Ekstrakcja białek wspomagana sonikacją na potrzeby fosfoproteomiki

We współczesnych naukach o życiu fosfoproteomika stała się fundamentalną technologią służącą do rozszyfrowywania komórkowych szlaków sygnałowych i zrozumienia mechanizmów chorób na poziomie systemowym. Ponieważ fosforylacja reguluje kluczowe funkcje biologiczne – od aktywności enzymów po oddziaływania białko–białko – jej precyzyjny pomiar jest niezbędny zarówno w badaniach podstawowych, jak i w medycynie translacyjnej. Najnowsze postępy w spektrometrii mas umożliwiły identyfikację dziesiątek tysięcy zdarzeń fosforylacji w pojedynczym eksperymencie, podkreślając potrzebę stosowania niezawodnych, skalowalnych i powtarzalnych procedur przygotowania próbek.
Jednym z osiągnięć o największym znaczeniu w tej dziedzinie jest wdrożenie ekstrakcji białek wspomaganej sonikacją, która znacząco poprawia jakość próbek, wydajność ich przetwarzania i powtarzalność. Technologie ultradźwiękowe, takie jak VialTweeter i UIP400MTP, wyznaczają obecnie nowe sposoby przetwarzania dużych zbiorów próbek w laboratoriach, szczególnie w fosfoproteomice o wysokiej wydajności przetwarzania próbek.

Znaczenie naukowe wydajnego przygotowania próbek w fosfoproteomice

Fosforylacja białek jest wysoce dynamiczną i odwracalną modyfikacją potranslacyjną, której podlega większość białek w komórkach ludzkich. Reguluje strukturę i lokalizację białek oraz sieci ich oddziaływań, a zaburzenia jej regulacji wiążą się z chorobami takimi jak nowotwory i neurodegeneracja.
Analiza fosfoproteomiczna stawia jednak szczególne wyzwania techniczne. Fosforylowane peptydy często występują w niewielkich ilościach i wymagają starannego wzbogacania oraz wysoce wydajnego przygotowania próbek na wcześniejszych etapach. Wszelkie niedostatki wydajności ekstrakcji lub trawienia białek mogą prowadzić do utraty sygnału, słabej powtarzalności i niepełnego pokrycia miejsc fosforylacji.
Właśnie tutaj sonikacja nabiera kluczowego znaczenia.

Dlaczego sonikacja zmienia ekstrakcję białek

Sonikacja wykorzystuje fale ultradźwiękowe o wysokim natężeniu do mechanicznego rozbijania komórek i tkanek, umożliwiając wydajne uwalnianie białek z komórek, tkanek, płynów biologicznych i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami lizy sonikacja oferuje kilka wyraźnych korzyści:

• Po pierwsze, zapewnia szybkie i równomierne rozbijanie komórek, co jest szczególnie ważne dla zachowania przejściowych stanów fosforylacji. W fosfoproteomice nawet niewielkie opóźnienia lub niepełna liza mogą zmieniać profile sygnalizacji, dlatego szybka i powtarzalna ekstrakcja jest niezbędna.
• Po drugie, sonikacja zwiększa uzysk białek i poprawia ich solubilizację, szczególnie w przypadku próbek trudnych do poddania lizie, takich jak tkanki o zwartej strukturze lub komórki bogate w błony. Przekłada się to bezpośrednio na lepsze trawienie na kolejnych etapach i odzysk fosfopeptydów.
• Po trzecie, obróbka ultradźwiękowa jest z natury skalowalna. Urządzenia takie jak VialTweeter umożliwiają jednoczesną sonikację wielu szczelnie zamkniętych probówek, zapewniając identyczne warunki obróbki wszystkich próbek. Eliminuje to zmienność wynikającą z ręcznego wykonywania czynności.
• W przypadku jeszcze wyższych wymagań dotyczących wydajności przetwarzania próbek UIP400MTP stanowi znaczący przełom technologiczny. Umożliwia bezpośrednią sonikację całych mikropłytek lub statywów z probówkami, w tym fiolek do autosamplera, dzięki czemu idealnie nadaje się do równoległego przetwarzania setek próbek. Możliwość ta jest szczególnie cenna w biologii systemowej i badaniach klinicznych, gdzie duże zbiory próbek są standardem.

