Protokół oznaczania minimalnego stężenia hamującego (MIC)

Oznaczanie minimalnego stężenia hamującego (MIC) w biofilmie jest niezbędną metodą oceny skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych wobec mikroorganizmów związanych z biofilmem, które wykazują zwiększoną oporność dzięki ochronnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Kluczowym etapem tego oznaczenia jest odrywanie struktur biofilmu w celu uwolnienia osadzonych w nich komórek i dokładnej oceny ich żywotności. Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP ułatwia ten proces, wykorzystując skupione ultradźwięki do wytwarzania kontrolowanej kawitacji, skutecznego odrywania komórek biofilmu i rozpraszania ich w jednorodnej zawiesinie. To precyzyjne i powtarzalne rozbijanie biofilmu zwiększa wiarygodność i wydajność oznaczeń MIC, czyniąc UIP400MTP niezbędnym narzędziem w rozwoju badań nad biofilmem.

Dlaczego warto stosować sonikację podczas oznaczania MIC?

• Dokładne, powtarzalne dane: Uzyskaj jednorodne zawiesiny komórek, które eliminują ochronne działanie macierzy, zapewniając, że wyniki zliczania kolonii i odczyty gęstości optycznej rzeczywiście odzwierciedlają skuteczność przeciwdrobnoustrojową.
• Wysoka wydajność przetwarzania: Przetwarzaj jednocześnie całą płytkę 96-dołkową w zaledwie 1–3 minuty, zastępując powolne, niepowtarzalne ręczne zeskrobywanie sprawnym przebiegiem pracy.
• Zachowana żywotność komórek: Delikatnie odrywaj osadzone komórki bez uszkodzeń fizycznych powodowanych przez zeskrobywanie, utrzymując wyższą przeżywalność na potrzeby wiarygodnych obliczeń MIC/MBEC.
• Zerowe ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego: Korzystaj z bezkontaktowej konstrukcji z sonotrodą kubkową, która zapewnia równomierną obróbkę wszystkich dołków bez kontaktu sond z poszczególnymi próbkami lub dołkami.
• Zgodność ze standardami: Dostosuj swoją metodykę do zwalidowanych protokołów branżowych, takich jak ASTM E2799-22, zwiększając wiarygodność danych na potrzeby wymogów regulacyjnych lub publikacji.
• Wiarygodne badania przesiewowe leków i metod leczenia: Polegaj na wynikach oznaczania wrażliwości, aby podejmować trafniejsze decyzje dotyczące skuteczności przeciwdrobnoustrojowej, profilowania oporności lub opracowywania terapii.

Sonikacja do odrywania biofilmu

Oznaczenie MIC w biofilmie zazwyczaj mierzy żywotność bakterii lub hamowanie wzrostu za pomocą metod takich jak wysiew na podłoże, zliczanie kolonii lub pomiary gęstości optycznej. Sonikacja jest kluczowym etapem oznaczania MIC w biofilmie podczas oceny wrażliwości mikroorganizmów związanych z biofilmem na środki przeciwdrobnoustrojowe. Jej główną funkcją jest odrywanie i rozpraszanie komórek osadzonych w macierzy biofilmu w jednorodnej zawiesinie na potrzeby dokładnej analizy.
Biofilmy są znacznie bardziej oporne na środki przeciwdrobnoustrojowe niż komórki planktoniczne, dlatego prawidłowe odrywanie ma kluczowe znaczenie dla dokładnej analizy. Podczas tego procesu fale ultradźwiękowe wytwarzają kontrolowaną kawitację, rozbijając macierz biofilmu i uwalniając osadzone komórki do jednorodnej zawiesiny w podłożu do odzyskiwania komórek. Ten etap umożliwia precyzyjną ocenę żywotności komórek rozproszonych z biofilmu za pomocą metod takich jak wysiew na podłoże, rozcieńczanie i zliczanie kolonii. Prawidłowe rozbijanie biofilmu przez sonikację zapobiega ochronie komórek przez pozostałe składniki macierzy, co w przeciwnym razie mogłoby prowadzić do niedoszacowania aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP szczególnie dobrze nadaje się do tego celu, oferując precyzyjne i powtarzalne warunki sonikacji, które zapewniają niezawodne przygotowanie płytek do oznaczeń z wysoką wydajnością przetwarzania.

