Protokół hodowli i odrywania biofilmu gronkowców

Standaryzowane metody są niezbędne do uzyskania wiarygodnych wyników badań. Tutaj można znaleźć protokół hodowli i odrywania biofilmów gronkowcowych. Protokół ten koncentruje się na usprawnionym, wysokowydajnym przygotowaniu próbek przy użyciu sonikatora wielodołkowego UIP400MTP do wydajnego, wysokowydajnego odrywania biofilmu w 96-dołkowych płytkach. Protokół zawiera również kluczowe etapy hodowli, mycia i wizualizacji biofilmu, z naciskiem na minimalizację zmienności i zapewnienie powtarzalności.

Biofilm gronkowca i badania nad antybiotykami

Biofilmy Staphylococcus odgrywają kluczową rolę w uporczywych infekcjach ze względu na ich oporność na antybiotyki i odpowiedzi immunologiczne. Tworzenie biofilmu zapewnia bakteriom środowisko ochronne, utrudniając leczenie infekcji. Badania nad biofilmami często koncentrują się na zrozumieniu ich powstawania, zachowania i podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe, z naciskiem na metody o wysokiej wydajności w celu usprawnienia eksperymentalnych przepływów pracy.
Sonikator wielodołkowy UIP400MTP oferuje znaczącą przewagę w badaniach nad biofilmami, umożliwiając szybkie i skuteczne usuwanie biofilmów z 96-dołkowych płytek. Urządzenie to zapewnia jednolitą energię ultradźwiękową do wszystkich studzienek, zapewniając spójne wyniki przy jednoczesnej minimalizacji zmienności.

Protokół hodowli i usuwania biofilmu gronkowców

Poniżej przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące procesu hodowli i usuwania biofilmu gronkowca. Jako przykładowy etap analityczny pokazujemy, jak spektrofotometrycznie określić ilość wyhodowanej biomasy za pomocą barwienia fioletem krystalicznym.

Hodowla biofilmu gronkowców

Wymagane materiały:

• Sterylne 96-dołkowe polistyrenowe płytki mikrotitracyjne z płaskim dnem i pokrywkami do hodowli tkankowych
• Tryptic Soy Broth (TSB) z dodatkiem 0,25% glukozy
• Szafa bezpieczeństwa biologicznego

Kroki:

1. Przygotuj sterylne środowisko pracy w szafce bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
2. Dodaj TSB zawierającą 0,25% glukozy do dołków płytki mikrotitracyjnej. TSB bez glukozy zasadniczo nie wspomaga tworzenia biofilmu i powinna być stosowana jako kontrola tylko w razie potrzeby.
3. Zaszczepić studzienki szczepami bakterii przygotowanymi w sposób opisany poniżej:
4. Przygotuj zawiesiny bakteryjne, upewniając się, że nie ma wcześniej istniejących skupisk komórek, homogenizując zawiesiny za pomocą sonikacji lub rozbijając skupiska za pomocą igły o rozmiarze 23 i krótkiego worteksowania.
5. Zamknąć płytkę pokrywką i inkubować w warunkach optymalnych dla tworzenia biofilmu (np. 37°C przez 24 godziny).
6. Wykonaj eksperyment w trzech powtórzeniach dla każdego szczepu bakterii (trzy dołki na szczep), aby zapewnić wiarygodność.
7. Przydzielić sześć dołków na płytkę dla kontroli negatywnych. Na 96-dołkowej płytce można przetestować do 30 szczepów.

Wizualizacja i mycie biofilmu

1. Po inkubacji należy ostrożnie usunąć pożywkę, aby nie naruszyć biofilmu.
2. Przemyć każdą studzienkę czterokrotnie solą fizjologiczną w celu usunięcia bakterii planktonowych.
3. Sprawdź dno studzienek pod kątem białych plam wskazujących na obecność biofilmu.

Odrywanie biofilmu przy użyciu sonikatora UIP400MTP do płytek wielodołkowych

Konfiguracja urządzenia i parametry:

• Sonikator wielodołkowy UIP400MTP
• Ustawienia pracy: 60% amplitudy, tryb cykliczny z 60 sekundami WŁ. / 30 sekundami WYŁ.