Sonikacja o wysokiej wydajności przetwarzania próbek: VialTweeter i UIP400MTP w centrum uwagi

Włączenie zaawansowanych urządzeń ultradźwiękowych do procedur fosfoproteomicznych nie jest jedynie udogodnieniem – stanowi udoskonalenie metodologiczne.
VialTweeter jest przeznaczony do zsynchronizowanej obróbki ultradźwiękowej wielu zamkniętych fiolek, minimalizując zanieczyszczenie krzyżowe i zapewniając powtarzalność. Jest szczególnie odpowiedni do zastosowań o średniej wydajności przetwarzania próbek i do ustandaryzowanych procedur.
 

Z kolei UIP400MTP jest zoptymalizowany pod kątem środowisk o wysokiej wydajności przetwarzania próbek, umożliwiając:

• Równomierną sonikację całych standardowych mikropłytek, np. płytek 96-dołkowych lub 384-dołkowych
• Bezpośrednią obróbkę statywów z probówkami i fiolek do autosamplera
• Znaczne skrócenie czasu pracy manualnej
• Zwiększoną powtarzalność w obrębie dużych zbiorów danych

Ta skalowalność doskonale odpowiada współczesnym podejściom w fosfoproteomice, w których procedury rutynowo obejmują równoległe przetwarzanie od dziesiątek do setek próbek.

Ogólny protokół przygotowania próbek fosfoproteomicznych wspomaganego sonikacją

Niezawodna procedura fosfoproteomiczna łączy wydajną ekstrakcję białek, trawienie enzymatyczne i wzbogacanie fosfopeptydów. Poniższy zarys odzwierciedla sprawdzone najlepsze praktyki dostosowane do przygotowania próbek z wykorzystaniem sonikacji:

1. Szybkie zatrzymanie reakcji w próbkach i pobranie próbek
   Reakcje w komórkach lub tkankach są szybko zatrzymywane – zwykle przez błyskawiczne zamrażanie – aby zachować stany fosforylacji. Etap ten ma kluczowe znaczenie ze względu na przejściowy charakter zdarzeń fosforylacji.
2. Ultradźwiękowa liza komórek i ekstrakcja białek
   Próbki rozmraża się i poddaje sonikacji, zazwyczaj w krótkich cyklach. Energia ultradźwiękowa rozrywa błony komórkowe i wydajnie uwalnia białka. W zwalidowanych procedurach sonikację przeprowadza się w wielu cyklach, aby zapewnić całkowitą lizę.
   Przykład: Po rozmrożeniu próbek na lodzie lizę komórek uzyskano przez sonikację, np. za pomocą urządzenia Vialtweeter przez 2 cykle, każdy po 1 min.
3. Klarowanie i oznaczanie ilościowe białek
   Po lizie próbki odwirowuje się w celu usunięcia resztek komórkowych. Pobiera się supernatant zawierający rozpuszczalne białka i oznacza ich ilość, aby zapewnić jednakową ilość materiału wejściowego we wszystkich próbkach.
4. Redukcja i alkilacja
   Wiązania disiarczkowe są redukowane (np. z użyciem DTT) i alkilowane (np. z użyciem IAA) w celu stabilizacji białek i poprawy wydajności trawienia.
5. Trawienie proteolityczne
   Białka są trawione enzymatycznie, zazwyczaj trypsyną, co prowadzi do powstania peptydów odpowiednich do analizy metodą spektrometrii mas. Dowiedz się więcej o trawieniu białek przyspieszanym ultradźwiękami!
6. Oczyszczanie i odsalanie peptydów
   Peptydy oczyszcza się metodami opartymi na C18 w celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócać analizę LC-MS.
7. Wzbogacanie fosfopeptydów
   Ze względu na niewielkie ilości fosforylowanych peptydów stosuje się techniki wzbogacania, takie jak metody powinowactwa z wykorzystaniem Fe-NTA lub TiO₂, aby selektywnie izolować fosfopeptydy.
8. Analiza LC-MS/MS i przetwarzanie danych
   Wzbogacone próbki analizuje się za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, często stosując akwizycję niezależną od danych (DIA) w celu poprawy oznaczania ilościowego i powtarzalności.

