białka całkowitego) inkubowano z 40µ􏰂g przeciwciała anty-CDC-25.1 oczyszczonego metodą powinowactwa (niniejsze badanie), połączonego wiązaniami krzyżowymi z agarozą z białkiem A, lub jako kontrolę zastosowano podobną ilość króliczej immunoglobuliny (Ig)G połączonej wiązaniami krzyżowymi z agarozą z białkiem A, w całkowitej objętości 200µl buforu do lizy zawierającego 1% NP-40, którego dodatek zmniejszał nieswoiste wiązanie białek z matrycą. Próbki obracano przez 1 h w temperaturze 4°C, kulki przemyto trzykrotnie buforem do lizy, a elucję przeprowadzono za pomocą 30µl glicyny/HCl i 200 mM NaCl, pH 2,2. Po immunoprecypitacji eluaty rozcieńczono w 30µ􏰂l buforu próbkowego SDS, ogrzewano do 95°C przez 4 min i zwykle na SDS-PAGE nanoszono 3% całkowitej ilości materiału wejściowego oraz 30% eluatów, po czym przeprowadzano analizę Western blot z przeciwciałami anty-CDC-25.1 (1:400), anty-LIN-23 (1:750), anty-ubikwityna (1:1000), anty-GSK3􏰁 (1:500) lub anty-􏰁β-aktyna (1:2000). W przypadku ekstraktów niepoddawanych immunoprecypitacji taką samą ilość białka całkowitego pochodzącego z tych ekstraktów ponownie zawieszano w buforze próbkowym SDS, ogrzewano do 95°C, a następnie bezpośrednio nanoszono na SDS-PAGE i analizowano metodą Western blot. (por. Segref et al. 2020)

Liza ultradźwiękowa z precyzyjną kontrolą temperatury

Precyzyjna i niezawodna kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie podczas pracy z próbkami biologicznymi. Wysokie temperatury inicjują degradację białek w próbkach wywołaną ciepłem.
Podobnie jak wszystkie mechaniczne techniki przygotowywania próbek, sonikacja wytwarza ciepło. Jednak przy użyciu VialTweeter temperaturę próbek można skutecznie kontrolować. Przedstawiamy różne możliwości monitorowania i kontrolowania temperatury próbek podczas przygotowywania ich do analizy za pomocą VialTweeter i VialPress.

1. Monitorowanie temperatury próbki: Procesor ultradźwiękowy UP200St, który napędza VialTweeter, jest wyposażony w inteligentne oprogramowanie i podłączany czujnik temperatury. Podłącz czujnik temperatury do UP200St i umieść jego końcówkę w jednej z probówek z próbkami. Za pomocą cyfrowego kolorowego wyświetlacza dotykowego można ustawić w menu UP200St określony zakres temperatur dla sonikacji próbek. Sonikator automatycznie zatrzyma się po osiągnięciu maksymalnej temperatury i wstrzyma pracę do czasu, aż temperatura próbki spadnie do dolnej wartości ustawionego zakresu temperatur ∆. Następnie sonikacja automatycznie rozpocznie się ponownie. Ta inteligentna funkcja zapobiega degradacji wywołanej ciepłem.
2. Blok VialTweeter można wstępnie schłodzić. Umieść blok VialTweeter (wyłącznie sonotrodę bez przetwornika!) w lodówce lub zamrażarce, aby wstępnie schłodzić tytanowy blok, co pomaga opóźnić wzrost temperatury próbki. Jeśli to możliwe, samą próbkę również można wstępnie schłodzić.
3. Użyj suchego lodu do chłodzenia podczas sonikacji. Napełnij płytką tacę suchym lodem i umieść na nim VialTweeter, aby ciepło mogło szybko się rozpraszać.

Znajdź optymalne ultradźwiękowe urządzenie do rozbijania komórek do swojego zastosowania lizy

Hielscher Ultrasonics jest producentem o wieloletnim doświadczeniu w wytwarzaniu wysokowydajnych ultradźwiękowych urządzeń do rozbijania komórek i homogenizatorów do laboratoriów oraz systemów w skali stołowej i przemysłowej. Wielkość hodowli komórek bakteryjnych, cel badań lub produkcji oraz objętość komórek do przetworzenia w ciągu godziny lub dnia to kluczowe czynniki przy wyborze odpowiedniego ultradźwiękowego urządzenia do rozbijania komórek do danego zastosowania.
Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania do jednoczesnej sonikacji wielu próbek (do 10 fiolek), jak również dużej liczby próbek (tj. płytek mikrotitracyjnych / płytek 96-dołkowych), klasyczne laboratoryjne sonikatory z sonotrodą o różnych mocach od 50 do 400 watów, aż po w pełni przemysłowe procesory ultradźwiękowe o mocy do 16 000 watów na urządzenie, przeznaczone do komercyjnego rozbijania komórek i ekstrakcji białek w produkcji na dużą skalę. Wszystkie sonikatory Hielscher są zaprojektowane do pracy 24/7/365 pod pełnym obciążeniem. Wytrzymałość i niezawodność to podstawowe cechy naszych urządzeń ultradźwiękowych.
Wszystkie cyfrowe homogenizatory ultradźwiękowe są wyposażone w inteligentne oprogramowanie, kolorowy wyświetlacz dotykowy i automatyczne rejestrowanie danych, dzięki czemu urządzenie ultradźwiękowe staje się wygodnym narzędziem pracy w laboratoriach i zakładach produkcyjnych.
Poinformuj nas, jakie komórki, w jakiej objętości, z jaką częstotliwością i w jakim celu musisz przetwarzać w swoich próbkach biologicznych. Polecimy Ci ultradźwiękowe urządzenie do rozbijania komórek najlepiej dopasowane do wymagań Twojego procesu.

Poniższa tabela przedstawia orientacyjną wydajność przetwarzania naszych systemów ultradźwiękowych, od kompaktowych homogenizatorów ręcznych i sonikatorów do wielu próbek po przemysłowe procesory ultradźwiękowe do zastosowań komercyjnych: