Ekstrakcja białek wspomagana sonikacją dla fosfoproteomiki

W współczesnych naukach przyrodniczych fosfoproteomika stała się podstawową technologią służącą do rozszyfrowywania komórkowych szlaków sygnałowych oraz zrozumienia mechanizmów chorób na poziomie systemowym. Ponieważ fosforylacja reguluje kluczowe funkcje biologiczne – od aktywności enzymów po interakcje między białkami – Jego precyzyjny pomiar ma zasadnicze znaczenie zarówno dla badań podstawowych, jak i medycyny translacyjnej. Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie spektrometrii masowej umożliwiły identyfikację dziesiątek tysięcy przypadków fosforylacji w ramach jednego eksperymentu, co podkreśla potrzebę stosowania niezawodnych, skalowalnych i powtarzalnych procedur przygotowywania próbek.
Jednym z najbardziej znaczących osiągnięć w tej dziedzinie jest wprowadzenie ekstrakcji białek wspomaganej ultradźwiękami, która znacznie poprawia jakość próbek, wydajność i powtarzalność wyników. Technologie ultradźwiękowe, takie jak VialTweeter i UIP400MTP, na nowo definiują obecnie sposób, w jaki laboratoria radzą sobie z dużymi zbiorami próbek, szczególnie w przypadku fosfoproteomiki o wysokiej wydajności.

Znaczenie naukowe skutecznego przygotowania próbek w fosfoproteomice

Fosforylacja białek to wysoce dynamiczna i odwracalna modyfikacja potranslacyjna, która dotyczy większości białek w komórkach ludzkich. Reguluje ona strukturę białek, ich lokalizację oraz sieci interakcji, a jej zaburzenia wiążą się z chorobami takimi jak nowotwory i neurodegeneracja.
Analiza fosfoproteomiczna wiąże się jednak z wyjątkowymi wyzwaniami technicznymi. Peptydy fosforylowane występują często w niewielkich ilościach i wymagają starannego wzbogacania oraz wysoce wydajnego przygotowania próbki na wcześniejszych etapach. Każda nieefektywność podczas ekstrakcji lub trawienia białek może prowadzić do utraty sygnału, słabej powtarzalności wyników oraz niepełnego pokrycia miejsc fosforylacji.
Właśnie w tym momencie kluczową rolę odgrywa sonikacja.

Dlaczego sonikacja rewolucjonizuje proces ekstrakcji białek

W procesie sonikacji wykorzystuje się fale ultradźwiękowe o wysokim natężeniu do mechanicznego rozbijania komórek i tkanek, co umożliwia skuteczne uwalnianie białek z komórek, tkanek, płynów biologicznych i pęcherzyków pozakomórkowych. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami lizy sonikacja ma kilka wyraźnych zalet:

• Po pierwsze, zapewnia to szybkie i równomierne rozbicie komórek, co ma szczególne znaczenie dla zachowania przejściowych stanów fosforylacji. W fosfoproteomice nawet niewielkie opóźnienia lub niepełna liza mogą zmienić profile sygnalizacji, dlatego szybka i powtarzalna ekstrakcja ma zasadnicze znaczenie.
• Po drugie, sonikacja poprawia wydajność uzyskiwania białek oraz ich rozpuszczalność, zwłaszcza w przypadku próbek trudnych do lizy, takich jak gęste tkanki lub komórki bogate w błony. Przekłada się to bezpośrednio na lepszy przebieg dalszego trawienia i większy odzysk fosfopeptydów.
• Po trzecie, obróbka ultradźwiękowa ma z natury skalowalny charakter. Urządzenia takie jak VialTweeter umożliwiają jednoczesną sonikację wielu zamkniętych probówek, zapewniając identyczne warunki obróbki dla wszystkich próbek. Eliminuje to zmienność wynikającą z ręcznej obsługi.
• W przypadku jeszcze większych wymagań dotyczących przepustowości urządzenie UIP400MTP stanowi znaczący skok technologiczny. Umożliwia ono bezpośrednią sonikację całych mikropłytek lub stojaków na probówki, w tym fiolki autosamplera, dzięki czemu idealnie nadaje się do równoległego przetwarzania setek próbek. Ta funkcja jest szczególnie cenna w biologii systemowej i badaniach klinicznych, gdzie standardem są duże kohorty próbek.

