Protokół hodowli i odrywania biofilmu Staphylococcus

Standaryzowane metody są niezbędne do uzyskania wiarygodnych wyników badań. Tutaj znajdziesz protokół hodowli i odrywania biofilmów gronkowcowych. Protokół ten koncentruje się na usprawnieniu wysokowydajnego przygotowania próbek przy użyciu sonikatora do płytek wielodołkowych UIP400MTP w celu skutecznego, wysokowydajnego odrywania biofilmu w płytkach 96-dołkowych. Protokół zawiera również kluczowe etapy hodowli, płukania i wizualizacji biofilmu, ze szczególnym uwzględnieniem minimalizacji zmienności i zapewnienia odtwarzalności.

Badania nad biofilmem Staphylococcus i antybiotykami

Biofilmy Staphylococcus odgrywają kluczową rolę w przewlekłych zakażeniach ze względu na ich oporność na antybiotyki i odpowiedź immunologiczną. Tworzenie biofilmu zapewnia bakteriom środowisko ochronne, utrudniając leczenie zakażeń. Badania nad biofilmami często koncentrują się na zrozumieniu ich powstawania, zachowania i wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, ze szczególnym uwzględnieniem metod o wysokiej wydajności, które usprawniają przebieg eksperymentów.
Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP zapewnia istotną przewagę w badaniach nad biofilmem, umożliwiając szybkie i skuteczne odrywanie biofilmów od płytek 96-dołkowych. Urządzenie to dostarcza równomiernie energię ultradźwiękową do wszystkich dołków, zapewniając spójne wyniki przy jednoczesnej minimalizacji zmienności.

Protokół hodowli i odrywania biofilmu Staphylococcus

Poniżej przedstawiamy instrukcję, która krok po kroku przeprowadzi Cię przez proces hodowli i odrywania biofilmu gronkowcowego. Jako przykładowy etap analityczny pokazujemy, jak oznaczyć spektrofotometrycznie ilość wyhodowanej biomasy za pomocą barwienia fioletem krystalicznym.

Hodowla biofilmu Staphylococcus

Wymagane materiały:

• Sterylne polistyrenowe płytki mikrotitracyjne 96-dołkowe z płaskim dnem i pokrywkami, o powierzchni przystosowanej do hodowli tkankowych
• Bulion tryptonowo-sojowy (TSB) z 0,25% glukozy
• Komora bezpieczeństwa biologicznego

Etapy:

1. Przygotuj sterylne środowisko pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
2. Dodaj TSB zawierający 0,25% glukozy do dołków płytki mikrotitracyjnej. TSB bez glukozy na ogół nie sprzyja tworzeniu biofilmu i należy go stosować wyłącznie jako kontrolę, jeśli jest wymagana.
3. Zaszczep dołki szczepami bakterii przygotowanymi zgodnie z poniższym opisem:
4. Przygotuj zawiesiny bakterii, zapewniając brak wcześniej powstałych skupisk komórek poprzez homogenizację zawiesin za pomocą sonikacji lub rozbicie skupisk przy użyciu igły 23 G i krótkie mieszanie na mieszadle wirowym.
5. Zamknij płytkę pokrywką i inkubuj w warunkach optymalnych dla tworzenia biofilmu (np. w 37°C przez 24 godziny).
6. Przeprowadź eksperyment w trzech powtórzeniach dla każdego szczepu bakterii (trzy dołki na szczep), aby zapewnić wiarygodność.
7. Przeznacz sześć dołków na każdej płytce na kontrole ujemne. Na jednej płytce 96-dołkowej można zbadać do 30 szczepów.

Wizualizacja i płukanie biofilmu

1. Po inkubacji ostrożnie usuń podłoże, aby uniknąć naruszenia biofilmu.
2. Przepłucz każdy dołek czterokrotnie roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć bakterie planktoniczne.
3. Sprawdź, czy na dnie dołków znajdują się białe plamy wskazujące na obecność biofilmu.