Kroki:

1. Umieść umytą płytkę mikrotitracyjną na platformie UIP400MTP.
2. Sonikacja próbek przy zalecanych ustawieniach (60% amplitudy, 60 sekund ON, 30 sekund OFF). Dostosuj ustawienia do szczepu bakterii.
3. Rozpocząć proces sonikacji w celu oderwania biofilmu. Fale ultradźwiękowe rozbijają matrycę biofilmu, uwalniając przylegające bakterie.
4. UIP400MTP zapewnia równomierną ekspozycję we wszystkich studzienkach, zapewniając spójne wyniki odrywania.

Etap analityczny: Kwantyfikacja oderwanej biomasy biofilmu Staphylococcus przy użyciu fioletu krystalicznego (CV)

Wymagane materiały:

• 0.1% roztwór fioletu krystalicznego (CV)
• 95% etanol lub 30% kwas octowy (do rozpuszczania)
• Czytnik mikropłytek zdolny do odczytu przy 570 nm
• Sterylne płytki mikrotitracyjne do barwienia

Kroki:

1. Przygotowanie płytki do barwienia: Przenieść 100 µL oderwanej zawiesiny biofilmu z każdego dołka sonikowanej płytki do odpowiednich dołków czystej, sterylnej 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej. Zapewni to czyste i jednolite środowisko do barwienia.
2. Barwienie oderwanego biofilmu: Dodać 150 µl 0,1% roztworu fioletu krystalicznego do każdej studzienki zawierającej zawiesinę oderwanego biofilmu. Delikatnie pipetuj, aby zapewnić równomierne wymieszanie zawiesiny biofilmu i fioletu krystalicznego.
3. Inkubacja: Pozostawić płytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić fioletowi krystalicznemu skuteczne zabarwienie biomasy.
4. Płukanie: Po inkubacji ostrożnie usunąć roztwór fioletu krystalicznego ze studzienek bez naruszania biomasy. Przemyć każdy dołek trzykrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć niezwiązany barwnik.
5. Suszenie: Pozostawić płytkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej lub w sterylnym pomieszczeniu z przepływem powietrza. Unikać podgrzewania, ponieważ może to zmienić wyniki.
6. Solubilizacja: Dodać 200 µl 95% etanolu (lub 30% kwasu octowego, w zależności od standardowych praktyk laboratoryjnych) do każdego dołka w celu rozpuszczenia związanego fioletu krystalicznego. Delikatnie wymieszać, pipetując lub wstrząsając płytką przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
7. Pomiar: Zmierzyć gęstość optyczną (OD) rozpuszczonego roztworu fioletu krystalicznego przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
8. Analiza danych: Odjąć średnią wartość OD570 kontroli negatywnych (studzienki z TSB, ale bez inokulum bakteryjnego) od studzienek eksperymentalnych, aby uwzględnić barwienie tła. Zapisz i przeanalizuj dane.

Uwaga: Wykonaj eksperyment w trzech egzemplarzach dla każdego warunku, aby zapewnić powtarzalność. Zapewnić właściwe postępowanie z fioletem krystalicznym i etanolem, przestrzegając protokołów bezpieczeństwa i utylizacji.
 

Najważniejsze zalety UIP400MTP w skrócie:

• Przetwarzanie o wysokiej przepustowości: Zaprojektowany specjalnie dla płytek wielodołkowych, umożliwiając jednoczesne przetwarzanie wielu próbek.
• Jednolita dystrybucja ultradźwięków: Zapewnia równą intensywność ultradźwięków we wszystkich studzienkach, zapewniając spójne wyniki dla wszystkich próbek.
• Użyj dowolnej standardowej płyty: UIP400MTP może obsługiwać wszystkie standardowe płytki wielodołkowe, szalki Petriego i statywy na probówki. Nie są wymagane żadne drogie płytki!
• Przyjazny dla użytkownika interfejs: Łatwy w konfiguracji i kontroli, dzięki czemu jest doskonałym narzędziem do zwiększania produktywności laboratorium. Programowalne ustawienia i automatyzacja ułatwiają standaryzację procesów!