Protokół testu minimalnego stężenia hamującego (MIC)
Test minimalnego stężenia hamującego (MIC) oparty na biofilmie jest podstawową metodą oceny skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko mikroorganizmom związanym z biofilmem, które wykazują zwiększoną oporność ze względu na ich ochronną macierz zewnątrzkomórkową. Kluczowym krokiem w tym teście jest rozbicie struktur biofilmu w celu uwolnienia osadzonych komórek dla dokładnej oceny żywotności. Sonikator wielodołkowy UIP400MTP ułatwia ten proces, wykorzystując skupione ultradźwięki do generowania kontrolowanej kawitacji, skutecznie odrywając komórki biofilmu i rozpraszając je w jednorodnej zawiesinie. To precyzyjne i powtarzalne rozerwanie biofilmu zwiększa niezawodność i wydajność testów MIC, czyniąc UIP400MTP niezbędnym narzędziem w rozwoju badań nad biofilmem.
Sonikacja do usuwania biofilmu
Test MIC oparty na biofilmie zwykle mierzy żywotność bakterii lub zahamowanie wzrostu przy użyciu metod takich jak posiew, liczenie kolonii lub pomiary gęstości optycznej. Sonikacja jest krytycznym etapem w testach MIC opartych na biofilmie podczas oceny wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe mikroorganizmów związanych z biofilmem. Jej podstawową funkcją jest oderwanie i rozproszenie komórek osadzonych w matrycy biofilmu do jednolitej zawiesiny w celu dokładnej analizy.
Biofilmy są znacznie bardziej odporne na środki przeciwdrobnoustrojowe w porównaniu do komórek planktonicznych, co sprawia, że właściwe oderwanie ma kluczowe znaczenie dla dokładnej analizy. Podczas tego procesu fale ultradźwiękowe generują kontrolowaną kawitację, rozbijając matrycę biofilmu i uwalniając osadzone komórki do jednolitej zawiesiny w pożywce regeneracyjnej. Ten etap umożliwia precyzyjną ocenę żywotności komórek rozproszonych w biofilmie za pomocą metod takich jak posiew, rozcieńczanie i liczenie kolonii. Właściwe rozbicie biofilmu za pomocą sonikacji zapobiega osłonięciu komórek przez resztkowe składniki matrycy, co w przeciwnym razie mogłoby prowadzić do niedoszacowania aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Sonikator wielodołkowy UIP400MTP jest szczególnie dobrze przystosowany do tego celu, oferując precyzyjne i powtarzalne warunki sonikacji w celu zapewnienia niezawodnego i wysokowydajnego przygotowania płytek testowych.
Sonikator mikropłytek UIP400MTP do precyzyjnie kontrolowanego odrywania biofilmu w testach MIC i MBEC.
Dlaczego sonikacja jest niezbędna w testach minimalnego stężenia hamującego opartych na biofilmach?
Do pomiarów żywotności i liczenia komórek wymagane jest całkowite i niezawodne oderwanie i rozproszenie pojedynczych komórek. UIP400MTP promuje jednolite, nieuszkadzające oderwanie biofilmu i dyspersję komórek w celu uzyskania solidnych wyników testów.
- Złożoność biofilmu: Biofilmy to ustrukturyzowane społeczności drobnoustrojów zamknięte w macierzy zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS), która chroni mikroorganizmy i czyni je bardziej odpornymi na środki przeciwdrobnoustrojowe.
- Jednolite rozproszenie: Aby dokładnie zmierzyć żywotność komórek osadzonych w biofilmie lub ich podatność na środki przeciwdrobnoustrojowe, biofilm musi najpierw zostać usunięty i rozbity na jednorodną zawiesinę.
Protokół testu minimalnego stężenia hamującego oparty na biofilmie
Test minimalnego stężenia hamującego (MIC) określa najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego wymagane do zahamowania widocznego wzrostu mikroorganizmów. Protokół ten jest przeznaczony dla mikroorganizmów związanych z biofilmem, przy użyciu sonikatora wielodołkowego UIP400MTP do rozbijania biofilmu.
Krok 1: Przygotowanie inokulum bakteryjnego
- Przygotować zawiesinę bakterii:
Wyhodować bakterie w odpowiednich pożywkach do połowy fazy logarytmicznej.
