Procedury proteomiczne z wysokowydajnym trawieniem białek

Proteomika jest dziedziną niezbędną do zrozumienia procesów i układów biologicznych, a trawienie białek stanowi kluczowy etap jej procedur. Tradycyjnie trawienie białek przeprowadza się w roztworze przy użyciu enzymów proteolitycznych, takich jak trypsyna, która swoiście hydrolizuje wiązania peptydowe przy resztach lizyny i argininy. Proces ten prowadzi do powstania peptydów dobrze nadających się do jonizacji i fragmentacji w zastosowaniach spektrometrii mas (MS). Jednak konwencjonalne metody trawienia wymagają 12–24 godzin do zakończenia procesu, co tworzy istotne wąskie gardła w procedurach proteomicznych.
Sonikacja stanowi skuteczną alternatywę, radykalnie skracając czas trawienia z godzin do zaledwie kilku minut. W połączeniu z zaawansowanymi sonikatorami do wielu próbek, takimi jak Hielscher CupHorn, VialTweeter i sonikator do płytek 96-dołkowych UIP400MTP, sonikacja umożliwia przyspieszone, wysokowydajne analizy proteomiczne. Technologie te usprawniają procedury, skracając czas przygotowania próbek i zwiększając efektywność bez pogorszenia powtarzalności ani jakości danych.

Rola energii ultradźwiękowej w trawieniu białek

Sonikacja wykorzystuje skupione fale ultradźwiękowe do wywoływania kawitacji – miejscowego powstawania mikropęcherzyków, które zapadają się, generując intensywne siły ścinające. Zjawisko to zwiększa transport masy, sprzyja mieszaniu enzymów z substratami i rozwija struktury białek, odsłaniając miejsca cięcia dla enzymów proteolitycznych, takich jak trypsyna.
Rezultat? Znaczne skrócenie czasu trawienia bez pogorszenia efektywności ani powtarzalności.

Trawienie proteolityczne wspomagane ultradźwiękami: metodyka i wyniki

Protokół przyspieszonego trawienia

Trawienie wspomagane ultradźwiękami łączy enzymy proteolityczne i energię ultradźwiękową w celu przyspieszenia procedur. Na przykład przy użyciu Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) procedura trawienia przebiega następująco:

1. Redukcja: Próbki białek (0,5 mg/mL, 20 µL) poddaje się działaniu DTT (2 µL, 110 mM) w buforze wodorowęglanu amonu (12,5 mM). Sonikację prowadzi się przy amplitudzie 50% przez 5 minut.
2. Alkilacja: Po dodaniu IAA (2 µL, 400 mM) sonikację powtarza się w tych samych warunkach.
3. Trawienie: Próbki rozcieńcza się i inkubuje z nanocząstkami z immobilizowaną trypsyną. Ostatni etap sonikacji (5 minut) kończy trawienie. Peptydy oddziela się, suszy i przechowuje do analizy MS.

Ta metoda ultradźwiękowa skraca całkowity czas przygotowania z 12 godzin do mniej niż 30 minut. Pomimo przyspieszenia procesu wydajność uzyskiwania peptydów i ich jakość pozostają zgodne z wynikami tradycyjnych metod prowadzonych przez noc.

Efektywność ultradźwiękowego trawienia białek

W badaniach porównawczych z wykorzystaniem proteomów E. coli:

• Identyfikacja białek: W próbkach trawionych ultradźwiękowo zidentyfikowano 777 białek w ciągu 5 minut, w porównaniu z 817 w ciągu 12 godzin. Odsetek białek zidentyfikowanych obiema metodami przekraczał 70%.
• Powtarzalność: Analizy wykonane w powtórzeniach wykazały wartości korelacji powyżej 98% w obrębie każdej metody, potwierdzając ich niezawodność.
• Selektywność: Każda z metod preferencyjnie trawiła określone białka: trawienie ultradźwiękowe sprzyjało trawieniu 65 białek, a trawienie przez noc – 54 białek. Takie subtelne różnice podkreślają wyjątkowy potencjał sonikacji w określonych zastosowaniach.

Wyniki ilościowego oznaczania białek bez znakowania w próbce E. coli
z dodatkiem siedmiu białek. Następujące białka dodano na dwóch różnych poziomach, jak wskazano w kolumnie
nazwanej „Theo Ratio”. Theo Ratio to teoretyczny stosunek między dwoma poziomami zastosowanymi w tym
eksperymencie. Albumina surowicy bydlęcej (ALBU), β-laktoglobulina (LACB), kazeina α-S1 (CASA1),
kazeina α-S2 (CASA2), cytochrom c (CYC), owoalbumina (OVAL) i anhydraza węglanowa 2
(CAH2). Stosunki obliczono na podstawie intensywności sygnałów białek LFQ uzyskanych z analizy w programie MaxQuant.
Test t-Studenta zastosowano do porównania wartości uzyskanych każdą metodą (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Badanie i grafika: © Martins et al., 2019)

Trypsyna immobilizowana na nanocząstkach

Połączenie nanocząstek z immobilizowaną trypsyną (np. T-FMNPs) z sonikacją dodatkowo usprawnia procedury proteomiczne. Nanocząstki te zapewniają dużą powierzchnię dla oddziaływań enzym–substrat, zwiększając efektywność. W przypadku złożonych proteomów, takich jak proteom E. coli, połączona metoda zapewnia:

• Szybkość: Całkowite trawienie w ciągu 5 minut.
• Dokładność: Ilościowe oznaczanie białek porównywalne z tradycyjnymi metodami (p > 0,01, n=3).
• Skalowalność: Dostosowanie do platform wielodołkowych, takich jak UIP400MTP, umożliwia wysokowydajne przetwarzanie.

