Proteomiczne przepływy pracy z wysokoprzepustowym trawieniem białek

Proteomika jest dziedziną niezbędną do zrozumienia procesów i systemów biologicznych, a trawienie białek stanowi krytyczny etap w jej przepływach pracy. Tradycyjnie trawienie białek przeprowadza się w roztworze przy użyciu enzymów proteolitycznych, takich jak trypsyna, która specyficznie hydrolizuje wiązania peptydowe w resztach lizyny i argininy. Proces ten generuje peptydy dobrze nadające się do jonizacji i fragmentacji w zastosowaniach spektrometrii mas (MS). Jednak konwencjonalne metody trawienia wymagają 12-24 godzin, aby je zakończyć, tworząc znaczące wąskie gardła w proteomicznych przepływach pracy.
Ultradźwięki oferują potężną alternatywę, radykalnie skracając czas trawienia z godzin do zaledwie kilku minut. W połączeniu z zaawansowanymi sonikatorami wielopróbkowymi, takimi jak Hielscher CupHorn, VialTweeter i sonikator do płytek 96-dołkowych UIP400MTP, ultradźwięki umożliwiają przyspieszoną, wysokowydajną proteomikę. Technologie te usprawniają przepływy pracy, skracając czas przygotowania próbek i zwiększając wydajność bez uszczerbku dla odtwarzalności lub jakości danych.

Rola energii ultradźwiękowej w trawieniu białek

Ultradźwięki wykorzystują skupione fale ultradźwiękowe do tworzenia zlokalizowanych kawitacyjnie mikropęcherzyków, które zapadają się, generując intensywne siły ścinające. Zjawisko to zwiększa transfer masy, sprzyja mieszaniu enzymów z substratami i rozwija struktury białkowe, odsłaniając miejsca rozszczepienia enzymom proteolitycznym, takim jak trypsyna.
Rezultat? Znaczne skrócenie czasu trawienia bez uszczerbku dla wydajności i powtarzalności.

Trawienie proteolityczne wspomagane ultradźwiękami: Metodologia i wyniki

Protokół przyspieszonego trawienia

Trawienie wspomagane ultradźwiękami łączy enzymy proteolityczne i energię ultradźwiękową w celu przyspieszenia przepływu pracy. Na przykład, przy użyciu Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), proces trawienia przebiega w następujący sposób:

1. Redukcja: Próbki białka (0,5 mg/ml, 20 µL) są traktowane DTT (2 µL, 110 mM) w buforze wodorowęglanu amonu (12,5 mM). Sonikacja jest stosowana przy 50% amplitudzie przez 5 minut.
2. Alkilacja: Po dodaniu IAA (2 µL, 400 mM), sonikacja jest powtarzana w tych samych warunkach.
3. Trawienie: Próbki są rozcieńczane i inkubowane z unieruchomionymi nanocząsteczkami trypsyny. Ostatnia runda sonikacji (5 minut) kończy trawienie. Peptydy są oddzielane, suszone i przechowywane do analizy MS.

Ta ultradźwiękowa metoda skraca całkowity czas przygotowania z 12 godzin do poniżej 30 minut. Pomimo przyspieszonego procesu, wydajność i jakość peptydów pozostają spójne z tradycyjnymi metodami nocnymi.

Wydajność ultradźwiękowego trawienia białek

W badaniach porównawczych z wykorzystaniem proteomów E. coli:

• Identyfikacja białka: Próbki trawione ultradźwiękami zidentyfikowały 777 białek w ciągu 5 minut, w porównaniu do 817 w ciągu 12 godzin. Identyfikacja wspólnych białek przekroczyła 70%.
• Powtarzalność: Powtórzone analizy wykazały wartości korelacji powyżej 98% w ramach każdej metody, wykazując niezawodność.
• Selektywność: Niektóre białka były preferencyjnie trawione każdą metodą, przy czym trawienie ultradźwiękowe sprzyjało 65 białkom, a trawienie nocne 54 białkom. Takie zniuansowane różnice podkreślają wyjątkowy potencjał ultradźwięków do konkretnych zastosowań.

Wyniki kwantyfikacji białek bez znakowania dla siedmiu białek wprowadzonych do bakterii E. coli
próbka. Następujące białka zostały dodane na dwóch różnych poziomach, jak zaznaczono w kolumnie
nazwany "Theo Ratio". Theo Ratio to teoretyczny stosunek między dwoma poziomami używanymi w tym przypadku.
eksperyment. Albumina surowicy bydlęcej (ALBU), β-laktoglobulina (LACB), kazeina α-S1 (CASA1),
α-S2 kazeina (CASA2), cytochrom c (CYC), albumina jaja kurzego (OVAL) i anhydraza węglanowa 2
(CAH2). Stosunki zostały obliczone przy użyciu intensywności białek LFQ uzyskanych z MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Opracowanie i grafika: © Martins et al., 2019)

Trypsyna immobilizowana w nanocząsteczkach

Integracja unieruchomionych nanocząstek trypsyny (np. T-FMNP) z ultradźwiękami dodatkowo usprawnia przepływy pracy w proteomice. Nanocząstki te zapewniają dużą powierzchnię do interakcji enzym-substrat, zwiększając wydajność. W przypadku zastosowania do złożonych proteomów, takich jak E. coli, połączona metoda osiąga:

• Prędkość: Całkowite trawienie w ciągu 5 minut.
• Dokładność: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Skalowalność: Adaptacja do platform wielodołkowych, takich jak UIP400MTP, umożliwia przetwarzanie z wysoką przepustowością.

