Protokół wykorzystania sonikatorów wielopróbkowych Hielscher w analizie biofilmów i analizie proteomicznej

Zastosowanie sonikatorów wielopróbkowych, takich jak sonikator do wielu probówek VialTweeter i sonikator do mikropłytek UIP400MTP, usprawnia pracę laboratoryjną w zastosowaniach wymagających dużej wydajności przetwarzania próbek. Oba urządzenia umożliwiają precyzyjną i równomierną obróbkę ultradźwiękową wielu próbek, minimalizując zmienność i zwiększając powtarzalność. Jest to szczególnie korzystne w eksperymentach wymagających jednolitej lizy próbek, odrywania biofilmów, ekstrakcji białek lub trawienia proteolitycznego, w których metody ręczne lub metody przetwarzania pojedynczych próbek są mniej wydajne i podatne na niespójność wyników.

Usprawnij pracę dzięki sonikatorom wielopróbkowym

Na przykład UIP400MTP umożliwia jednoczesną obróbkę ultradźwiękową dołków mikropłytki, zapewniając równomierne odrywanie biofilmów lub materiału komórkowego. Z kolei VialTweeter umożliwia precyzyjną lizę i homogenizację wielu próbek w probówkach bez zanieczyszczenia krzyżowego. Sonikatory te znacznie skracają czas przetwarzania, poprawiają powtarzalność eksperymentów i zachowują wysoką integralność próbek, co czyni je niezbędnymi narzędziami w badaniach z zakresu mikrobiologii, proteomiki i biologii molekularnej.
Poniżej przedstawiono szczegółowy protokół ilustrujący zastosowanie modeli sonikatorów wielopróbkowych Hielscher – sonikatora do wielu probówek VialTweeter i sonikatora do mikropłytek UIP400MTP – w badaniu obejmującym tworzenie biofilmu E. coli i późniejszą analizę proteomiczną.

Protokół: tworzenie biofilmu, jego odrywanie i analiza proteomiczna z wykorzystaniem sonikatorów wielopróbkowych Hielscher

1. Przygotowanie hodowli bakteryjnej

• Hoduj bakterie E. coli (szczep W3110) w temperaturze 30°C, sprzyjającej tworzeniu biofilmu E. coli, w pożywce bulionowej z tryptonem (TB) zawierającej:
  – 10 g/L tryptonu
  – 5 g/L NaCl
• W razie potrzeby dodaj antybiotyki, aby zapewnić utrzymanie plazmidów.
• Do badań mikroskopowych i badań aktywności promotorów użyj szczepu E. coli W3110 z genomowym reporterem w postaci ulepszonego GFP (eGFP), kontrolowanym przez promotor rplL.
• Wykorzystaj plazmidy reporterowe GFP dla różnych promotorów (np. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) do pomiaru aktywności promotorów.

2. Hodowla i odrywanie biofilmu

• Wprowadź po 1,5 mL rozcieńczonej hodowli bakteryjnej do każdego dołka płytki 12-dołkowej (płytki 12-dołkowe CellStar, Greiner Bio-One).
• Inkubuj, aby umożliwić tworzenie biofilmu.
• Ostrożnie usuń hodowlę planktoniczną (nieprzylegającą).

– Przemyj każdy dołek 500 µL PBS.
– Oderwij przylegające komórki, poddając płytkę 12-dołkową sonikacji w sonikatorze do mikropłytek UIP400MTP. UIP400MTP zapewnia równomierne odrywanie dzięki dostarczaniu jednakowej energii ultradźwiękowej do wszystkich dołków.
– Ustawienia sonikacji: amplituda 60%, tryb cykliczny: 60 sec pracy / 30 sec przerwy.