Rozcieńczyć hodowlę, aby uzyskać znormalizowaną gęstość komórek (np. 0,5 standardu McFarlanda lub OD600 ~0,1). - Przygotowanie roztworów przeciwdrobnoustrojowych:
Rozcieńczyć środek przeciwdrobnoustrojowy w odpowiednim podłożu, aby uzyskać zakres stężeń (np. dwukrotne seryjne rozcieńczenia). - Dozować do płytki 96-dołkowej:
Dodać roztwory przeciwdrobnoustrojowe do studzienek standardowej płytki 96-dołkowej, o końcowej objętości studzienki ~150-200 µL.
Obejmują kontrole wzrostu (bez środków przeciwdrobnoustrojowych) i kontrole sterylności (bez inokulum bakteryjnego).
Krok 2: Tworzenie się biofilmu na pokrywie kołka
- Zamocuj pokrywę kołka:
Umieść specjalną pokrywkę z kołkami na zaszczepionych dołkach, upewniając się, że kołki są całkowicie zanurzone w zawiesinie bakteryjnej. - Inkubować płytkę:
Inkubować w odpowiedniej temperaturze (np. 37°C) przez określony czas (np. 24 godziny) w warunkach statycznych, aby umożliwić tworzenie się biofilmu na kołkach. - Opłucz kołki:
Zdejmij pokrywkę z zawiesiny bakteryjnej i delikatnie przepłucz w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub PBS, aby usunąć luźno przyczepione komórki planktoniczne. - Narażenie na działanie środków przeciwdrobnoustrojowych:
Przenieś pokrywkę z kołkiem do nowej płytki 96-dołkowej zawierającej przygotowane wcześniej rozcieńczenia środków przeciwdrobnoustrojowych.
Inkubować przez określony czas (np. 24 godziny) w warunkach statycznych, aby umożliwić działanie środka przeciwdrobnoustrojowego na biofilmy.
Krok 3: Ekspozycja na środki przeciwdrobnoustrojowe
Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP do wysokowydajnego przygotowywania próbek
Krok 4: Sonikacja za pomocą sonikatora do mikropłytek UIP400MTP
Etap sonikacji ma kluczowe znaczenie dla oderwania biofilmów od pokrywek kołków w celu oceny żywotności. Wykonaj następujące kroki dla sonikatora UIP400MTP:
- Przygotowanie konfiguracji:
Napełnić świeżą 96-dołkową płytkę pożywką regeneracyjną (np. bulionem neutralizującym lub sterylną pożywką wzrostową) w każdym dołku. - Przenieś pokrywę kołka:
Zdejmij pokrywę kołka z płytki do obróbki przeciwdrobnoustrojowej.
Wypłukać pokrywę kołka w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub PBS w celu usunięcia pozostałości środków przeciwdrobnoustrojowych. - Umieścić płytkę w sonikatorze:
Przymocuj pokrywę kołka do płytki z pożywką regeneracyjną.
Umieścić płytkę z podłożem regeneracyjnym w sonikatorze UIP400MTP, upewniając się, że płytka jest wyśrodkowana i stabilna, jak opisano w instrukcji. - Dostosuj parametry sonikacji:
Ustaw parametry sonikacji na UIP400MTP (ustawienia mogą być dostosowane do biofilmu):
Amplituda: 70-100%.
Czas sonikacji: 1-3 minuty (dostosować w oparciu o strukturę biofilmu) w trybie cyklu. - Sonicate:
Rozpocząć proces sonikacji. Fale ultradźwiękowe rozbiją matrycę biofilmu i usuną komórki do pożywki regeneracyjnej. - Monitorowanie procesu:
Do monitorowania temperatury próbki w studzienkach można użyć podłączanego czujnika temperatury. UIP400MTP można podłączyć do chłodziarki laboratoryjnej w celu chłodzenia. - Obsługa po sonikacji:
Natychmiast przenieść podłoże regeneracyjne zawierające oderwane biofilmy na świeżą sterylną płytkę w celu późniejszej analizy.
(A) Płytka zawierająca TSB z 2% glukozą używana do tworzenia biofilmów, odzyskiwania komórek oraz określania MIC i MBEC; (B) Pokrywka ze szpilkami do tworzenia biofilmów gronkowcowych.
Komórki biofilmu utworzone na szpilkach zostały usunięte za pomocą sonikacji (Hielscher Ultrasound Technology) przez 5 minut w 96-dołkowych płytkach zawierających świeżą pożywkę do odzyskiwania komórek.
