Deparafinizacja i ekstrakcja białek z tkanek FFPE

Ułatw ekstrakcję białek ze skrawków tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE), stosując zoptymalizowane połączenie deparafinizacji, solubilizacji i sonikacji za pomocą wieloprobówkowego sonikatora VialTweeter. Protokół ten umożliwia dalsze analizy proteomiczne oparte na spektrometrii mas i jest zgodny z procedurami oczyszczania metodą SP3 oraz trawienia enzymatycznego.

Ta standardowa procedura operacyjna (SOP) jest przeznaczona dla personelu laboratoryjnego zajmującego się analizą proteomiczną próbek tkanek FFPE z wykorzystaniem sonikacji o wysokiej wydajności. Została zoptymalizowana do równoległego przetwarzania do dziesięciu próbek FFPE za pomocą wieloprobówkowego sonikatora VialTweeter.

Protokół: ekstrakcja białek z próbek FFPE za pomocą VialTweeter

Materiały i odczynniki

Odczynniki

• Ksylen (do zastosowań histologicznych)
• Etanol (absolutny 96%)
• Bufor do lizy:

6 M chlorowodorek guanidyny
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboksyetylo)fosfina)
40 mM CAA (2-chloroacetamid)

• Inhibitor proteaz (opcjonalnie; np. cOmplete™ mini bez EDTA)

Sprzęt

• Wieloprobówkowy sonikator VialTweeter
• Probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 mL lub 2,0 mL i niskiej zdolności wiązania
• Blok grzejny lub inkubator (ustawienia 95°C i 80°C)
• Mikrowirówka
• Termomikser (opcjonalny, ale zalecany)

Ilość materiału wejściowego

• 1–2 skrawki tkanki FFPE o grubości 10 µm na próbkę (tj. na fiolkę)

LUB

• Łącznie ~100 µg tkanki na próbkę (tj. na fiolkę)

Uwaga: do skrawania mikrotomowego używać nowych ostrzy, aby zminimalizować zanieczyszczenie drobinami parafiny.

Procedura

1. Deparafinizacja
   1. Przenieść skrawki FFPE do probówek mikrowirówkowych o niskiej zdolności wiązania.
   2. Dodać 1 mL ksylenu, krótko wymieszać na wytrząsarce typu vortex.
   3. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Wirować przy 14 000 × g przez 2 minuty; usunąć supernatant.
   5. Powtórzyć płukanie ksylenem jeszcze raz (kroki 2–4).
   6. Przepłukać osad 1 mL etanolu 96%, wymieszać na wytrząsarce typu vortex, a następnie wirować przy 14 000 × g przez 2 minuty. Usunąć supernatant.
   7. Powtórzyć płukanie etanolem jeszcze raz (łącznie 2 płukania etanolem).
   8. Suszyć osad na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy otwartych pokrywkach, aby odparować pozostałości etanolu.
2. Ekstrakcja białek i sonikacja
   1. Dodać 200 µL buforu do lizy do każdego suchego osadu.

      Uwaga: chociaż sonikator mieści do 1 mL, objętość 200 µL jest optymalna do dalszego przetwarzania.

   2. Wymieszać na wytrząsarce typu vortex lub przez delikatne pipetowanie.
3. Pierwsza inkubacja termiczna
   1. Inkubować probówki w temperaturze 95 °C przez 30 min, mieszając przy 400 rpm za pomocą termomiksera lub bloku grzejnego.
   2. Pozostawić próbki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 min.
4. Pierwsza sonikacja za pomocą VialTweeter
   1. Umieścić probówki w VialTweeter.
   2. Ustawić VialTweeter UP200St na poniższe wartości i przeprowadzić sonikację.
Ustawienia sonikatora
• Ustawić amplitudę (A) na 100%
• Ustawić tryb pulsacyjny (C) na 100%
• Zegar okresu: włączony
• Czas włączenia: 60s
• Czas wyłączenia: 30s
• Wartość graniczna: 15 min (odpowiada 10 cyklom)
(Uwaga dotycząca obliczeń: (60 s włączenia + 30 s wyłączenia) × 10 cykli = 900 s = 15 min)
5. Druga inkubacja termiczna
   Wyjąć probówki i ponownie inkubować w temperaturze 95 °C przez 15 min przy 400 rpm.
6. Druga sonikacja
   Powtórzyć sonikację za pomocą VialTweeter przy tych samych ustawieniach (jak powyżej) przez dodatkowe 10 cykli (łącznie 15 min).
7. Klarowanie lizatu
   1. Wirować próbki przy 13 000 × g przez 10 min w temperaturze 23°C (temperatura pokojowa).
   2. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki Eppendorf Safe-lock o pojemności 2,0 mL. Unikać naruszania osadu.
8. Dalsze przetwarzanie
   Lizat jest teraz gotowy do oczyszczania metodą SP3 i trawienia enzymatycznego.

Uwagi i dobre praktyki

1. Ryzyko przegrzania podczas sonikacji jest ograniczane przez zaprogramowane cykle włączania i wyłączania.
2. Po sonikacji unikać mieszania na wytrząsarce typu vortex, aby zapobiec agregacji białek.

Usuwanie odpadów i bezpieczeństwo

Poniższa tabela przedstawia orientacyjną wydajność przetwarzania naszych sonikatorów laboratoryjnych: