Protokół oznaczania MBEC z użyciem sonikatora do płytek 96-dołkowych UIP400MTP

Oznaczenie MBEC służy do określania stężenia środków przeciwdrobnoustrojowych potrzebnego do eliminacji biofilmów utworzonych na pokrywach z kołkami. Aby ocenić żywotność biofilmu, należy najpierw oddzielić biofilmy od pokryw z kołkami płytki 96-dołkowej. Sonikacja jest najbardziej niezawodną i wydajną metodą takiego oddzielania. Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP został zaprojektowany specjalnie do przetwarzania płytek do oznaczeń z maksymalną wydajnością i wygodą, usprawniając i przyspieszając oznaczenia MBEC o wysokiej przepustowości.

Sonikacja do oddzielania biofilmu

Sonikacja jest kluczowym etapem oznaczania minimalnego stężenia eradykującego biofilm (MBEC), umożliwiającym skuteczne odrywanie komórek biofilmu od powierzchni, do której są przytwierdzone. Biofilmy są z natury uporządkowanymi społecznościami mikroorganizmów otoczonymi macierzą zewnątrzkomórkową, co sprawia, że są znacznie bardziej odporne na środki przeciwdrobnoustrojowe niż komórki planktoniczne. Podczas oznaczeń MBEC sonikacja wykorzystuje fale ultradźwiękowe do wytwarzania kontrolowanej kawitacji, która rozbija macierz biofilmu i uwalnia osadzone w niej komórki do zawiesiny. Ten etap zapewnia równomierne rozproszenie komórek biofilmu w podłożu do odzyskiwania komórek, ułatwiając dokładną ocenę żywotności metodami posiewu, rozcieńczeń lub spektrofotometrii. Bez prawidłowego oddzielenia biofilmu pozostałe składniki macierzy mogłyby chronić komórki, prowadząc do niedoszacowania skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych. Dlatego sonikacja jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wartości MBEC, odzwierciedlających rzeczywisty potencjał eradykacyjny badanych środków. Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP umożliwia łatwe przygotowanie próbek w płytkach do oznaczeń z wysoką wydajnością przetwarzania próbek.

Protokół oznaczania minimalnego stężenia eradykującego biofilm (MBEC)

Etap 1: Tworzenie biofilmu

1. Przygotuj zawiesinę bakterii:
   Hoduj bakterie w odpowiednich podłożach do osiągnięcia logarytmicznej fazy wzrostu.
   Rozcieńcz hodowlę bakterii do określonej gęstości optycznej (np. OD600 ~0,1).
2. Zaszczep płytkę 96-dołkową:
   Dodaj zawiesinę bakterii (np. 150–200 µL) do każdego dołka standardowej 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej.
3. Załóż pokrywę z kołkami:
   Umieść pokrywę z kołkami na zaszczepionej płytce, aby umożliwić tworzenie biofilmu na powierzchniach kołków.
4. Inkubuj płytkę:
   Inkubuj zestaw w odpowiedniej temperaturze (np. 37°C) przez 24–48 godzin bez wytrząsania, aby sprzyjać wzrostowi biofilmu.

Etap 2: Działanie środków przeciwdrobnoustrojowych

• Przygotuj roztwory środków przeciwdrobnoustrojowych:
  Przygotuj szereg stężeń środków przeciwdrobnoustrojowych w świeżych podłożach.
  Poddaj biofilmy działaniu środków przeciwdrobnoustrojowych:
  Zdejmij pokrywę z kołkami z hodowli bakterii i przepłucz ją w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub PBS, aby usunąć komórki planktoniczne.
  Umieść pokrywę z kołkami w nowej płytce 96-dołkowej zawierającej roztwory środków przeciwdrobnoustrojowych.
• Inkubuj płytkę:
  Inkubuj przez określony czas (np. 24 godziny), aby umożliwić działanie środków przeciwdrobnoustrojowych.