(Zdjęcie i opracowanie: ©de Oliveira et al., 2016)
Krok 4: Ocena rentowności
Płytka i hodowla oderwanych biofilmów:
- Wykonaj seryjne rozcieńczenia pożywki regeneracyjnej i umieść płytkę na agarze, aby policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU).
- Ocena MIC:
Określić MIC jako najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego, które całkowicie hamuje widoczny wzrost drobnoustrojów w pożywce regeneracyjnej.
MIC Minimalne stężenie hamujące: Przykład płytki mikrotitracyjnej i interpretacja wyników mikrorozcieńczeń.
(Opracowanie i zdjęcie: ©Jaskiewicz et al. 2019)
Projektowanie, produkcja i doradztwo – Jakość Made in Germany
Ultradźwięki Hielscher są dobrze znane z najwyższej jakości i standardów projektowych. Solidność i łatwa obsługa pozwalają na płynną integrację naszych ultradźwiękowców z obiektami przemysłowymi. Trudne warunki i wymagające środowiska są łatwo obsługiwane przez sonikatory Hielscher.
Hielscher Ultrasonics jest firmą posiadającą certyfikat ISO i kładzie szczególny nacisk na wysokowydajne ultradźwięki z najnowocześniejszą technologią i łatwością obsługi. Oczywiście ultradźwięki Hielscher są zgodne z CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.
Usprawnienie przygotowania próbek na płytkach 96-dołkowych i płytkach testowych przy użyciu sonikatora wielodołkowego UIP400MTP
Literatura / Referencje
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
często zadawane pytania
Co to jest test MIC?
Test minimalnego stężenia hamującego (MIC) jest standaryzowanym testem stosowanym do określenia najniższego stężenia środka przeciwdrobnoustrojowego wymaganego do zahamowania widocznego wzrostu mikroorganizmu. Jest on powszechnie wykonywany przy użyciu metod mikrorozcieńczeń w bulionie lub rozcieńczeń w agarze, w których mikroorganizmy są narażone na seryjne rozcieńczenia środka przeciwdrobnoustrojowego. Testy MIC mają kluczowe znaczenie dla oceny skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych, kierowania leczeniem klinicznym i oceny poziomów oporności zarówno mikroorganizmów planktonicznych, jak i związanych z biofilmem.
Jaka jest różnica między testem minimalnego stężenia hamującego opartym na biofilmie a testem MBIC?
Oparty na biofilmie test minimalnego stężenia hamującego (MIC) i test minimalnego stężenia hamującego biofilmu (MBIC) są powiązane, ale różnią się celem i metodologią.
Test MIC oparty na biofilmie ocenia najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego potrzebne do zahamowania widocznego wzrostu lub żywotności biofilmu, koncentrując się na komórkach związanych z biofilmem, a nie na bakteriach planktonicznych. W przeciwieństwie do tego, test MBIC mierzy w szczególności zdolność środka przeciwdrobnoustrojowego do zapobiegania tworzeniu się biofilmu, a nie do leczenia wcześniej utworzonych biofilmów. Podczas gdy oba testy dotyczą bakterii związanych z biofilmem, test MIC oparty na biofilmie dotyczy leczenia, a test MBIC kładzie nacisk na zapobieganie, co czyni je komplementarnymi narzędziami do badania skuteczności przeciwdrobnoustrojowej przeciwko biofilmom.
Jakie biofilmy są wykorzystywane w testach MIC?
Zarówno biofilmy drobnoustrojów, jak i komórki planktoniczne są wykorzystywane w testach minimalnego stężenia hamującego (MIC) do badania skuteczności przeciwdrobnoustrojowej w różnych warunkach.
- Komórki planktoniczne:
Komórki planktoniczne to swobodnie pływające, pojedyncze komórki drobnoustrojów, które służą jako standardowy model dla tradycyjnych testów MIC. Typowe mikroorganizmy obejmują Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Candida albicans. Testy te określają MIC wymagane do zahamowania wzrostu wolno żyjących komórek i mają kluczowe znaczenie dla wstępnych badań przesiewowych przeciwdrobnoustrojów. - Komórki związane z biofilmem:
Komórki biofilmu to mikroorganizmy osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej, co znacznie zwiększa ich oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. Testy MIC dla biofilmu często obejmują:- Bakterie Gram-ujemne: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae, znane z tworzenia biofilmu w infekcjach i warunkach przemysłowych.
