Deparafinizacja i ekstrakcja białek z FFPE

Ułatw ekstrakcję białek z skrawków tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie przy użyciu zoptymalizowanej kombinacji deparafinowania, solubilizacji i sonikacji za pomocą wielorurkowego ultrasonografu VialTweeter. Protokół ten obsługuje proteomikę opartą na spektrometrii mas i jest zgodny z przepływami pracy oczyszczania i trawienia enzymatycznego SP3.

Niniejszy SOP jest przeznaczony dla personelu laboratoryjnego zajmującego się analizą proteomiczną próbek tkanek FFPE przy użyciu wysokowydajnej sonikacji. Jest zoptymalizowany pod kątem do dziesięciu próbek FFPE przetwarzanych równolegle za pomocą VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protokół: Ekstrakcja białka z próbek FFPE za pomocą VialTweeter

Materiały i odczynniki

odczynniki

• Ksylen (stopień histologiczny)
• Etanol (bezwzględny 96%)
• Bufor do lizy:

6 M chlorowodorek guanidyny
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboksyetylo)fosfina)
40 mM CAA (2-chloroacetamid)

• Inhibitor proteazy (opcjonalnie; np. cOmplete™ mini EDTA-free)

Sprzęt

• VialTweeter Wielorurowy ultrasonograf
• Probówki wirówkowe o niskim poziomie wiązania 1,5 ml lub 2,0 ml
• Blok grzewczy lub inkubator (ustawienia 95°C i 80°C)
• Mikrowirówka
• Termomikser (opcjonalny, ale zalecany)

Przykładowe dane wejściowe

• 1–2 skrawki tkanki FFPE o grubości 10 μm na próbkę (tj. na fiolkę)

lub

• Łącznie ~100 μg tkanki na próbkę (tj. na fiolkę)

Uwaga: Do mikrotomii należy używać świeżych ostrzy, aby zminimalizować zanieczyszczenie resztkami parafiny.

Procedura

1. deparafinizacja
   1. Przenieś sekcje FFPE do probówek mikrowirówek o niskim poziomie wiązania.
   2. Dodaj 1 ml ksylenu, krótko wymieszaj.
   3. Inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Wirować przy 14 000 × g przez 2 minuty; Odrzucić supernatant.
   5. Powtórz pranie ksylenem jeszcze raz (kroki 2–4).
   6. Umyj granulat 1 ml 96% etanolu, zwiruj, a następnie odwiruj przy 14 000 × g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant.
   7. Powtórzyć płukanie etanolem jeszcze raz (w sumie 2 płukania etanolem).
   8. Suszyć na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej z otwartymi pokrywkami w celu odparowania resztek etanolu.
2. Ekstrakcja białek i sonikacja
   1. Dodać 200 μl buforu do lizy do każdego suchego granulatu.
      Uwaga: Chociaż sonikator może pomieścić do 1 ml, 200 μl jest optymalne do dalszego przetwarzania.

   2. Mieszać przez wirowanie lub delikatne pipetowanie.
3. Pierwsza inkubacja termiczna
   1. Inkubować probówki w temperaturze 95 °C przez 30 minut, mieszając przy 400 obr./min przy użyciu termomiksera lub bloku grzewczego.
   2. Pozostawić próbki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
4. Pierwsza sonizacja za pomocą VialTweeter
   1. Umieść rurki w głośniku wysokotonowym VialTweeter.
   2. Ustaw VialTweeter UP200St na poniższe wartości i sonicate.
Ustawienia Sonicatora
• Ustaw amplitudę (A) na 100%
• Ustaw tryb pulsacji (C) na 100%
• Zegar okresu: włączony
• Czasowość: 60s
• Czas wyłączenia: 30s
• Wartość graniczna: 15 min (odpowiada 10 cyklom)
(Uwaga obliczeniowa: (60 s wł. + 30 s wył.) × 10 cykli = 900 s = 15 min)
5. Druga inkubacja termiczna
   Wyjąć probówki i ponownie inkubować w temperaturze 95 °C przez 15 minut, 400 obr./min.
6. Druga sonikacja
   Powtórz sonikację na VialTweeter przy użyciu tych samych ustawień (jak powyżej) przez dodatkowe 10 cykli (łącznie 15 minut).
7. Klarowanie lizatu
   1. Odwirować próbki o masie 13 000 × g przez 10 minut w temperaturze 23°C (temperatura pokojowa).
   2. Ostrożnie zebrać supernatant do nowej probówki Eppendorfa Safe-lock o pojemności 2,0 ml. Unikaj naruszania pelletu.
8. Dalsze przetwarzanie
   Lisat jest teraz gotowy do oczyszczenia SP3 i trawienia enzymatycznego.

Uwagi i sprawdzone metody

1. Ryzyko przegrzania podczas sonikacji jest zmniejszone dzięki zaprogramowanym cyklom włączania/wyłączania.
2. Unikaj wirowania po sonikacji, aby zapobiec agregacji białek.

Utylizacja odpadów i bezpieczeństwo

Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych ultrasonografów laboratoryjnych: