Protokół testu MBEC przy użyciu 96-dołkowej płytki sonicznej UIP400MTP

Test MBEC służy do określenia stężenia środków przeciwdrobnoustrojowych potrzebnych do wyeliminowania biofilmów utworzonych na pokrywkach kołków. Aby ocenić żywotność biofilmu, należy najpierw oddzielić biofilmy od pokrywek płytek 96-dołkowych. Sonikacja jest najbardziej niezawodną i skuteczną metodą tego oderwania. Sonikator wielodołkowy UIP400MTP został specjalnie zaprojektowany do przetwarzania płytek testowych z maksymalną wydajnością i wygodą, usprawniając i przyspieszając wysokowydajne testy MBEC.

Sonikacja do usuwania biofilmu

Sonikacja jest kluczowym krokiem w testach Minimalnego Stężenia Eradykacji Biofilmu (MBEC), umożliwiającym skuteczne usuwanie komórek biofilmu z ich powierzchni. Biofilmy są z natury ustrukturyzowanymi społecznościami mikroorganizmów zamkniętych w macierzy zewnątrzkomórkowej, co czyni je znacznie bardziej odpornymi na środki przeciwdrobnoustrojowe w porównaniu z komórkami planktonicznymi. Podczas testów MBEC sonikacja wykorzystuje fale ultradźwiękowe do generowania kontrolowanej kawitacji, zakłócając matrycę biofilmu i uwalniając osadzone komórki do zawiesiny. Ten krok zapewnia, że komórki biofilmu są równomiernie rozproszone w pożywce regeneracyjnej, ułatwiając dokładną ocenę żywotności poprzez posiew, rozcieńczenie lub metody spektrofotometryczne. Bez odpowiedniego oderwania biofilmu, resztkowe składniki matrycy mogą chronić komórki, prowadząc do niedoszacowania skuteczności przeciwdrobnoustrojowej. Dlatego sonikacja jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wartości MBEC, odzwierciedlających rzeczywisty potencjał zwalczania testowanych środków. Sonikator wielodołkowy UIP400MTP pozwala na łatwe przygotowanie próbek o wysokiej przepustowości na płytkach testowych.

Protokół testu minimalnego stężenia eliminacji biofilmu (MBEC)

Krok 1: Tworzenie biofilmu

1. Przygotować zawiesinę bakterii:
   Wyhodować bakterie w odpowiednim podłożu do fazy logarytmicznej.
   Rozcieńczyć kulturę bakteryjną do określonej gęstości optycznej (np. OD600 ~ 0,1).
2. Zaszczepić płytkę 96-dołkową:
   Dodać zawiesinę bakterii (np. 150-200 µL) do każdej studzienki standardowej 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej.
3. Zamocuj pokrywę kołka:
   Umieść pokrywkę z kołkami na zaszczepionej płytce, aby umożliwić tworzenie się biofilmu na powierzchniach kołków.
4. Inkubować płytkę:
   Inkubować zestaw w odpowiedniej temperaturze (np. 37°C) przez 24-48 godzin bez wytrząsania w celu pobudzenia wzrostu biofilmu.

Krok 2: Leczenie środkami przeciwdrobnoustrojowymi

• Przygotowanie roztworów przeciwdrobnoustrojowych:
  Przygotować zakres stężeń środków przeciwdrobnoustrojowych w świeżym podłożu.
  Narażenie biofilmów na działanie środków przeciwdrobnoustrojowych:
  Zdjąć pokrywkę z hodowli bakteryjnej i przepłukać ją w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub PBS w celu usunięcia komórek planktonicznych.
  Umieścić pokrywkę z kołkiem w nowej 96-dołkowej płytce zawierającej roztwory przeciwdrobnoustrojowe.
• Inkubować płytkę:
  Inkubować przez określony czas (np. 24 godziny), aby umożliwić ekspozycję na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Krok 3: Sonikacja za pomocą sonikatora do płytek 96-dołkowych UIP400MTP