Dlaczego sonikacja jest niezbędna w oznaczeniach minimalnego stężenia hamującego w biofilmie

Pomiary żywotności i zliczanie komórek wymagają całkowitego i niezawodnego odrywania oraz rozpraszania pojedynczych komórek. UIP400MTP umożliwia równomierne odrywanie biofilmu i rozpraszanie komórek bez ich uszkadzania, zapewniając wiarygodne wyniki oznaczeń.

• Złożoność biofilmu: Biofilmy to zorganizowane społeczności drobnoustrojów otoczone macierzą zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS), która chroni mikroorganizmy i zwiększa ich oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe.
• Jednorodne rozproszenie: Aby dokładnie zmierzyć żywotność komórek osadzonych w biofilmie lub ich wrażliwość na środki przeciwdrobnoustrojowe, biofilm należy najpierw oderwać i rozbić do postaci jednorodnej zawiesiny.

Protokół oznaczania minimalnego stężenia hamującego w biofilmie

Oznaczenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) określa najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego wymagane do zahamowania widocznego wzrostu mikroorganizmów. Ten protokół jest przeznaczony dla mikroorganizmów związanych z biofilmem i wykorzystuje sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP do rozbijania biofilmu.

Etap 1: Przygotowanie inokulum bakteryjnego

1. Przygotuj zawiesinę bakterii:
   Hoduj bakterie w odpowiednich podłożach do środkowej fazy wzrostu logarytmicznego.
   Rozcieńcz hodowlę, aby uzyskać znormalizowaną gęstość komórek (np. wzorzec 0,5 McFarlanda lub OD600 ~0,1).
2. Przygotuj roztwory środków przeciwdrobnoustrojowych:
   Rozcieńcz środek przeciwdrobnoustrojowy w odpowiednim podłożu, aby uzyskać zakres stężeń (np. serię dwukrotnych rozcieńczeń).
3. Rozprowadź roztwory do płytki 96-dołkowej:
   Dodaj roztwory środków przeciwdrobnoustrojowych do dołków standardowej płytki 96-dołkowej, uzyskując końcową objętość w dołku ~150–200 µL.
   Uwzględnij kontrole wzrostu (bez środka przeciwdrobnoustrojowego) i kontrole jałowości (bez inokulum bakteryjnego).

Etap 2: Tworzenie biofilmu na pokrywie z kołkami

• Załóż pokrywę z kołkami:
  Umieść specjalną pokrywę z kołkami na zaszczepionych dołkach, upewniając się, że kołki są całkowicie zanurzone w zawiesinie bakterii.
• Inkubuj płytkę:
  Inkubuj w odpowiedniej temperaturze (np. 37°C) przez określony czas (np. 24 godziny) w warunkach statycznych, aby umożliwić tworzenie biofilmu na kołkach.

Etap 3: Ekspozycja na środki przeciwdrobnoustrojowe

• Przepłucz kołki:
  Wyjmij pokrywę z kołkami z zawiesiny bakterii i delikatnie przepłucz w jałowym roztworze soli fizjologicznej lub PBS, aby usunąć luźno przyczepione komórki planktoniczne.
• Poddaj biofilmy działaniu środków przeciwdrobnoustrojowych:
  Przenieś pokrywę z kołkami do nowej płytki 96-dołkowej zawierającej wcześniej przygotowane rozcieńczenia środka przeciwdrobnoustrojowego.
  Inkubuj przez określony czas (np. 24 godziny) w warunkach statycznych, aby umożliwić działanie środka przeciwdrobnoustrojowego na biofilmy.

Etap 4: Sonikacja za pomocą sonikatora do mikropłytek UIP400MTP

Etap sonikacji ma kluczowe znaczenie dla odrywania biofilmów z pokryw z kołkami w celu oceny żywotności. W przypadku sonikatora UIP400MTP wykonaj następujące czynności:

