Ultradźwiękowe przygotowanie próbek C. elegans

C. elegans, nicień, jest szeroko stosowanym organizmem modelowym w biologii. Przygotowanie próbki przed analizą wymaga lizy, ekstrakcji białek i lipidów, a także fragmentacji RNA, którą można niezawodnie przeprowadzić za pomocą sonikacji. Ultradźwiękowe rozbijacze komórek są niezawodnymi, wyrafinowanymi i łatwymi w użyciu urządzeniami do szybkiego przygotowywania próbek C. elegans.

Ultradźwiękowe przygotowanie próbek C. elegans

C. elegans to glisty, które są szeroko stosowane w laboratoriach badawczych do badania genomiki, biologii rozwoju i chorób. Wiele genów w genomie C. elegans ma funkcjonalne odpowiedniki u ludzi. Tym samym nicień ten jest niezwykle użytecznym modelem dla chorób człowieka. Inne zalety szerokiego zastosowania C. elegans to łatwa i tania hodowla na płytkach zawierających bakterie (np. E. coli), przezroczystość, wygodna obsługa, a także możliwość zamrażania i przechowywania robaków przez dłuższy czas.
Analiza białek i lipidów jest regularną procedurą w laboratoriach, a ultradźwiękowe przygotowanie próbek jest ustaloną metodą lizy nicieni C. elegans na każdym etapie rozwoju (tj. zarodki, larwy L1-L4, osobniki dorosłe). Ponieważ C. elegans jest również stosowany jako system ekspresji białek do nadekspresji białek docelowych, wymagana jest niezawodna, powtarzalna metoda lizy i ekstrakcji białek, która zapewnia wysoką wydajność białka. Ultradźwiękowe systemy rozbijania i ekstrakcji komórek są dostępne jako homogenizatory typu sondowego i jako ultrasonografy wielopróbkowe. Dostosowując się do wygodnego przygotowywania próbek i wszelkiego rodzaju rozmiarów próbek, firma Hielscher Ultrasonics posiada idealny ultradźwiękowy rozbijacz komórek do procedur laboratoryjnych.

Protokoły ultradźwiękowe dla zakłóceń i lizy C. elegans

Homogenizacja ultradźwiękowa i liza C. elegans oraz późniejsza ekstrakcja białek i lipidów może być przeprowadzona przy użyciu różnych procedur z wykorzystaniem różnych buforów do homogenizacji i lizy itp. Wszystkie protokoły lizy mają wspólną cechę, że próbki muszą być stale przechowywane w lodzie, aby zapobiec degradacji białek. Poniżej przedstawiamy kilka niezawodnych i szybkich ultradźwiękowych protokołów lizy i ekstrakcji do przygotowania wysokiej jakości próbek C. elegans zawierających białka lub lipidy.

Zalety ultradźwiękowej lizy C. elegans

• Niezawodny
• powtarzalny
• precyzyjnie kontrolowana temperatura
• niezawodna kontrola procesu
• delikatna metoda
• łatwa aplikacja
• Bezpieczny

Ultradźwiękowa ekstrakcja białek z próbek C. elegans

Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja białek robaków C. elegans może być przeprowadzona przy użyciu różnych protokołów. Poniżej przedstawiamy kilka niezawodnych i szybkich protokołów lizy dla powtarzalnych wyników ekstrakcji białek.

Szybkie przygotowanie ekstraktu cytozolowego z robaków C. elegans za pomocą sonikacji

Poniższy protokół umożliwia przygotowanie lizatów C. elegans w czasie krótszym niż 30 minut.
Kolekcja C. elegans
Pobrać pożądane robaki C. elegans do 1,5 ml probówki z buforowaną solą fizjologiczną (PBS) lub przemyć je z płytki 1,5 ml PBS. Wirować przez 1 minutę z prędkością 2000 obr. Przechowywać próbki przez cały czas w lodzie.
Następnie przemyć robaki dwukrotnie PBS.
Następnie przepłukać robaki dwukrotnie ddH₂O.
Zawiesić robaki w co najmniej 500ul buforu homogenizacyjnego (HB). Próbki robaków są teraz gotowe do lizy ultradźwiękowej.
Aby uzyskać wyższą jakość ekstraktu białkowego, warto zmniejszyć zanieczyszczenie bakteryjne poprzez płukanie robaków przez 5 minut w PBS i sterylnej, ultraczystej wodzie (ddH₂O) lub przeprowadzić floatację sacharozą. Próbki robaków należy stale przechowywać w lodzie.

