Ultradźwiękowe przygotowanie próbek z wykorzystaniem filtrów (FASP): usprawnianie procedur proteomicznych dzięki zaawansowanej sonikacji

Ultradźwiękowe przygotowanie próbek z wykorzystaniem filtrów (FASP) staje się wysoce wydajną i powtarzalną metodą we współczesnej proteomice. Włączając kontrolowaną sonikację do ugruntowanych procedur FASP, badacze mogą znacząco poprawić ekstrakcję białek, wydajność trawienia i ogólną jakość danych. Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na przygotowanie próbek o wysokiej wydajności przetwarzania i powtarzalności sonikatory skupiające energię ultradźwiękową, takie jak sonikator do mikropłytek UIP400MTP, zyskują na znaczeniu naukowym i praktycznym.

Kontekst naukowy: dlaczego FASP ma znaczenie w proteomice

Przygotowanie próbek z wykorzystaniem filtrów (FASP) stało się złotym standardem w proteomice typu bottom-up dzięki możliwości usuwania detergentów, soli i innych zanieczyszczeń przy jednoczesnym umożliwieniu wydajnego trawienia enzymatycznego. Klasyczne protokoły FASP często jednak napotykają ograniczenia związane z niepełną lizą, nierównomiernym trawieniem i zmiennością próbek – szczególnie w przypadku złożonych lub odpornych komórek bądź tkanek biologicznych.
Właśnie w tym zakresie skupiona energia ultradźwiękowa (sonikacja) zapewnia decydującą przewagę. Wprowadzając mechaniczne siły ścinające i kawitację, sonikacja usprawnia wiele kluczowych etapów procedury FASP bez naruszania integralności białek.

Korzystne efekty sonikacji w ultradźwiękowym FASP

Sonikacja wywołuje kontrolowaną kawitację akustyczną – powstawanie i zapadanie się mikroskopijnych pęcherzyków – która generuje lokalne siły ścinające i mikroprzepływy.
Sonikacja usprawnia zarówno etap alkilacji, jak i trawienia w ultradźwiękowym FASP, poprawiając transport masy i przyspieszając kinetykę reakcji. Zastosowanie energii ultradźwiękowej wywołuje kawitację, prowadząc do powstawania lokalnych mikroprzepływów i przejściowych sił ścinających, które sprzyjają szybkiemu mieszaniu i wydajnemu wnikaniu odczynników do matrycy białkowej lub środowiska filtra. Podczas alkilacji skutkuje to bardziej równomierną i szybszą modyfikacją reszt cysteinowych przez jodoacetamid. Na etapie trawienia sonikacja zwiększa dostępność miejsc cięcia proteolitycznego i poprawia oddziaływania enzym–substrat, przyspieszając tym samym działanie trypsyny i zwiększając wydajność trawienia. Ogólnie obróbka ultradźwiękowa skraca czas przetwarzania, utrzymując lub zwiększając stopień zakończenia reakcji i jej powtarzalność.

W przygotowaniu próbek do analiz proteomicznych ultradźwiękowe FASP przekłada się na:

• Wydajniejsze rozbijanie komórek i ekstrakcję białek, nawet w przypadku trudno poddających się obróbce tkanek lub próbek mikroorganizmów
• Lepszą solubilizację białek
• Lepszy dostęp enzymów do substratów podczas trawienia
• Skrócenie czasu przetwarzania i zwiększenie powtarzalności

W przeciwieństwie do konwencjonalnych mechanicznych lub chemicznych metod lizy obróbka ultradźwiękowa umożliwia wysoki stopień kontroli i skalowania, dzięki czemu szczególnie dobrze nadaje się do standaryzowanych procedur proteomicznych.

Zalety ultradźwiękowego FASP w porównaniu z konwencjonalnymi metodami

Włączenie sonikacji do protokołów FASP zapewnia wymierne korzyści, które bezpośrednio wpływają na wyniki późniejszej analizy metodą spektrometrii mas.
Ultradźwiękowe FASP umożliwia pełniejszy odzysk białek, szczególnie z trudnych próbek, takich jak tkanki włókniste lub biofilmy. Równomierny rozkład energii zapewnia jednakową obróbkę powtórzeń, ograniczając zmienność – co jest podstawowym wymogiem proteomiki ilościowej.
Ponadto sonikacja przyspiesza kinetykę trawienia poprzez poprawę oddziaływania enzym–substrat. Często skutkuje to krótszym czasem trawienia i większym uzyskiem peptydów przy zachowaniu pokrycia sekwencji.
Z perspektywy przebiegu procedury systemy ultradźwiękowe ograniczają konieczność ręcznej obsługi i eliminują potrzebę stosowania agresywnej obróbki chemicznej, zachowując integralność próbek i upraszczając standaryzację protokołów.

