Ekstrakcja macierzy pozakomórkowej za pomocą 96-dołkowego sonikatora UIP400MTP

Tradycyjne metody ekstrakcji macierzy zewnątrzkomórkowej (EM) często obejmują wiele etapów w celu rozbicia macierzy biofilmu. Techniki te mogą być jednak czasochłonne i niespójne, co prowadzi do zmienności wyników. Dzięki sonikatorowi UIP400MTP do 96-dołkowych płytek proces ekstrakcji EM jest znacznie ułatwiony, zapewniając wysoce wydajne, precyzyjne i jednolite rozbijanie biofilmu w formatach o wysokiej przepustowości. UIP400MTP wykorzystuje zogniskowane ultradźwięki do generowania kontrolowanej kawitacji, skutecznie rozbijając matrycę biofilmu przy jednoczesnym zachowaniu żywotności i integralności komórek osadzonych w biofilmie. Korzystanie z UIP400MTP zwiększa powtarzalność i dokładność dalszych testów, takich jak analizy metabolomiczne i proteomiczne, testy żywotności i badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Usprawniając ekstrakcję EM, UIP400MTP umożliwia badaczom uzyskanie spójnych i wysokiej jakości wyników, oferując głębszy wgląd w dynamikę biofilmu i interakcje z czynnikami zewnętrznymi.

ekstrakcja macierzy zewnątrzkomórkowej

Macierz zewnątrzkomórkowa (EM) jest kluczowym składnikiem biofilmów tworzonych przez mikroorganizmy, takie jak Candida albicans. Złożona z polisacharydów, białek, lipidów i pozakomórkowego DNA, EM zapewnia integralność strukturalną, pośredniczy w adhezji do powierzchni i znacząco przyczynia się do oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Ekstrakcja i analiza EM jest niezbędna do zrozumienia biologii biofilmu, wyjaśnienia mechanizmów oporności na leki i zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych.

Protokół ekstrakcji macierzy zewnątrzkomórkowej (EM) z biofilmów Candida albicans przy użyciu UIP400MTP

Protokół ten koncentruje się na ekstrakcji macierzy zewnątrzkomórkowej (EM) statycznych biofilmów Candida albicans. Integracja sonikatora UIP400MTP w celu zastąpienia tradycyjnego skrobania lub etapów opartych na enzymach w celu poprawy wydajności i powtarzalności.

Wymagane materiały

Instrukcje krok po kroku dotyczące ekstrakcji EM

1. Tworzenie statycznego biofilmu
   W przypadku biofilmów statycznych należy zaszczepić C. albicans w studzienkach płytki 96-dołkowej przy użyciu pożywki RPMI-1640. Każda studzienka powinna zawierać stałą objętość inokulum (np. 200 µL na studzienkę).
   Inkubować płytkę w temperaturze 37°C w warunkach statycznych przez 24 godziny, aby umożliwić tworzenie się biofilmu na powierzchniach studzienek.
2. Przygotowanie biofilmu do ekstrakcji
   Po inkubacji delikatnie odessać i wyrzucić zużytą pożywkę z każdego dołka bez naruszania biofilmu.
   Ostrożnie przepłucz każdą studzienkę sterylnym PBS (np. 200 µL), aby usunąć luźno przyczepione komórki i resztki planktonu. Powtórz ten krok dwukrotnie.
   Dodaj świeży PBS lub bufor do ekstrakcji (np. 200 µL) do każdej studzienki, aby przygotować się do sonikacji.
3. Sonikacja z UIP400MTP
   Umieścić płytkę 96-dołkową zawierającą PBS lub bufor ekstrakcyjny na tacy sonikatora UIP400MTP. Aby prawidłowo umieścić płytkę wielodołkową, należy postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku.
   Sonikacja przez 5-6 minut przy łagodnym ustawieniu (amplituda 60%, tryb pulsacyjny), zapewniająca równomierne rozbicie struktury biofilmu i uwolnienie składników EM.
   Użyj kontroli temperatury sonikatora UIP400MTP (czujnik temperatury i ustawienia), aby uniknąć nadmiernego nagrzania lub uszkodzenia próbki.
4. Obróbka żywicą kationowymienną (CER)
   Przenieść sonikowaną ciecz z każdej studzienki do nowej 96-dołkowej płytki.
   Dodaj dwukrotną objętość zawiesiny CER (przygotowanej w PBS lub buforze) do każdego dołka (np. 400 µL całkowitej objętości na dołek).
   Uszczelnij płytkę i inkubuj ją na wytrząsarce lub rotatorze przy 400 obr/min przez 3 godziny, aby umożliwić wiązanie i izolację składników EM.
5. Separacja i filtracja
   Wirować płytkę przy 2000 × g przez 10 minut w celu oddzielenia żywicy i komórek od supernatantu.
   Ostrożnie przenieś supernatant zawierający EM z każdej studzienki do nowej 96-dołkowej płytki.
   Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 µm przy użyciu płytowego systemu próżniowego lub jego odpowiednika, aby uzyskać czysty ekstrakt EM.
6. Analiza EM
   Wykorzystaj techniki takie jak UPLC-Q-TOF-MS do profilowania nieukierunkowanych metabolitów lub zastosuj określone testy (np. BCA dla białek, trójglicerydów i zestawów do kwantyfikacji węglowodanów), aby scharakteryzować składniki EM.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja macierzy zewnątrzkomórkowej

Wysoka wydajność ekstrakcji macierzy pozakomórkowej (EM) za pomocą sonikatora UIP400MTP zrewolucjonizowała przygotowanie próbek do testów wymagających dokładnej analizy właściwości biofilmu. UIP400MTP wykorzystuje fale ultradźwiękowe do precyzyjnego i równomiernego rozbijania macierzy biofilmu, umożliwiając skuteczne uwalnianie składników EM przy jednoczesnym zachowaniu żywotności i integralności komórek. Takie podejście znacznie zwiększa niezawodność testów, takich jak testy żywotności biofilmu, badania proteomiczne i metabolomiczne oraz oceny wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe.

W przypadku testów odzyskiwania biofilmu, takich jak zliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU), ekstrakcja EM za pomocą UIP400MTP zapewnia niezakłócony dostęp odczynników do komórek osadzonych w biofilmie. Podobnie, analizy proteomiczne i metabolomiczne, takie jak UPLC-Q-TOF-MS, korzystają z wysokowydajnej izolacji białek, lipidów i metabolitów. UIP400MTP obsługuje również precyzyjne testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, umożliwiając dokładne określenie wartości MIC i MBEC biofilmu. Co więcej, wydajna ekstrakcja ułatwiona przez UIP400MTP pomaga w testach aktywności enzymów, kwantyfikacji składników i badaniach strukturalnych, oferując cenny wgląd w rolę macierzy zewnątrzkomórkowych w architekturze biofilmu, adhezji i mechanizmach oporności.

Ta wysokowydajna, powtarzalna metoda ekstrakcji optymalizuje przygotowanie EM, zapewniając doskonałe wyniki w szeregu testów związanych z biofilmem.