Etap 3: Sonikacja za pomocą sonikatora do płytek 96-dołkowych UIP400MTP

Etap sonikacji ma kluczowe znaczenie dla oddzielenia biofilmów od pokryw z kołkami w celu oceny żywotności. W przypadku sonikatora UIP400MTP wykonaj następujące czynności:

1. Przygotuj zestaw:
   Napełnij każdy dołek nowej płytki 96-dołkowej podłożem do odzyskiwania komórek (np. bulionem neutralizującym lub świeżym podłożem wzrostowym).
2. Przenieś pokrywę z kołkami:
   Zdejmij pokrywę z kołkami z płytki, w której prowadzono działanie środków przeciwdrobnoustrojowych.
   Przepłucz pokrywę z kołkami w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub PBS, aby usunąć pozostałości środków przeciwdrobnoustrojowych.
3. Ustaw płytkę i sonikator:
   Załóż pokrywę z kołkami na płytkę z podłożem do odzyskiwania komórek.
   Umieść płytkę z podłożem do odzyskiwania komórek na platformie sonikatora UIP400MTP, upewniając się, że płytka znajduje się pośrodku i jest stabilna.
4. Dostosuj parametry sonikacji:
   Ustaw parametry sonikacji w UIP400MTP (ustawienia można dostosować do biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Czas sonikacji: 1–3 minuty (dostosuj do odporności biofilmu) w trybie cyklicznym.
5. Przeprowadź sonikację:
   Rozpocznij proces sonikacji. Drgania ultradźwiękowe oderwą biofilmy od powierzchni kołków i przeniosą je do podłoża do odzyskiwania komórek.
6. Monitoruj proces:
   Użyj podłączanego czujnika temperatury do monitorowania temperatury próbek w dołkach. UIP400MTP można podłączyć do laboratoryjnego agregatu chłodniczego w celu chłodzenia.
7. Postępowanie po sonikacji:
   Natychmiast przenieś podłoże do odzyskiwania komórek (zawierające teraz oddzielone biofilmy) do nowej sterylnej płytki w celu dalszej analizy.

(A) Płytka zawierająca TSB z 2% glukozy, używana do tworzenia biofilmu, odzyskiwania komórek i
oznaczania MIC i MBCB; (B) Pokrywa z kołkami do tworzenia biofilmów gronkowcowych. oznaczanie MIC i MBCB; (B) Pokrywa z kołkami do tworzenia biofilmów gronkowcowych.
Komórki biofilmu utworzonego na kołkach odrywano za pomocą sonikacji (Hielscher Ultrasound Technology) przez 5 min w płytkach 96-dołkowych zawierających świeże podłoże hodowlane do odzyskiwania komórek.
(Zdjęcie i badanie: ©de Oliveira et al., 2016)

Etap 4: Ocena żywotności

Wykonaj posiew i hodowlę oddzielonych biofilmów:

1. Wykonaj seryjne rozcieńczenia podłoża do odzyskiwania komórek i posiej je na agarze, aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU).
   Alternatywnie zastosuj kolorymetryczny lub fluorescencyjny test żywotności.
2. Zapisz wyniki:
   Wyznacz MBEC jako najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego, które wyeliminowało wykrywalną żywotność biofilmu.

Projektowanie, produkcja i doradztwo – jakość wyprodukowana w Niemczech

Urządzenia ultradźwiękowe Hielscher są znane z najwyższych standardów jakości i konstrukcji. Wytrzymałość i łatwa obsługa umożliwiają bezproblemową integrację naszych urządzeń ultradźwiękowych z instalacjami przemysłowymi. Sonikatory Hielscher z łatwością radzą sobie z trudnymi warunkami i wymagającymi środowiskami pracy.

Hielscher Ultrasonics jest firmą z certyfikatem ISO i kładzie szczególny nacisk na urządzenia ultradźwiękowe o wysokiej wydajności, wyposażone w najnowocześniejszą technologię i przyjazne dla użytkownika. Oczywiście urządzenia ultradźwiękowe Hielscher są zgodne z wymaganiami CE i spełniają wymagania UL, CSA oraz RoHs.

Przeczytaj tutaj, jak UIP400MTP jest wykorzystywany do oddzielania biofilmu jako etapu przygotowania próbek w ramach protokołu ASTM E2799 do badania skuteczności środków dezynfekcyjnych wobec biofilmu Pseudomonas aeruginosa za pomocą oznaczenia MBEC.