Protokół wykorzystujący sonikatory wielopróbkowe Hielscher do analizy biofilmu i proteomiki

Zastosowanie sonikatorów wielopróbkowych, takich jak VialTweeter Multi-Tube Sonicator i UIP400MTP Microplate Sonicator, usprawnia laboratoryjne przepływy pracy w zastosowaniach o wysokiej wydajności. Oba urządzenia umożliwiają precyzyjne i jednolite przetwarzanie ultradźwiękowe wielu próbek, minimalizując zmienność i zwiększając powtarzalność. Jest to szczególnie korzystne w eksperymentach wymagających spójnej lizy próbek, odrywania biofilmu, ekstrakcji białek lub trawienia proteolitycznego, gdzie metody ręczne lub metody pojedynczej próbki są mniej wydajne i podatne na niespójności.

Usprawnienie przepływu pracy dzięki sonikatorom z wieloma próbkami

Na przykład UIP400MTP umożliwia jednoczesną obróbkę ultradźwiękową dołków mikropłytek, zapewniając równomierne odrywanie biofilmów lub materiału komórkowego. Tymczasem VialTweeter oferuje precyzyjną lizę i homogenizację wielu próbek z probówek bez zanieczyszczeń krzyżowych. Sonikatory te znacznie skracają czas przetwarzania, poprawiają powtarzalność eksperymentów i utrzymują wysoką integralność próbek, co czyni je niezbędnymi narzędziami w mikrobiologii, proteomice i badaniach biologii molekularnej.
Poniżej znajduje się szczegółowy protokół ilustrujący zastosowanie modeli sonikatorów wielopróbkowych Hielscher, sonikatora wielopróbkowego VialTweeter i sonikatora mikropłytkowego UIP400MTP, w badaniu obejmującym tworzenie biofilmu E. coli i późniejszą analizę proteomiczną.

Protokół: Tworzenie, odrywanie i analiza proteomiczna biofilmu przy użyciu sonikatorów wielopróbkowych Hielscher

1. Przygotowanie kultury bakteryjnej

• Hodowla bakterii E. coli (szczep W3110) w temperaturze 30°C, sprzyjającej tworzeniu biofilmu E. coli, w bulionie tryptonowym (TB) zawierającym:
  – 10 g/L trypton
  – 5 g/L NaCl
• W razie potrzeby uzupełnić antybiotykami, aby zapewnić retencję plazmidu.
• Do badań mikroskopowych i aktywności promotora należy użyć szczepu W3110 E. coli z genomowym reporterem wzmocnionego GFP (eGFP) pod kontrolą promotora rplL.
• Wykorzystanie plazmidów reporterowych GFP dla różnych promotorów (np, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) do pomiaru aktywności promotora.

2. Hodowla i odrywanie biofilmu

• Wysiej 1,5 ml rozcieńczonej kultury bakteryjnej na studzienkę na 12-dołkową płytkę (CellStar 12-dołkowe płytki, Greiner Bio-One).
• Inkubować, aby umożliwić tworzenie się biofilmu.
• Ostrożnie usuń kulturę planktoniczną (nieprzylegającą).

– Przemyć każdą studzienkę 500 µl PBS.
– Odłącz dołączone komórki poprzez sonikację 12-dołkowej płytki w sonikatorze mikropłytkowym UIP400MTP. UIP400MTP zapewnia równomierne oderwanie poprzez dostarczanie spójnej energii ultradźwiękowej we wszystkich dołkach.
– Ustawienia sonikacji: 60% amplitudy, tryb cyklu: 60 s ON / 30 s OFF.

3. Zbieranie i liza komórek

• Wirować odłączone komórki biofilmu z prędkością 4500 g przez 5 minut.
• Przepłukać osuszone komórki PBS.
• Zawiesić komórki w 100 µl 2% lauroilosarkozynianu sodu (SLS) i inkubować w temperaturze 95°C przez 15 minut.
• Sonikować za pomocą sonikatora VialTweeter Multi-Tube Sonicator, aby zapewnić całkowitą lizę komórek.
  – Ustawienia sonikacji: 100% amplitudy, 50 s ON / 10 s OFF przez 10 min całkowitego czasu pracy; próbki należy przechowywać na lodzie.