Ultrasonikacja o wysokiej wydajności: VialTweeter i UIP400MTP w centrum uwagi

Włączenie zaawansowanych urządzeń ultradźwiękowych do procesów fosfoproteomicznych to nie tylko kwestia wygody – jest to udoskonalenie metodologiczne.
Urządzenie VialTweeter zostało zaprojektowane do zsynchronizowanego obróbki ultradźwiękowej wielu zamkniętych fiolek, co pozwala zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, zapewniając jednocześnie powtarzalność wyników. Nadaje się ono szczególnie do zastosowań o średniej wydajności oraz do ustandaryzowanych procedur roboczych.
 

Natomiast model UIP400MTP został zoptymalizowany pod kątem środowisk o dużej przepustowości, umożliwiając:

• Równomierne poddawanie działaniu ultradźwięków na całej powierzchni standardowych mikropłytek, np. płytek 96-dołkowych lub 384-dołkowych
• Bezpośrednie przetwarzanie stojaków z probówkami i fiolkami do autosamplera
• Znaczne skrócenie czasu pracy ręcznej
• Zwiększona powtarzalność wyników w przypadku dużych zbiorów danych

Ta skalowalność idealnie wpisuje się w nowoczesne podejścia w zakresie fosfoproteomiki, gdzie w ramach procesów roboczych rutynowo przetwarza się równolegle od kilkudziesięciu do kilkuset próbek.

Ogólny protokół przygotowania próbek do analizy fosfoproteomicznej z wykorzystaniem sonikacji

Solidny proces analizy fosfoproteomicznej łączy w sobie wydajną ekstrakcję białek, trawienie enzymatyczne oraz wzbogacanie fosfopeptydów. Poniższy schemat przedstawia sprawdzone najlepsze praktyki dostosowane do przygotowywania próbek metodą sonikacji:

1. Szybkie schładzanie i pobieranie próbek
   Komórki lub tkanki ulegają gwałtownemu schłodzeniu – zazwyczaj poprzez gwałtowne zamrażanie – w celu zachowania stanów fosforylacji. Etap ten ma kluczowe znaczenie ze względu na przejściowy charakter procesów fosforylacji.
2. Ultradźwiękowa liza komórek i ekstrakcja białek
   Próbki są rozmrażane, a następnie poddawane sonikacji, zazwyczaj w krótkich cyklach. Energia ultradźwiękowa powoduje rozbicie błon komórkowych i skuteczne uwolnienie białek. W sprawdzonych procedurach sonikację przeprowadza się w wielu cyklach, aby zapewnić całkowitą lizę.
   Przykład: Po rozmrożeniu próbek na lodzie lizę komórek przeprowadzono metodą sonikacji, np. przy użyciu urządzenia Vialtweeter, w 2 cyklach po 1 min. każdy.
3. Oczyszczanie i oznaczanie ilościowe białka
   Po lizie próbki poddaje się wirowaniu w celu usunięcia resztek komórkowych. Supernatant zawierający białka rozpuszczalne jest zbierany i poddawany analizie ilościowej, aby zapewnić spójność ilości materiału wyjściowego we wszystkich próbkach.
4. Redukcja i alkilowanie
   Wiązania disiarczkowe są redukowane (np. za pomocą DTT) i alkilowane (np. za pomocą IAA) w celu stabilizacji białek i zwiększenia wydajności trawienia.
5. trawienie proteolityczne
   Białka są trawione enzymatycznie, zazwyczaj za pomocą trypsyny, w wyniku czego powstają peptydy nadające się do analizy metodą spektrometrii masowej. Dowiedz się więcej o przyspieszanym ultradźwiękami rozkładzie białek!
6. Oczyszczanie i odsolanie peptydów
   Peptydy są oczyszczane metodami opartymi na kolumnach C18 w celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócać analizę LC-MS.
7. Wzbogacanie fosfopeptydów
   Ze względu na niską zawartość peptydów fosforylowanych stosuje się techniki wzbogacania, takie jak metody powinowactwa Fe-NTA lub TiO₂, w celu selektywnego wyodrębnienia fosfopeptydów.
8. Analiza LC-MS/MS i przetwarzanie danych
   Wzbogacone próbki analizuje się za pomocą spektrometrii masowej o wysokiej rozdzielczości, często z wykorzystaniem metody akwizycji niezależnej od danych (DIA) w celu uzyskania lepszej kwantyfikacji i powtarzalności wyników.