Etap sonikacji ma kluczowe znaczenie dla oderwania biofilmów od pokrywek kołków w celu oceny żywotności. Wykonaj następujące kroki dla sonikatora UIP400MTP:

1. Przygotowanie konfiguracji:
   Napełnić świeżą 96-dołkową płytkę pożywką regeneracyjną (np. bulionem neutralizującym lub świeżą pożywką wzrostową) w każdym dołku.
2. Przenieś pokrywę kołka:
   Zdejmij pokrywę kołka z płytki do obróbki przeciwdrobnoustrojowej.
   Wypłukać pokrywę kołka w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub PBS w celu usunięcia pozostałości środków przeciwdrobnoustrojowych.
3. Ustaw płytę i sonikator:
   Przymocuj pokrywę kołka do płytki z pożywką regeneracyjną.
   Umieścić płytkę z podłożem regeneracyjnym na platformie sonikatora UIP400MTP, upewniając się, że płytka jest wyśrodkowana i stabilna.
4. Dostosuj parametry sonikacji:
   Ustaw parametry sonikacji na UIP400MTP (ustawienia można dostosować do biofilmu):
   Amplituda: 70-100%.
   Czas sonikacji: 1-3 minuty (dostosować w oparciu o odporność biofilmu) w trybie cyklu.
5. Sonicate:
   Rozpocząć proces sonikacji. Wibracje ultradźwiękowe usuną biofilmy z powierzchni kołków do medium regeneracyjnego.
6. Monitorowanie procesu:
   Do monitorowania temperatury próbki w studzienkach można użyć podłączanego czujnika temperatury. UIP400MTP można podłączyć do chłodziarki laboratoryjnej w celu chłodzenia.
7. Obsługa po sonikacji:
   Natychmiast przenieś pożywkę regeneracyjną (teraz zawierającą oderwane biofilmy) na świeżą sterylną płytkę do dalszej analizy.

(A) Płytka zawierająca TSB z 2% glukozą używana do tworzenia biofilmu, odzyskiwania komórek i
oznaczanie MIC i MBCB; (B) Pokrywka z bolcami do tworzenia biofilmów gronkowcowych. oznaczanie MIC i MBCB; (B) Pokrywka z bolcami do tworzenia biofilmów gronkowcowych.
Komórki biofilmu utworzone na szpilkach zostały usunięte za pomocą sonikacji (Hielscher Ultrasound Technology) przez 5 minut w 96-dołkowych płytkach zawierających świeżą pożywkę do odzyskiwania komórek.
(Zdjęcie i opracowanie: ©de Oliveira et al., 2016)

Krok 4: Ocena rentowności

Płytka i hodowla oderwanych biofilmów:

1. Wykonaj seryjne rozcieńczenia pożywki regeneracyjnej i umieść płytkę na agarze, aby policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU).
   Alternatywnie można użyć kolorymetrycznego lub fluorescencyjnego testu żywotności.
2. Rekordowe wyniki:
   Określić MBEC jako najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego, które wyeliminowało wykrywalną żywotność biofilmu.

Projektowanie, produkcja i doradztwo – Jakość Made in Germany

Ultradźwięki Hielscher są dobrze znane z najwyższej jakości i standardów projektowych. Solidność i łatwa obsługa pozwalają na płynną integrację naszych ultradźwiękowców z obiektami przemysłowymi. Trudne warunki i wymagające środowiska są łatwo obsługiwane przez sonikatory Hielscher.

Hielscher Ultrasonics jest firmą posiadającą certyfikat ISO i kładzie szczególny nacisk na wysokowydajne ultradźwięki z najnowocześniejszą technologią i łatwością obsługi. Oczywiście ultradźwięki Hielscher są zgodne z CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.

Przeczytaj tutaj, jak UIP400MTP jest używany do odrywania biofilmu jako etap przygotowania próbki w protokole ASTM E2799 do testowania skuteczności środka dezynfekującego przeciwko biofilmowi Pseudomonas aeruginosa przy użyciu testu MBEC.