Kliknij tutaj, aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem i instrukcjami krok po kroku!
(por. Martins et al., 2019)

Szybkie i wysokowydajne trawienie proteolityczne za pomocą sonikatorów Hielscher

Najlepsze modele sonikatorów do proteomiki

Hielscher Ultrasonics oferuje różne modele sonikatorów do jednoczesnego przygotowania wielu próbek, ułatwiające realizację wysokowydajnych procedur. Niezależnie od tego, czy pracujesz z fiolkami, probówkami, płytkami wielodołkowymi (np. płytkami 6-, 24-, 96-dołkowymi), czy szalkami Petriego – oferujemy idealne sonikatory do Twoich eksperymentów.

Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP

Aby zapewnić najwyższą wydajność przetwarzania próbek, UIP400MTP umożliwia ultradźwiękowe przetwarzanie płytek 96-dołkowych. UIP400MTP jest kompatybilny z każdą standardową mikropłytką, nie wymaga drogich materiałów jednorazowych przeznaczonych wyłącznie do tego urządzenia i daje swobodę wyboru najlepszej płytki wielodołkowej do Twoich badań. Dzięki równomiernemu dostarczaniu energii na całej płytce umożliwia szybką redukcję, alkilację i trawienie nawet 200 złożonych proteomów w zaledwie 1 godzinę. Ten poziom automatyzacji i efektywności ma kluczowe znaczenie dla wysokowydajnej proteomiki i zastosowań klinicznych. Dowiedz się więcej o sonikatorze do płytek wielodołkowych!

VialTweeter

VialTweeter jest dostosowany do potrzeb laboratoriów wymagających jednoczesnej sonikacji do 10 fiolek lub probówek. Jego nieinwazyjny sposób działania eliminuje ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, zapewniając jednocześnie powtarzalne trawienie białek. Urządzenie to jest idealne dla badaczy pracujących z ograniczonymi objętościami próbek lub różnymi typami próbek.
Dowiedz się więcej o sonikatorze do wielu probówek VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikator CupHorn to urządzenie o dużej mocy, przeznaczone do jednoczesnego przetwarzania wielu próbek w szczelnie zamkniętych pojemnikach. Zapewnia równomierny rozkład energii ultradźwiękowej i precyzyjną kontrolę temperatury. Możliwość jednoczesnego przetwarzania do pięciu próbek, w połączeniu z kompatybilnością z procedurami obejmującymi redukcję, alkilację i trawienie, sprawia, że CupHorn jest niezawodnym narzędziem do proteomiki opartej na MS.
Dowiedz się więcej o CupHorn SonoReactor!

Protokół krok po kroku dotyczący trawienia proteolitycznego wspomaganego sonikacją z użyciem trypsyny immobilizowanej na nanocząstkach

Ten protokół opracowany przez Martins et al. (2019) jest zoptymalizowany pod kątem szybkiego trawienia białek przy użyciu energii ultradźwiękowej i trypsyny immobilizowanej na nanocząstkach (T-FMNPs). Opisane etapy zapewniają efektywną redukcję, alkilację i proteolizę odpowiednią do zastosowań spektrometrii mas (MS).
Etapy protokołu

1. Redukcja wiązań disiarczkowych
   • Dodaj 2 µL roztworu DTT (110 mM) do 20 µL próbki białka (0,5 mg/mL) w buforze AmBic.
   • Umieść probówkę z próbką w sonoreaktorze UP200St-CupHorn.
   • Poddawaj próbkę sonikacji przez 2,5 minuty przy amplitudzie 50% (200 W, 26 kHz).
   • Zrób krótką przerwę, aby umożliwić schłodzenie, a następnie prowadź sonikację przez kolejne 2,5 minuty w tych samych warunkach.
2. Alkilacja zredukowanych reszt cysteinowych
   • Dodaj 2 µL roztworu IAA (400 mM) do zredukowanej próbki białka.
   • Prowadź sonikację przez 2,5 minuty przy amplitudzie 50%, aby ułatwić alkilację.
   • Zrób przerwę na schłodzenie, a następnie prowadź sonikację przez dodatkowe 2,5 minuty.

   Uwaga: Ogranicz do minimum ekspozycję alkilowanej próbki na światło, aby zapobiec degradacji IAA.

3. Rozcieńczanie próbki
   • Rozcieńcz alkilowaną próbkę białka do końcowej objętości 100 µL, używając buforu AmBic o stężeniu 25 mM zawierającego 4% acetonitrylu (v/v).
   • Dokładnie wymieszaj przez delikatne pipetowanie.
4. Trawienie proteolityczne z użyciem trypsyny immobilizowanej na nanocząstkach
   • Dodaj 20 µL roztworu T-FMNP (3 mg/mL) do rozcieńczonej próbki białka.
   • Poddawaj mieszaninę sonikacji w sonoreaktorze przez 2,5 minuty przy amplitudzie 50%.
   • Zrób przerwę na schłodzenie, a następnie prowadź sonikację przez kolejne 2,5 minuty w tych samych warunkach.
5. Oddzielanie nanocząstek z trypsyną
   • Użyj magnesu, aby oddzielić T-FMNPs od supernatantu zawierającego peptydy powstałe w wyniku trawienia.
   • Przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
6. Przygotowanie peptydów do analizy MS
   • Wysusz supernatant zawierający peptydy w wirówce próżniowej.
   • Przechowuj wysuszone peptydy w temperaturze -20°C do czasu dalszej analizy metodą spektrometrii mas.