3. Zbieranie komórek i liza

• Wiruj oderwane komórki biofilmu przy 4 500 g przez 5 minut.
• Przemyj komórki w osadzie PBS.
• Ponownie zawieś komórki w 100 µL 2% roztworu lauroilosarkozynianu sodu (SLS) i inkubuj w temperaturze 95°C przez 15 minut.
• Przeprowadź sonikację za pomocą sonikatora do wielu probówek VialTweeter, aby zapewnić całkowitą lizę komórek.
  – Ustawienia sonikacji: amplituda 100%, 50 s pracy / 10 s przerwy przez łączny czas działania 10 min; utrzymuj próbki na lodzie.

4. Redukcja i alkilacja

• Dodaj 5 mM tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP), aby zredukować wiązania disiarczkowe, i inkubuj w temperaturze 95°C przez 15 minut.
• Alkiluj białka za pomocą 10 mM jodoacetamidu przez 30 minut w temperaturze 25°C.

5. Ilościowe oznaczanie białek i trawienie

• Wiruj lizaty, aby usunąć resztki komórkowe.
• Oznacz całkowitą zawartość białka za pomocą zestawu Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Traw 50 µg białka całkowitego za pomocą 1 µg trypsyny w roztworze zawierającym 2% SLS i 100 mM wodorowęglanu amonu.
• Inkubuj mieszaninę reakcyjną trawienia przez noc w temperaturze 30°C.

6. Oczyszczanie peptydów

• Wytrąć SLS, dodając 1,5% kwas trifluorooctowy (TFA), a następnie odwiruj.
• Oczyść peptydy za pomocą mikrokolumn wirówkowych C18.
• Wysusz oczyszczone peptydy i ponownie zawieś je w 0,1% TFA.

7. Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS/MS)

• Analizuj peptydy za pomocą spektrometru mas Q-Exactive Plus sprzężonego z systemem Ultimate 3000 RSLC nano.
• Rozdziel peptydy za pomocą kolumny HPLC z fazą odwróconą (75 µm × 42 cm), wypełnionej żywicą C18 (2,4 µm).
• Zastosuj gradient od 2% do 35% rozpuszczalnika B (acetonitryl z 0,15% kwasem mrówkowym) w ciągu 140 minut.
• Zbieraj dane, wykonując skany MS o wysokiej rozdzielczości, a następnie skany tandemowe MS/MS 10 jonów o największej intensywności.

8. Analiza danych

• Przetwarzaj surowe dane LC-MS za pomocą oprogramowania Progenesis.
• Eksportuj pliki .mgf i analizuj je za pomocą MASCOT.
• Przeprowadź ilościowe oznaczanie peptydów za pomocą SafeQuant w celu kontroli jakości i korekty uwzględniającej fałszywe odkrycia.
• Przeprowadź wszystkie eksperymenty w dwóch lub trzech powtórzeniach, aby zapewnić powtarzalność.

Sonikatory wielopróbkowe do przygotowania próbek z dużą wydajnością przetwarzania

Modele sonikatorów wielopróbkowych VialTweeter i UIP400MTP znacznie zwiększają precyzję i wydajność pracy eksperymentalnej, zwłaszcza w badaniach biofilmów i proteomice. Ich zdolność do równomiernego przetwarzania wielu próbek zapewnia dużą wydajność przetwarzania bez pogorszenia jakości danych. Korzyści te, w połączeniu z opisanym powyżej usprawnieniem przebiegu pracy, czynią sonikatory wielopróbkowe Hielscher niezbędnymi narzędziami we współczesnych badaniach biologicznych.

Projektowanie, produkcja i doradztwo – jakość z Niemiec

Sonikatory Hielscher są znane z najwyższych standardów jakości i projektowania. Wytrzymałość i łatwa obsługa umożliwiają bezproblemową integrację naszych sonikatorów z instalacjami przemysłowymi. Sonikatory Hielscher z łatwością radzą sobie w trudnych warunkach i wymagających środowiskach.

Hielscher Ultrasonics jest firmą z certyfikatem ISO i kładzie szczególny nacisk na sonikatory o wysokiej wydajności, wyróżniające się najnowocześniejszą technologią i łatwością obsługi. Oczywiście sonikatory Hielscher są zgodne z wymaganiami CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.