Kliknij tutaj, aby uzyskać szczegółowy protokół z instrukcjami krok po kroku!
(por. Martins i in., 2019)

Trawienie proteolityczne z dużą prędkością i wysoką wydajnością za pomocą sonikatorów Hielschera

Najlepsze modele sonikatorów do proteomiki

Hielscher Ultrasonics oferuje różne modele sonikatorów do jednoczesnego przygotowywania wielu próbek, ułatwiając przepływy pracy o wysokiej wydajności. Niezależnie od tego, czy pracujesz z fiolkami, probówkami, płytkami wielodołkowymi (np. 6-, 24-, 96-dołkowymi) czy płytkami Petriego – oferujemy idealne sonikatory do eksperymentów.

Sonikator wielodołkowy UIP400MTP

Aby zapewnić najwyższą przepustowość, UIP400MTP zapewnia możliwość ultradźwiękowego przetwarzania 96-dołkowych płytek. Kompatybilny z każdą standardową mikropłytką, UIP400MTP nie wymaga drogich, zastrzeżonych materiałów jednorazowych i daje swobodę wyboru najlepszej płytki wielodołkowej do badań. Dostarczając jednolitą energię na całej płytce, umożliwia szybką redukcję, alkilację i trawienie do 200 złożonych proteomów w ciągu zaledwie 1 godziny. Ten poziom automatyzacji i wydajności ma kluczowe znaczenie dla wysokowydajnej proteomiki i zastosowań klinicznych. Dowiedz się więcej o sonikatorze wielodołkowym!

VialTweeter

VialTweeter jest dostosowany do potrzeb laboratoriów wymagających jednoczesnej sonikacji do 10 fiolek lub probówek. Jego nieinwazyjne podejście eliminuje ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, zapewniając jednocześnie powtarzalne trawienie białek. Urządzenie to jest idealne dla badaczy pracujących z ograniczonymi objętościami próbek lub różnymi typami próbek.
Dowiedz się więcej o wieloprzetwornikowym sonikatorze VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikator CupHorn to potężne urządzenie przeznaczone do jednoczesnego przetwarzania wielu próbek w szczelnych pojemnikach. Zapewnia równomierny rozkład energii ultradźwiękowej i precyzyjną kontrolę temperatury. Zdolność do jednoczesnego przetwarzania do pięciu próbek, w połączeniu z kompatybilnością ze zredukowanymi, alkilowanymi i trawionymi przepływami pracy, czyni CupHorn niezawodnym narzędziem do proteomiki opartej na MS.
Dowiedz się więcej o CupHorn SonoReactor!

Protokół krok po kroku dla wspomaganego ultradźwiękami trawienia proteolitycznego z użyciem unieruchomionej nanocząsteczkami trypsyny

Protokół Martinsa i wsp. (2019) jest zoptymalizowany pod kątem szybkiego trawienia białek przy użyciu energii ultradźwiękowej i unieruchomionej nanocząsteczkami trypsyny (T-FMNP). Przedstawione kroki zapewniają skuteczną redukcję, alkilację i proteolizę odpowiednią do zastosowań w spektrometrii mas (MS).
Kroki protokołu

1. Redukcja wiązań dwusiarczkowych
   • Dodaj 2 µL roztworu DTT (110 mM) do 20 µL próbki białka (0,5 mg/mL) w buforze AmBic.
   • Umieścić probówkę z próbką w sonoreaktorze UP200St-CupHorn.
   • Sonikacja próbki przez 2,5 minuty przy 50% amplitudzie (200 W, 26 kHz).
   • Zatrzymać na krótką przerwę, aby umożliwić chłodzenie, a następnie poddać sonikacji przez kolejne 2,5 minuty w tych samych warunkach.
2. Alkilacja zredukowanych reszt cysteinowych
   • Dodaj 2 µL roztworu IAA (400 mM) do zredukowanej próbki białka.
   • Sonikacja przez 2,5 minuty przy 50% amplitudzie w celu ułatwienia alkilacji.
   • Wstrzymać chłodzenie, a następnie poddać działaniu ultradźwięków przez dodatkowe 2,5 minuty.

   Uwaga: Zminimalizuj ekspozycję alkilowanej próbki na światło, aby zapobiec degradacji IAA.

3. Rozcieńczanie próbki
   • Rozcieńczyć alkilowaną próbkę białka do końcowej objętości 100 µL przy użyciu 25 mM buforu AmBic zawierającego 4% acetonitrylu (v/v).
   • Dokładnie wymieszać przez delikatne pipetowanie.
4. Trawienie proteolityczne za pomocą unieruchomionej w nanocząsteczkach trypsyny
   • Dodać 20 µl roztworu T-FMNP (3 mg/ml) do rozcieńczonej próbki białka.
   • Sonifikować mieszaninę w sonoreaktorze przez 2,5 minuty przy 50% amplitudzie.
   • Wstrzymać chłodzenie, a następnie poddać sonikacji przez kolejne 2,5 minuty w tych samych warunkach.
5. Separacja nanocząsteczek trypsyny
   • Za pomocą magnesu oddzielić T-FMNP od supernatantu zawierającego strawione peptydy.
   • Przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
6. Przygotowanie peptydów do analizy MS
   • Wysuszyć supernatant zawierający peptydy w wirówce próżniowej.
   • Przechowywać wysuszone peptydy w temperaturze -20°C do czasu dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas.