Protokół ASTM E2799-22 do oceny działania przeciwdrobnoustrojowego

Hielscher UIP400MTP to wydajny sonikator o dużej mocy do płytek wielodołkowych, zaprojektowany w celu usprawnienia etapu sonikacji w protokole ASTM E2799-22. Dostarczając równomiernie energię ultradźwiękową na całej płytce mikrotitracyjnej, UIP400MTP zapewnia powtarzalne i niezawodne odrywanie biofilmów od pokrywek z kołkami bez uszkadzania komórek ani naruszania integralności próbek. Jego duża wydajność przetwarzania próbek i łatwa obsługa znacznie skracają czas przetwarzania, jednocześnie zwiększając odtwarzalność, co czyni go idealnym rozwiązaniem dla laboratoriów prowadzących testy żywotności biofilmów i badania skuteczności działania przeciwdrobnoustrojowego.

ASTM E2799

ASTM E2799 to znormalizowana metoda badawcza opracowana do oceny skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych wobec biofilmów, ze szczególnym uwzględnieniem Pseudomonas aeruginosa. Biofilmy to złożone społeczności drobnoustrojów, które przylegają do powierzchni i wykazują zwiększoną oporność na działanie środków przeciwdrobnoustrojowych, stanowiąc istotne wyzwanie w ochronie zdrowia, przemyśle i ochronie środowiska. Metoda ta wykorzystuje test minimalnego stężenia eradykującego biofilm (MBEC), aby zapewnić niezawodne i odtwarzalne ramy badania środków dezynfekcyjnych w warunkach realistycznie odzwierciedlających występowanie biofilmu.

Jaką rolę odgrywa sonikacja w ASTM E2799?

Sonikacja odgrywa kluczową rolę w protokole ASTM E2799, ułatwiając odrywanie biofilmów od badanych powierzchni i zapewniając dokładną ocenę żywotności drobnoustrojów po zastosowaniu środków. Dzięki wykorzystaniu kontrolowanej energii ultradźwiękowej protokół umożliwia skuteczne i powtarzalne rozbijanie biofilmu bez uszkadzania komórek, co pozwala uzyskać precyzyjne i odtwarzalne wyniki. Czyni to ASTM E2799 niezbędnym narzędziem wspierającym rozwój badań nad biofilmami i opracowywanie skutecznych strategii przeciwdrobnoustrojowych.

Jak przeprowadzić test MBEC zgodnie z ASTM E2799-22

Protokół ASTM E2799-22 określa etapy oceny skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych wobec biofilmów. Podczas korzystania z sonikatora Hielscher UIP400MTP do płytek mikrotitracyjnych protokół można dostosować tak, aby uwzględniał tę zaawansowaną metodę sonikacji do odrywania biofilmów. Poniżej przedstawiono opis etapów dostosowanych do użycia sonikatora UIP400MTP do mikropłytek:

1. Przygotowanie biofilmów
   Przygotuj sterylną płytkę mikrotitracyjną z 96 dołkami i zdejmowanymi pokrywkami z kołkami.
   Zaszczep dołki standaryzowaną zawiesiną bakteryjną w odpowiednim podłożu wzrostowym.
   Umieść pokrywkę z kołkami na płytce, upewniając się, że kołki są całkowicie zanurzone w zawiesinie bakteryjnej.
   Inkubuj płytkę w kontrolowanych warunkach (np. temperatury i czasu), aby umożliwić powstanie biofilmu na kołkach.
2. Działanie środkami przeciwdrobnoustrojowymi
   Po utworzeniu biofilmu wymień podłoże na świeże podłoże zawierające badane środki przeciwdrobnoustrojowe w różnych stężeniach.
   Ponownie załóż pokrywkę z kołkami i inkubuj w warunkach określonych w planie badania.
3. Przygotowanie do odrywania biofilmu
   Po zastosowaniu środków przepłucz pokrywkę z kołkami, zanurzając ją w sterylnym roztworze płuczącym, aby usunąć pozostałości środków przeciwdrobnoustrojowych i słabo przylegające komórki planktoniczne.
4. Odrywanie biofilmu za pomocą sonikatora UIP400MTP
   Przygotuj nową płytkę mikrotitracyjną z 96 dołkami zawierającą podłoże do odzyskiwania komórek (np. bulion neutralizujący).
   Oderwij biofilmy, umieszczając pokrywkę z kołkami w dołkach płytki z podłożem do odzyskiwania komórek.
   Umieść płytkę w sonikatorze UIP400MTP, upewniając się, że pokrywka i płytka są prawidłowo ustawione względem siebie.
   Ustaw sonikator na amplitudę 70%–80% i prowadź sonikację przez 3–4 minuty w trybie cyklicznym, aby zapewnić powtarzalne odrywanie biofilmu bez lizy komórek.
5. Ocena żywotności biofilmu
   Po sonikacji poddaj podłoże do odzyskiwania komórek zawierające oderwane komórki biofilmu analizie przy użyciu standardowych technik mikrobiologicznych lub analitycznych, takich jak:
   • Oznaczanie liczby jednostek tworzących kolonie (CFU): Wykonaj seryjne rozcieńczenia i posiej na podłożu agarowym, aby określić liczbę żywych komórek.
   • Pomiary gęstości optycznej (OD): Zastosuj analizę spektrofotometryczną do oceny gęstości komórek.
   • Testy żywotności oparte na fluorescencji: Określ ilościowo żywe i martwe komórki za pomocą barwników fluorescencyjnych.
6. Analiza danych
   Porównaj dane dotyczące żywotności biofilmów poddanych i niepoddanych działaniu środków, aby określić skuteczność środków przeciwdrobnoustrojowych.
   Oblicz minimalne stężenie eradykujące biofilm (MBEC) na podstawie stężenia wymaganego do wyeliminowania żywych komórek biofilmu.
7. Kontrola jakości
   Zapewnij stałe warunki sonikacji, regularnie kalibrując UIP400MTP i sprawdzając, czy proces odrywania biofilmu nie powoduje znaczącej lizy lub zniszczenia komórek.
   Uwzględnij odpowiednie kontrole, takie jak biofilmy niepoddane działaniu środków oraz próby ślepe zawierające wyłącznie podłoże, aby potwierdzić prawidłowość wyników.

Komórki biofilmu utworzonego na kołkach oderwano za pomocą sonikacji (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Niemcy, UIP250MTP) przez 5 min w płytkach 96-dołkowych zawierających świeże podłoże hodowlane do odzyskiwania komórek.
(Zdjęcie i badanie: ©de Oliveira et al., 2016)

Włączenie UIP400MTP do procedury ASTM E2799-22 optymalizuje proces odrywania biofilmu pod kątem powtarzalności, wydajności i zastosowań wymagających dużej wydajności przetwarzania próbek.