- Bakterie Gram-dodatnie: Staphylococcus aureus (w tym MRSA), Staphylococcus epidermidis i Enterococcus faecalis, powszechnie występujące w zakażeniach związanych z urządzeniami.
- Grzyby: Candida albicans i gatunki pokrewne, ważne w infekcjach grzybiczych związanych z biofilmem.
- Biofilmy mieszane: Są one czasami wykorzystywane do odtwarzania naturalnych biofilmów polimikrobiologicznych, takich jak te występujące w przewlekłych ranach lub biofoulingu przemysłowym.
Porównując wartości MIC dla komórek planktonicznych i komórek związanych z biofilmem, naukowcy mogą ocenić zwiększoną odporność biofilmów i zidentyfikować środki skuteczne przeciwko tym bardziej odpornym społecznościom drobnoustrojów.
Jaka jest różnica między MIC a MBEC?
Minimalne stężenie hamujące (MIC) to najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego wymagane do zapobiegania tworzeniu się biofilmu, podczas gdy minimalne stężenie eliminujące biofilm (MBEC) to najniższe stężenie potrzebne do wyeliminowania ustalonego biofilmu. MIC koncentruje się na zapobieganiu biofilmowi, podczas gdy MBEC ocenia skuteczność leczenia przeciwko dojrzałym biofilmom.
Jakie płytki są powszechnie stosowane w testach MBEC?
Płytki mikrotitracyjne powszechnie stosowane w testach MBEC to zazwyczaj płytki 96-dołkowe wykonane z polistyrenu lub polipropylenu. Materiały te zapewniają odpowiednią powierzchnię do tworzenia biofilmu i są chemicznie odporne na środki przeciwdrobnoustrojowe testowane podczas testu. Płytki polistyrenowe są powszechnie preferowane ze względu na ich przejrzystość optyczną, co jest korzystne dla dalszych analiz, takich jak pomiary spektrofotometryczne lub fluorescencyjne. Konstrukcja tych płytek obejmuje zdejmowane pokrywy z kołkami, które są niezbędne do przeprowadzenia testu, ponieważ biofilmy tworzą się na kołkach, które są zanurzone w studzienkach zawierających pożywkę wzrostową. Standaryzowane płytki, takie jak te zgodne z protokołem testu MBEC, są specjalnie zaprojektowane, aby zapewnić powtarzalność i kompatybilność z sonikatorem UIP400MTP lub innym sprzętem do przetwarzania.
Czym są płytki PEG-Lid?
Płytki z pokrywką PEG to wyspecjalizowane systemy płytek wielodołkowych, w których pokrywka jest wyposażona w małe kołki lub szpilki z glikolu polietylenowego (PEG) wystające do każdej studzienki. Kołki te zapewniają powierzchnię do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego w kontrolowanych warunkach, naśladując wzrost biofilmu w świecie rzeczywistym. Konstrukcja umożliwia rozwój biofilmów na kołkach, podczas gdy studzienki zawierają pożywki wzrostowe lub środki przeciwdrobnoustrojowe, umożliwiając wysokowydajne testowanie podatności biofilmu na leczenie, takie jak w testach MBEC, MBIC i MIC.
Jaka jest zaleta ultradźwiękowego usuwania biofilmu w porównaniu do skrobania komórek?
Ultradźwiękowe usuwanie biofilmu oferuje znaczną przewagę nad skrobaniem komórek, zapewniając nieinwazyjną, jednolitą i wysoce skuteczną metodę usuwania biofilmu z powierzchni. W przeciwieństwie do skrobania, które może być niespójne i uszkadzać leżącą poniżej powierzchnię lub komórki, fale ultradźwiękowe penetrują matrycę biofilmu, rozbijając ją bez naruszania integralności sąsiednich struktur. Metoda ta zapewnia powtarzalność, minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia i jest szczególnie skuteczna w zastosowaniach wymagających precyzyjnego usuwania biofilmu, takich jak badania mikrobiologiczne lub testowanie urządzeń medycznych. Dowiedz się więcej o tym, jak sonikator UIP400MTP radzi sobie ze skrobaniem komórek!
Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe od laboratorium do rozmiar przemysłowy.