4. Redukcja i alkilacja

• Dodać 5 mM Tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) w celu redukcji wiązań disiarczkowych i inkubować w temperaturze 95°C przez 15 minut.
• Alkilować białka 10 mM jodoacetamidem przez 30 minut w temperaturze 25°C.

5. Kwantyfikacja i trawienie białek

• Odwirować lizaty w celu usunięcia zanieczyszczeń.
• Oznaczyć całkowitą zawartość białka przy użyciu zestawu Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Strawić 50 µg białka całkowitego za pomocą 1 µg trypsyny w roztworze zawierającym 2% SLS i 100 mM wodorowęglanu amonu.
• Inkubować reakcję trawienia przez noc w temperaturze 30°C.

6. Oczyszczanie peptydów

• Wytrącić SLS przez dodanie 1,5% kwasu trifluorooctowego (TFA), a następnie odwirować.
• Oczyszczanie peptydów przy użyciu kolumn mikrospinowych C18.
• Wysuszyć oczyszczone peptydy i ponownie zawiesić w 0,1% TFA.

7. Chromatografia cieczowa - spektrometria mas (LC-MS/MS)

• Analiza peptydów na spektrometrze mas Q-Exactive Plus połączonym z systemem Ultimate 3000 RSLC nano.
• Oddzielić peptydy przy użyciu kolumny HPLC z odwróconą fazą (75 µm × 42 cm) wypełnionej żywicą C18 (2,4 µm).
• Zastosować gradient od 2% do 35% rozpuszczalnika B (acetonitryl z 0,15% kwasem mrówkowym) w ciągu 140 minut.
• Uzyskaj dane za pomocą skanów MS o wysokiej rozdzielczości, a następnie tandemowych skanów MS/MS 10 najbardziej intensywnych jonów.

8. Analiza danych

• Przetwarzanie surowych danych LC-MS przy użyciu oprogramowania Progenesis.
• Eksportuj pliki .mgf i analizuj je za pomocą MASCOT.
• Wykonaj kwantyfikację peptydów przy użyciu SafeQuant do kontroli jakości i korekty fałszywych wykryć.
• Przeprowadzić wszystkie eksperymenty w duplikatach lub triplikatach, aby zapewnić powtarzalność.

Sonikatory wielopróbkowe do wysokowydajnego przygotowywania próbek

Modele sonikatorów wielopróbkowych VialTweeter i UIP400MTP znacznie zwiększają precyzję i wydajność eksperymentalnych przepływów pracy, szczególnie w badaniach biofilmu i proteomice. Ich zdolność do jednolitego przetwarzania wielu próbek zapewnia wysoką przepustowość bez uszczerbku dla jakości danych. Korzyści te, w połączeniu z usprawnionymi przepływami pracy opisanymi powyżej, sprawiają, że sonikatory wielopróbkowe Hielscher są niezbędnymi narzędziami w nowoczesnych badaniach biologicznych.

Projektowanie, produkcja i doradztwo – Jakość Made in Germany

Ultradźwięki Hielscher są dobrze znane z najwyższej jakości i standardów projektowych. Solidność i łatwa obsługa pozwalają na płynną integrację naszych ultradźwiękowców z obiektami przemysłowymi. Trudne warunki i wymagające środowiska są łatwo obsługiwane przez ultradźwięki Hielscher.

Hielscher Ultrasonics jest firmą posiadającą certyfikat ISO i kładzie szczególny nacisk na wysokowydajne ultradźwięki z najnowocześniejszą technologią i łatwością obsługi. Oczywiście ultradźwięki Hielscher są zgodne z CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.