Ultradźwiękowy protokół lizy C. elegans

• Upewnij się, że przygotowałeś ultrasonicator z wyprzedzeniem, aby homogenizator ultradźwiękowy był gotowy do użycia (zamontowana sonda, wstępnie ustawiony program sonikacji).

Jeśli ultrasonograf jest zamontowany na stojaku, umieść łaźnię lodową z próbówkami pod sondą ultradźwiękową i włóż sondę ultradźwiękową do probówki o pojemności 1,5 ml.

• W przypadku lizy C. elegans za pomocą UP200St lub UP200Ht, ultradźwięki powinny być wykonywane przy użyciu mikrokońcówki (np. 2 mm sondy S26d2; patrz zdjęcie po lewej) przy 40% amplitudzie przez 1 sekundę z 30-sekundowymi przerwami pomiędzy. 5 cykli sonikacji na każdą 1 sekundę z 30-sekundowymi przerwami są idealne do lizy C. elegans. Jeśli przeprowadzasz lizę po raz pierwszy, możesz sprawdzić postęp lizy w małych porcjach próbki po każdym impulsie za pomocą mikroskopu.
• Liza jest zakończona pomyślnie, gdy robaki zostaną rozbite. Nadmierna sonikacja powoduje rozbicie jąder i staje się widoczna, gdy próbka staje się lepka lub pieni się. Aby zapobiec degradacji próbki, w razie potrzeby należy użyć większej liczby impulsów. Nie zwiększaj czasu każdego cyklu impulsu ultradźwiękowego, aby uzyskać wysokiej jakości ekstrakty białkowe.
• Oczyścić lizat komórkowy przez odwirowanie ultradźwiękowo zlizowanych robaków z prędkością 14 000 obrotów na minutę przez 10 minut w temperaturze 4ºC.
• Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki i przygotować do immunoprecypitacji lub innych testów.

Uwaga dotycząca buforu do homogenizacji: Przygotować bufor do homogenizacji dla powyższego protokołu lizy ultradźwiękowej w następujący sposób:

Wysokoprzepustowa liza C. elegans w 96-dołkowych płytkach przy użyciu sonikatora płytkowego UIP400MTP

C. elegans Liza (dorosłe nicienie)
UIP400MTP 80% amplitudy, 20 cykli (każdy cykl sonikacji: 30 s ON, 30 s OFF)
Bufor do lizy:

• Opcja 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opcja 2) dla ko-immunoprecypitacji (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP-40 (kompletny koktajl inhibitorów proteaz).

Fragmentacja DNA o wysokiej wydajności
C. elegans (dorosłe nicienie) DNA 200-300bp: Sonikator płytkowy UIP400MTP – ustawiona amplituda 80%, 30 impulsów – każde 30 s włączone, 30 s wyłączone

Sonikator płytkowy UIP400MTP do wysokowydajnego przygotowywania próbek równomiernie sonifikuje próbki na płytkach wielodołkowych, mikrotitracyjnych i 96-dołkowych.

Ultradźwiękowa liza C. elegans do ilościowych testów oczyszczania powinowactwa

Zarodki C. elegans (∼2 miliony na replikę) zostały świeżo zebrane w biologicznych triplikatach poprzez wybielanie młodych hermafrodytów i poddane sonikacji na lodzie (cykl: 0,5 s, amplituda: 40-45%, 5 uderzeń/sesję, 5 sesji, przerwa między sesjami: 30 s; Procesor ultradźwiękowy UP200S z mikro-końcówką S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) w buforze do lizy (całkowita objętość: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerol, mieszanina inhibitorów proteazy, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Po sonikacji dodano Nonidet P-40 Substitute do 1%, a lizaty inkubowano z obrotem głowy nad ogonem w temperaturze 4°C przez 30 minut, a następnie wirowano przy 20 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Oczyszczony lizat był następnie odsysany bez naruszania górnej warstwy lipidowej i dzielony na pół do kulek agarozowych anty-GFP lub zablokowanych kulek kontrolnych (40-50 μl). Po rotacji w temperaturze 4°C przez 60-90 minut, kulki przemyto raz buforem lizującym zawierającym 0,1% Nonidet P-40 Substitute, a następnie dwukrotnie przemyto buforem I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) lub buforem II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) lub obydwoma. Dla GFP:MBK-2 pull-downs przeprowadzono dwa oddzielne eksperymenty przy użyciu różnych warunków płukania. Białka eluowano przez wytrząsanie orbitalne w 50 μl 6 m mocznika/2 M tiomocznika w temperaturze pokojowej. W przypadku eksperymentów MBK-1::GFP pull-down, białka eluowano dwukrotnie przez wytrząsanie w 50 μl 8 m chlorku guanidyny w temperaturze 90°C, a następnie wytrącano etanolem. Wymyte próbki białek były następnie trawione w roztworze.
(por. Chen et al., 2016)