Diagram Venna przedstawiający większą liczbę białek zidentyfikowanych za pomocą ultradźwiękowego FASP w porównaniu z FASP prowadzonym przez noc
Ilustracja i badanie: ©Carvalho et al., 2020

Protokół: ultradźwiękowe FASP o wysokiej wydajności przetwarzania próbek z użyciem UIP400MTP

W laboratoriach przetwarzających duże grupy próbek sonikator do mikropłytek UIP400MTP umożliwia jednoczesną sonikację standardowych płytek wielodołkowych (np. płytek 96-dołkowych), znacząco zwiększając wydajność przetwarzania i powtarzalność.
W tym formacie próbki (zazwyczaj 50–200 µL na dołek) przygotowuje się bezpośrednio w mikropłytkach kompatybilnych z ultrafiltracją lub dalszym przetwarzaniem. Bufory do lizy są podobne do tych stosowanych w standardowych protokołach FASP.

UIP400MTP dostarcza równomiernie energię ultradźwiękową do wszystkich dołków. Sonikację zazwyczaj przeprowadza się przy amplitudzie 60–80% przez 2–4 minuty, w zależności od rodzaju próbki. Monitoruj temperaturę za pomocą podłączanego czujnika temperatury. Stosuj sonikację pulsacyjną i opcjonalnie chłodziarkę laboratoryjną.

Przykładowy protokół:

1. Na etapie alkilacji próbki poddaje się sonikacji przy użyciu sonikatora do mikropłytek (UIP400MTP) przy amplitudzie 40% przez 7 cykli (30 s pracy, 15 s przerwy; całkowity czas sonikacji: 5 min 45 s).
2. Po sonikacji roztwór jodoacetamidu (IAA) usuwa się przez wirowanie. Przed trawieniem trypsyną próbki należy przemyć, aby usunąć pozostałości mocznika, silnego czynnika chaotropowego hamującego aktywność enzymatyczną. Dlatego próbki przemywa się dwukrotnie 200 μL roztworu wodorowęglanu amonu (AmBic) o stężeniu 25 mM.
3. Następnie dodaje się 100 μL roztworu trypsyny (stosunek enzymu do białka 1:30) przygotowanego w roztworze wodorowęglanu amonu o stężeniu 12,5 mM. Trawienie białek przeprowadza się następnie przy użyciu UIP400MTP w tych samych warunkach sonikacji (amplituda 40%, 7 cykli, 30 s pracy / 15 s przerwy; całkowity czas: 5 min 45 s).
4. Po sonikacji próbki przenosi się na płytki filtracyjne lub przetwarza przy użyciu systemów FASP opartych na płytkach. Etapy redukcji i alkilacji przeprowadza się w płytce, zachowując sprawny przebieg procedury.
5. Trawienie trypsyną przeprowadza się w kontrolowanych warunkach (np. 37°C, 4–16 godzin), z możliwością zastosowania krótkiej stymulacji ultradźwiękowej w celu przyspieszenia aktywności enzymatycznej i zwiększenia uzysku peptydów.
6. Peptydy odzyskuje się przez wirowanie i są one gotowe do analizy LC-MS/MS.

Kluczową zaletą tego systemu jest możliwość zapewnienia identycznych warunków przetwarzania we wszystkich dołkach, co minimalizuje efekty serii i umożliwia wiarygodne porównania ilościowe w badaniach proteomicznych na dużą skalę.

Projektowanie, produkcja i doradztwo – jakość wyprodukowana w Niemczech

Sonikatory Hielscher są dobrze znane z najwyższych standardów jakości i konstrukcji. Wytrzymałość i łatwa obsługa umożliwiają sprawną integrację naszych sonikatorów z instalacjami przemysłowymi. Sonikatory Hielscher z łatwością radzą sobie z trudnymi warunkami i wymagającymi środowiskami.

Hielscher Ultrasonics jest firmą z certyfikatem ISO i kładzie szczególny nacisk na sonikatory o wysokiej wydajności, wykorzystujące najnowocześniejszą technologię i przyjazne dla użytkownika. Oczywiście sonikatory Hielscher są zgodne z wymogami CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.

Literatura / źródła

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).