Warto zauważyć, że procesy na dużą skalę można dostosować do formatów płytek 96-dołkowych, co umożliwia równoległą analizę nawet setek próbek – podejście w pełni zgodne z sonikacją opartą na standardzie UIP400MTP.
 

Zoptymalizowany protokół służący do szybkiego wygaszania fosfoproteomu, wzbogacania fosfopeptydów oraz analizy Phos-DIA-MS.
Protokół i ilustracja: © Die i in. 2023

Poprawa powtarzalności i jakości danych dzięki sonikacji

Jednym z głównych wyzwań w fosfoproteomice jest zapewnienie spójnej kwantyfikacji w dużych zbiorach danych. Zmienność wynikająca z procesu przygotowania próbek może przesłaniać różnice istotne z biologicznego punktu widzenia.

Technologia sonikacji rozwiązuje ten problem poprzez:

1. Ujednolicony wkład energetyczny we wszystkich próbkach
2. Zmniejszona zmienność wynikająca z czynnika ludzkiego
3. Zwiększona powtarzalność w procesie ekstrakcji i trawienia białek

W połączeniu z platformami o wysokiej wydajności, takimi jak UIP400MTP, laboratoria mogą osiągnąć poziom powtarzalności, który ma zasadnicze znaczenie dla badań z zakresu biologii systemowej oraz odkrywania biomarkerów klinicznych.

Przyszłość fosfoproteomiki: automatyzacja i skalowalność

W miarę jak fosfoproteomika znajduje coraz szersze zastosowanie w badaniach na dużą skalę oraz w praktyce klinicznej, zapotrzebowanie na automatyzację i wydajność będzie tylko rosło. Przygotowywanie próbek metodą sonikacji, zwłaszcza w połączeniu z systemami kompatybilnymi z mikropłytkami, stanowi kluczową technologię wspomagającą.
Dzięki połączeniu wydajnej lizy ultradźwiękowej, przetwarzania równoległego oraz kompatybilności z zautomatyzowanymi procesami roboczymi urządzenia takie jak VialTweeter i UIP400MTP wyznaczają nowe standardy w zakresie przygotowywania próbek do badań proteomicznych.
Dowiedz się więcej o wdrożeniu urządzenia UIP400MTP w zautomatyzowanych procesach laboratoryjnych!

Wykorzystaj zalety przygotowywania próbek z wykorzystaniem sonikacji w fosfoproteomice!

Ekstrakcja białek wspomagana ultradźwiękami stała się kluczowym elementem współczesnej fosfoproteomiki, zapewniając niezrównaną wydajność, skalowalność i powtarzalność. W obliczu rosnącej potrzeby analizowania złożonych systemów biologicznych w dużych grupach próbek technologie ultradźwiękowe są nie tylko korzystne – są niezbędne.
Dzięki zapewnieniu wysokoprzepustowych, znormalizowanych procesów roboczych rozwiązania takie jak VialTweeter i UIP400MTP przyspieszają postępy w badaniach nad sygnalizacją komórkową, mechanizmami chorób oraz medycyną precyzyjną.

Projektowanie, produkcja i doradztwo – Jakość Made in Germany

Ultradźwięki Hielscher są dobrze znane z najwyższej jakości i standardów projektowych. Solidność i łatwa obsługa pozwalają na płynną integrację naszych ultradźwiękowców z obiektami przemysłowymi. Trudne warunki i wymagające środowiska są łatwo obsługiwane przez ultradźwięki Hielscher.

Hielscher Ultrasonics jest firmą posiadającą certyfikat ISO i kładzie szczególny nacisk na wysokowydajne ultradźwięki z najnowocześniejszą technologią i łatwością obsługi. Oczywiście ultradźwięki Hielscher są zgodne z CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.

Hielscher Multi-Sample Sonicator modele UIP400MTP do mikropłytek, VialTweeter i CupHorn: szybkie i wysokowydajne przygotowywanie próbek