Ultradźwiękowa homogenizacja i liza robaków

W przypadku procedury lizy C.elegans i ekstrakcji białek, 30 000 nicieni odpowiedniego stadium zebrano na próbkę i przemyto w lodowatym roztworze S-basal, zagęszczono przez wirowanie przy 1500 obr? min przez 2 minuty, przemyto sześciokrotnie lodowatym roztworem S-basal w celu usunięcia pozostałości bakterii, a następnie przechowywano w lodzie do czasu gotowości do użycia. W celu ekstrakcji białek, dorosłym robakom ciężarnym pozwolono utworzyć zwarty osad po ostatnim płukaniu S-basal. Pelety robaków zostały następnie ponownie zawieszone w 1 ml lodowatego buforu ekstrakcyjnego [20 mM fosforan potasu, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitory proteazy (Sigma P2714)] i natychmiast przetworzone.
∼30 000 dorosłych robaków ciężarnych (odpowiadających ∼100 mg mokrej masy) poddano działaniu ultradźwięków na lodzie za pomocą ultrasonografu typu sondy (np. UP50H z mikrotipem MS2) o amplitudzie 40% przez 10 cykli po 3 sekundy włączania i 30 sekund wyłączania, w 1 ml lodowatego buforu ekstrakcyjnego. (por. Baskharan et al. 2012)

Ultradźwiękowa ekstrakcja lipidów z C. elegans

W lipidomice, gałęzi metabolomiki, charakteryzowane i analizowane jest uzupełnienie lipidowe systemów biologicznych. C. elegans są szeroko stosowane w lipidomice do badania interakcji lipidów metabolicznych i ich wpływu na zdrowie i długość życia.
Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja jest stosowana do uwalniania lipidów, takich jak sfingolipidy z zarodków, larw i dorosłych robaków C. elegans. Ultradźwięki stosuje się do przygotowania homogenatów robaków, a następnie do ekstrakcji lipidów z próbki.
Protokół ultradźwiękowej ekstrakcji lipidów z C. elegans
Rozmrozić osad C. elegans na lodzie i ponownie zawiesić w 0,5 ml ultrawody. Sonikować próbki C. elegans w probówkach o pojemności 1,5 ml, utrzymując próbki stale na lodzie.
Sonikację można przeprowadzić przy użyciu sondy-ultradźwiękowej, takiej jak UP200Htultradźwiękowy moduł przygotowania próbki VialTweeter (jednoczesna sonikacja 10 próbek) lub UIP400MTP (do sonikacji płytek wielodołkowych, takich jak płytki 96-dołkowe).Do lizy ultradźwiękowej z UP200Ht należy użyć mikro-końcówki S26d2. Wstępnie ustawić tryb cyklu ultradźwiękowego w menu cyfrowym. Ustawić amplitudę na 10% i tryb cyklu sonikacji 2-sekundowych impulsów 20 cykli z przerwą 30 sek. pomiędzy każdym impulsem ultradźwiękowym.
Przenieść supernatanty do szklanych probówek z zakrętką. Przeprowadzić ekstrakcję Folcha, dodając 1 ml ultrawody do każdej szklanej probówki, a następnie dodając 6 ml mieszaniny chloroformu i metanolu (stosunek = 2:1) do każdej szklanej probówki.
Worteksować każdą szklaną probówkę przez 30 sekund 4 razy. Wirować probówki z prędkością 1 258 x g przez 15 minut (Eppendorf, 5810 R) w celu dalszego zwiększenia separacji faz. Przenieść dolną frakcję hydrofobową do czystej szklanej probówki za pomocą szklanej pipety Pasteura. Wysuszyć dolną frakcję hydrofobową pod strumieniem azotu w wyparce azotu. Przechowywać wysuszony osad w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