Odrywanie biofilmu przy użyciu sonikatora do płytek wielodołkowych UIP400MTP

Konfiguracja urządzenia i parametry:

• Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP
• Ustawienia pracy: amplituda 60%, tryb cykliczny obejmujący 60 sekund pracy / 30 sekund przerwy

Etapy:

1. Umieść przepłukaną płytkę mikrotitracyjną na platformie UIP400MTP.
2. Poddaj próbki sonikacji przy zalecanych ustawieniach (amplituda 60%, 60 sekund pracy, 30 sekund przerwy). Dostosuj ustawienia do szczepu bakterii.
3. Rozpocznij proces sonikacji, aby oderwać biofilm. Fale ultradźwiękowe rozbijają macierz biofilmu, uwalniając przylegające bakterie.
4. UIP400MTP zapewnia równomierną ekspozycję we wszystkich dołkach, co pozwala uzyskać spójne wyniki odrywania biofilmu.

Etap analityczny: oznaczanie ilości biomasy oderwanego biofilmu Staphylococcus za pomocą fioletu krystalicznego (CV)

Wymagane materiały:

• Roztwór fioletu krystalicznego (CV) o stężeniu 0,1%
• Etanol 95% lub kwas octowy 30% (do solubilizacji)
• Czytnik mikropłytek umożliwiający pomiar przy 570 nm
• Sterylne płytki mikrotitracyjne do barwienia

Etapy:

1. Przygotowanie płytki do barwienia: Przenieś 100 µL zawiesiny oderwanego biofilmu z każdego dołka płytki poddanej sonikacji do odpowiadających mu dołków czystej, sterylnej płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej. Zapewnia to czyste i jednolite środowisko do barwienia.
2. Barwienie oderwanego biofilmu: Dodaj 150 µL roztworu fioletu krystalicznego o stężeniu 0,1% do każdego dołka zawierającego zawiesinę oderwanego biofilmu. Delikatnie pipetuj, aby zapewnić równomierne wymieszanie zawiesiny biofilmu z fioletem krystalicznym.
3. Inkubacja: Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić skuteczne wybarwienie biomasy fioletem krystalicznym.
4. Płukanie: Po inkubacji ostrożnie usuń roztwór fioletu krystalicznego z dołków, nie naruszając biomasy. Przepłucz każdy dołek trzykrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć niezwiązany barwnik.
5. Suszenie: Pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej lub w komorze ze sterylnym przepływem powietrza. Unikaj ogrzewania, ponieważ może ono zmienić wyniki.
6. Solubilizacja: Dodaj 200 µL etanolu 95% (lub kwasu octowego 30%, w zależności od standardowych praktyk laboratoryjnych) do każdego dołka, aby rozpuścić związany fiolet krystaliczny. Mieszaj delikatnie przez pipetowanie lub wytrząsanie płytki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
7. Pomiar: Zmierz gęstość optyczną (OD) roztworu rozpuszczonego fioletu krystalicznego przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
8. Analiza danych: Odejmij średnią wartość OD570 kontroli ujemnych (dołków z TSB, ale bez inokulum bakteryjnego) od wartości uzyskanych w dołkach eksperymentalnych, aby uwzględnić barwienie tła. Zapisz i przeanalizuj dane.

Uwaga: Przeprowadź eksperyment w trzech powtórzeniach dla każdego warunku, aby zapewnić odtwarzalność. Zapewnij prawidłowe postępowanie z fioletem krystalicznym i etanolem, przestrzegając procedur bezpieczeństwa i utylizacji.
 

Najważniejsze zalety UIP400MTP w skrócie:

• Przetwarzanie o wysokiej wydajności: Zaprojektowany specjalnie do płytek wielodołkowych, umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek.
• Równomierny rozkład ultradźwięków: Zapewnia jednakowe natężenie ultradźwięków we wszystkich dołkach, dając spójne wyniki dla wszystkich próbek.
• Używaj dowolnej standardowej płytki: UIP400MTP obsługuje dowolne standardowe płytki wielodołkowe, szalki Petriego i statywy na probówki. Nie wymaga drogich płytek dedykowanych przez producenta!
• Przyjazny dla użytkownika interfejs: Łatwość konfiguracji i sterowania sprawia, że jest to doskonałe narzędzie do zwiększania wydajności laboratorium. Programowalne ustawienia i automatyzacja ułatwiają standaryzację procesu!