Co istotne, procedury prowadzone na dużą skalę można dostosować do formatu płytek 96-dołkowych, umożliwiając równoległe przetwarzanie nawet setek próbek – jest to podejście w pełni zgodne z sonikacją za pomocą UIP400MTP.
 

Zoptymalizowany protokół szybkiego zatrzymania reakcji w fosfoproteomie, wzbogacania fosfopeptydów i Phos-DIA-MS.
Protokół i ilustracja: ©Die et al. 2023

Zwiększanie powtarzalności i jakości danych dzięki sonikacji

Jednym z głównych wyzwań w fosfoproteomice jest uzyskanie spójnych wyników oznaczania ilościowego w obrębie dużych zbiorów danych. Zmienność wprowadzana podczas przygotowania próbek może maskować różnice istotne biologicznie.

Sonikacja rozwiązuje ten problem, zapewniając:

1. Ustandaryzowaną ilość energii dostarczanej do poszczególnych próbek
2. Ograniczenie zmienności wynikającej z czynności manualnych
3. Lepszą powtarzalność ekstrakcji i trawienia białek

W połączeniu z platformami o wysokiej wydajności przetwarzania próbek, takimi jak UIP400MTP, sonikacja pozwala laboratoriom osiągnąć poziom spójności niezbędny w badaniach z zakresu biologii systemowej i odkrywaniu biomarkerów klinicznych.

Przyszłość fosfoproteomiki: automatyzacja i skalowalność

W miarę dalszego rozwoju fosfoproteomiki w kierunku zastosowań na dużą skalę i zastosowań klinicznych zapotrzebowanie na automatyzację i wydajność przetwarzania próbek będzie wyłącznie rosło. Przygotowanie próbek z wykorzystaniem sonikacji, szczególnie w połączeniu z systemami kompatybilnymi z mikropłytkami, stanowi kluczową technologię umożliwiającą ten rozwój.
Łącząc wydajną lizę ultradźwiękową, przetwarzanie równoległe i kompatybilność ze zautomatyzowanymi procedurami, urządzenia takie jak VialTweeter i UIP400MTP wyznaczają nowe standardy przygotowania próbek do badań proteomicznych.
Dowiedz się więcej o integracji UIP400MTP ze zautomatyzowanymi procedurami laboratoryjnymi!

Wykorzystaj przygotowanie próbek wspomagane sonikacją w fosfoproteomice!

Ekstrakcja białek wspomagana sonikacją stała się kluczowym elementem współczesnej fosfoproteomiki, oferując niezrównaną wydajność, skalowalność i powtarzalność. W obliczu rosnącej potrzeby analizowania złożonych układów biologicznych w dużych zbiorach próbek technologie ultradźwiękowe są nie tylko korzystne – są niezbędne.
Umożliwiając stosowanie ustandaryzowanych procedur o wysokiej wydajności przetwarzania próbek, rozwiązania takie jak VialTweeter i UIP400MTP przyspieszają odkrycia dotyczące sygnalizacji komórkowej, mechanizmów chorób i medycyny precyzyjnej.

Projektowanie, produkcja i doradztwo – jakość z Niemiec

Sonikatory Hielscher są znane z najwyższych standardów jakości i projektowania. Solidność i łatwość obsługi umożliwiają płynną integrację naszych sonikatorów z instalacjami przemysłowymi. Sonikatory Hielscher z łatwością radzą sobie z trudnymi warunkami i wymagającymi środowiskami.

Hielscher Ultrasonics jest firmą z certyfikatem ISO i kładzie szczególny nacisk na sonikatory o wysokiej wydajności, wyposażone w najnowocześniejszą technologię i łatwe w obsłudze. Oczywiście sonikatory Hielscher są zgodne z wymogami CE i spełniają wymagania UL, CSA oraz RoHs.

Modele sonikatorów Hielscher do wielu próbek: UIP400MTP do mikropłytek, VialTweeter i CupHorn – szybkie przygotowanie próbek o wysokiej wydajności przetwarzania