Ultradźwiękowe przygotowanie lizatów robaków

Lizat robaków: Robaki w stadium L4 zebrano i przemyto trzykrotnie buforem M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄85,56 mM NaCl i 0,87 mM MgSO₄) w celu usunięcia wszystkich bakterii. Po usunięciu jak największej ilości buforu M9, robaki zawieszono ponownie w buforze lizującym: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM fosforan β-glicerolu, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorek sodu, 1 mM ortowanadan sodu, 5 mM pirofosforan sodu, 0,2 mM fenylometanosulfonylofluorek i inhibitor proteazy. Robaki zamrażano w ciekłym azocie i rozmrażano w temperaturze 37°C trzykrotnie, a następnie poddawano sonikacji na suchym lodzie za pomocą ultradźwiękowego urządzenia VialTweeter w celu jednoczesnego przygotowania 10 probówek z próbkami. Sonikację przeprowadzono przy 50% amplitudzie w 10 cyklach po 2 sek. z 30-sekundową przerwą między seriami sonikacji. Następnie próbki odwirowano przy 12000 obr/min w temperaturze 4°C przez 15 minut. Supernatant zebrano i przechowywano w temperaturze -70°C. Podwielokrotność wykorzystano do kwantyfikacji białka za pomocą testu Bradforda.
Oznaczanie całkowitego glutationu, GSH i GSSG: W celu ilościowego oznaczenia glutationu, lizaty i oznaczenia wykonano tego samego dnia. Larwy karmione glukozą i kontrolne larwy L4 zostały zebrane i trzykrotnie przepłukane buforem M9. Po usunięciu jak największej ilości buforu M9, robaki zawieszono ponownie w lodowatym kwasie metafosforowym (5% w/v), a następnie poddano sonikacji w lodzie za pomocą ultradźwiękowego VialTweeter o amplitudzie 50% w dziesięciu cyklach sonikacji po 2 sekundy z 30-sekundową przerwą między każdym cyklem. Następnie wirowano przy 12000 obr/min w temperaturze 4°C przez 15 min.
(por. Alcántar-Fernández i in., 2018)

Przygotowanie próbki C. elegans przed immunoprecypitacją i Western Blotting

W skrócie, w przypadku ekstraktów zarodkowych, larwy C. elegans L1 hodowano w dużych płynnych kulturach S-medium do osiągnięcia dorosłości. Zarodki zostały zebrane przy użyciu standardowej metody wybielania i zawieszone w buforze lizującym (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 Protease Inhibitor Cocktail i 1􏰅 Phosphatase Inhibitor Cocktail I i II), szybko zamrożone w ciekłym azocie i poddane lizie przez ultradźwiękowe rozbicie komórek przy użyciu ultrasonografu z mikrokońcówką, takiego jak UP200Ht z S26d2 dla 10 impulsów przez 10 s przy 30% amplitudzie. Jeśli konieczne jest przygotowanie większej liczby próbek, ultradźwiękowe VialTweeter lub MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP do płytek studzienkowych. Po sonikacji ekstrakty zostały wstępnie oczyszczone przez odwirowanie przy 30 000g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Wstępnie oczyszczony ekstrakt (300 µg całkowitego białka) inkubowano z 40µ􏰂g oczyszczonego przeciwciała powinowactwa anty-CDC-25.1 (niniejsze badanie) usieciowanego do białka A-agarozy lub jako kontrolę, podobną ilość króliczej immunoglobuliny (Ig) G usieciowanej do białka A-agarozy zastosowano w całkowitej objętości 200 µl buforu lizującego zawierającego 1% NP-40, którego włączenie zmniejszyło niespecyficzne wiązanie białek z matrycą. Próbki obracano przez 1 godzinę w temperaturze 4°C, kulki przemywano trzykrotnie buforem lizującym i eluowano 30 µl glicyny/HCl i 200 mM NaCl, pH 2,2. Po immunoprecypitacji, eluaty rozcieńczano w 30µ􏰂l buforze do próbek SDS, ogrzewano do 95°C przez 4 minuty i zazwyczaj 3% całości dla danych wejściowych i 30% dla eluatów stosowano do SDS-PAGE, a następnie Western blotting z przeciwciałami anty-CDC-25.1 (1:400), anty-LIN-23 (1:750), anty-ubikwityna (1:1000), anty-GSK3􏰁 (1:500) lub anty-􏰁β-aktyna (1:2000). W przypadku, gdy ekstrakty nie zostały poddane immunoprecypitacji, taką samą ilość całkowitego białka pochodzącego z tych ekstraktów ponownie zawieszono w buforze do próbek SDS, podgrzano do 95°C, a następnie bezpośrednio nałożono na SDS-PAGE i analizowano metodą Western blotting. (por. Segref et al. 2020)