1. Przygotuj układ:
   Napełnij każdy dołek nowej płytki 96-dołkowej podłożem do odzyskiwania komórek (np. bulionem neutralizującym lub jałowym podłożem hodowlanym).
2. Przenieś pokrywę z kołkami:
   Zdejmij pokrywę z kołkami z płytki, w której prowadzono obróbkę środkiem przeciwdrobnoustrojowym.
   Przepłucz pokrywę z kołkami w jałowym roztworze soli fizjologicznej lub PBS, aby usunąć pozostałości środków przeciwdrobnoustrojowych.
3. Umieść płytkę w sonikatorze:
   Załóż pokrywę z kołkami na płytkę z podłożem do odzyskiwania komórek.
   Umieść płytkę z podłożem do odzyskiwania komórek w sonikatorze UIP400MTP, upewniając się, że jest ustawiona centralnie i stabilnie, zgodnie z opisem w instrukcji obsługi.
4. Dostosuj parametry sonikacji:
   Ustaw parametry sonikacji w UIP400MTP (ustawienia można dostosować do biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Czas sonikacji: 1–3 minuty (dostosuj do struktury biofilmu) w trybie cyklicznym.
5. Przeprowadź sonikację:
   Rozpocznij proces sonikacji. Fale ultradźwiękowe rozbiją macierz biofilmu i oderwą komórki, uwalniając je do podłoża do odzyskiwania komórek.
6. Monitoruj proces:
   Użyj podłączanego czujnika temperatury do monitorowania temperatury próbek w dołkach. UIP400MTP można podłączyć do laboratoryjnego agregatu chłodniczego w celu chłodzenia.
7. Postępowanie po sonikacji:
   Natychmiast przenieś podłoże do odzyskiwania komórek zawierające oderwane biofilmy do nowej jałowej płytki w celu dalszej analizy.

(A) Płytka zawierająca TSB z 2% glukozy, używana do tworzenia biofilmu, odzyskiwania komórek oraz oznaczania MIC i MBEC; (B) Pokrywa z kołkami do tworzenia biofilmów gronkowcowych.
Komórki biofilmu powstałego na kołkach odrywano za pomocą sonikacji (Hielscher Ultrasound Technology) przez 5 min w płytkach 96-dołkowych zawierających świeże podłoże hodowlane do odzyskiwania komórek.
(Zdjęcie i badanie: ©de Oliveira et al., 2016)

Etap 4: Ocena żywotności

Wysiej i hoduj oderwane biofilmy:

1. Wykonaj serię rozcieńczeń podłoża do odzyskiwania komórek i wysiej je na agar, aby zliczyć jednostki tworzące kolonie (CFU).
2. Oceń MIC:
   Wyznacz MIC jako najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego, które całkowicie hamuje widoczny wzrost drobnoustrojów w podłożu do odzyskiwania komórek.

MIC – minimalne stężenie hamujące: przykład płytki mikrotitracyjnej i interpretacji wyników mikrorozcieńczeń.
(Badanie i ilustracja: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Kto korzysta z sonikacji podczas oznaczania MIC?

• Producenci wyrobów medycznych: Do badania skuteczności powłok powierzchniowych i walidacji protokołów czyszczenia wyrobów podatnych na tworzenie biofilmu.
• Mikrobiolodzy kliniczni: Do dokładnego diagnozowania zakażeń związanych z implantami (takich jak PJI) poprzez odzyskiwanie bakterii z elementów wyrobów medycznych.
• Twórcy leków: Do oceny skuteczności nowych środków przeciwdrobnoustrojowych wobec opornych patogenów osadzonych w biofilmie.
• Badacze akademiccy: Do prowadzenia powtarzalnych badań nad biologią biofilmu i mechanizmami oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe z wysoką wydajnością przetwarzania.
• Przemysłowe zespoły kontroli jakości: Do oceny obrastania biologicznego i skuteczności środków dezynfekujących w warunkach przemysłowych (np. z wykorzystaniem norm ASTM E2799-22).

Projektowanie, produkcja i doradztwo – jakość z Niemiec

Urządzenia ultradźwiękowe Hielscher są znane z najwyższej jakości i najwyższych standardów projektowania. Solidność i łatwa obsługa umożliwiają płynną integrację naszych urządzeń ultradźwiękowych z instalacjami przemysłowymi. Sonikatory Hielscher z łatwością radzą sobie w trudnych warunkach i wymagających środowiskach.

Hielscher Ultrasonics jest firmą z certyfikatem ISO i kładzie szczególny nacisk na wysokowydajne urządzenia ultradźwiękowe wykorzystujące najnowocześniejszą technologię i zapewniające łatwą obsługę. Oczywiście urządzenia ultradźwiękowe Hielscher są zgodne z CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.

Przeczytaj tutaj, jak UIP400MTP jest wykorzystywany do odrywania biofilmu w protokole ASTM E2799 – badanie skuteczności środków dezynfekujących wobec biofilmu Pseudomonas aeruginosa za pomocą oznaczenia MBEC.