Liza ultradźwiękowa pod precyzyjną kontrolą temperatury

Precyzyjna i niezawodna kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie podczas pracy z próbkami biologicznymi. Wysokie temperatury inicjują indukowaną termicznie degradację białek w próbkach.
Podobnie jak wszystkie mechaniczne techniki przygotowania próbek, sonikacja wytwarza ciepło. Jednak temperatura próbek może być dobrze kontrolowana podczas korzystania z VialTweeter. Przedstawiamy różne opcje monitorowania i kontrolowania temperatury próbek podczas przygotowywania ich do analizy za pomocą VialTweeter i VialPress.

1. Monitorowanie temperatury próbki: Procesor ultradźwiękowy UP200St, który napędza VialTweeter, jest wyposażony w inteligentne oprogramowanie i podłączany czujnik temperatury. Podłącz czujnik temperatury do UP200St i włóż końcówkę czujnika temperatury do jednej z próbówek. Za pomocą cyfrowego kolorowego wyświetlacza dotykowego można ustawić w menu UP200St określony zakres temperatur dla sonikacji próbki. Ultradźwięk automatycznie zatrzyma się po osiągnięciu maksymalnej temperatury i zatrzyma się, aż temperatura próbki spadnie do niższej wartości ustawionej temperatury ∆. Następnie sonikacja rozpocznie się automatycznie ponownie. Ta inteligentna funkcja zapobiega degradacji spowodowanej ciepłem.
2. Blok VialTweeter może być wstępnie schłodzony. Umieszczenie bloku VialTweeter (tylko sonotrody bez przetwornika!) w lodówce lub zamrażarce w celu wstępnego schłodzenia bloku tytanowego pomaga opóźnić wzrost temperatury próbki. Jeśli to możliwe, sama próbka może być również wstępnie schłodzona.
3. Do chłodzenia podczas sonikacji należy używać suchego lodu. Użyj płytkiej tacy wypełnionej suchym lodem i umieść VialTweeter na suchym lodzie, aby ciepło mogło szybko się rozproszyć.

Znajdź optymalny ultradźwiękowy rozbijacz komórek do swojej aplikacji lizy

Hielscher Ultrasonics jest długoletnim doświadczonym producentem wysokowydajnych ultradźwiękowych rozbijaczy komórek i homogenizatorów dla laboratoriów, systemów stołowych i przemysłowych. Wielkość hodowli komórek bakteryjnych, cel badawczy lub produkcyjny oraz ilość komórek do przetworzenia w ciągu godziny lub dnia są podstawowymi czynnikami umożliwiającymi znalezienie odpowiedniego ultradźwiękowego rozbijacza komórek do danego zastosowania.
Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania do jednoczesnej sonikacji wielu próbek (do 10 fiolek), jak również próbek masowych (tj. płytek mikrotitracyjnych? 96-dołkowych), klasyczny ultrasonograf laboratoryjny typu sondowego o różnych poziomach mocy od 50 do 400 watów do w pełni przemysłowych procesorów ultradźwiękowych o mocy do 16 000 watów na jednostkę do komercyjnego rozbijania komórek i ekstrakcji białek w dużej produkcji. Wszystkie ultradźwięki Hielscher są zbudowane do pracy 24/7/365 pod pełnym obciążeniem. Solidność i niezawodność to podstawowe cechy naszych urządzeń ultradźwiękowych.
Wszystkie cyfrowe homogenizatory ultradźwiękowe są wyposażone w inteligentne oprogramowanie, kolorowy wyświetlacz dotykowy i automatyczne protokołowanie danych, które sprawiają, że urządzenie ultradźwiękowe jest wygodnym narzędziem pracy w laboratorium i zakładach produkcyjnych.
Daj nam znać, jaki rodzaj komórek, jaka objętość, z jaką częstotliwością i z jakim celem musisz przetworzyć swoje próbki biologiczne. Polecimy Ci najbardziej odpowiedni ultradźwiękowy rozbijacz komórek dla Twoich wymagań procesowych.

Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych systemów ultradźwiękowych, od kompaktowych ręcznych homogenizatorów i ultradźwięków MultiSample po przemysłowe procesory ultradźwiękowe do zastosowań komercyjnych: