Olbaltumvielu nogulšņu solubilizācija ar ultraskaņu
Proteomikā paraugu sagatavošana nekad nav mazsvarīga detaļa. Tā ir pamats identifikācijas precizitātei, kvantitatīvās noteikšanas uzticamībai un reproducējamībai. Viens no pastāvīgākajiem izaicinājumiem olbaltumvielu paraugu sagatavošanā ir efektīva olbaltumvielu nogulšņu atkārtota izšķīdināšana pēc izgulsnēšanas vai koncentrēšanas posmiem. Tieši šajā jomā olbaltumvielu nogulšņu solubilizācija ar ultraskaņu kļūst arvien nozīmīgāka. Izmantojot kontrolētu apstrādi ar ultraskaņu, laboratorijas var uzlabot olbaltumvielu atgūšanu, paātrināt nogulšņu izšķīšanu un efektīvāk sagatavot paraugus turpmākai masspektrometrijai un bioķīmiskajai analīzei.
Olbaltumvielu solubilizācija: kāpēc apstrāde ar ultraskaņu ir nozīmīga mūsdienu proteomikā
Olbaltumvielu nogulsnes bieži veidojas, veicot izgulsnēšanu ar acetonu, etanolu, metanola un hloroforma maisījumu, amonija sulfātu vai TCA. Šīs darbplūsmas plaši izmanto, lai pirms analīzes atdalītu piemaisījumus, koncentrētu olbaltumvielas un attīrītu ekstraktus. Tomēr pēc izgulsnēšanas pabeigšanas iegūtās nogulsnes var būt grūti atkārtoti solubilizēt. Blīvi agregāti, hidrofobi domēni, ar membrānām saistītas olbaltumvielas un olbaltumvielu kompleksi ar spēcīgu savstarpējo mijiedarbību bieži nepakļaujas parastai maisīšanai vai maisīšanai ar vorteksa maisītāju. Nepilnīga solubilizācija tad var izraisīt parauga zudumus, izkropļotu olbaltumvielu pārstāvētību un sliktu reproducējamību starp eksperimentiem.
Apstrāde ar ultraskaņu novērš tieši šo ierobežojumu. Radot mehānisko enerģiju šķidrā vidē, apstrāde ar ultraskaņu sagrauj kompaktās nogulšņu struktūras, veicina buferšķīduma iespiešanos un disperģē agregēto materiālu šķīdumā. Rezultāts ir ātrāka un bieži pilnīgāka olbaltumvielu atkārtota izšķīdināšana, kas ir īpaši vērtīga, strādājot ar ierobežotu paraugu daudzumu, sarežģītiem lizātiem vai grūti analizējamiem proteomikas mērķobjektiem.
Mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP olbaltumvielu ekstrakcijai un nogulšņu solubilizācijai
Kāpēc olbaltumvielu nogulsnes ir grūti solubilizēt
Olbaltumvielu izgulsnēšana ir efektīva, jo tā liek olbaltumvielām izdalīties no šķīduma. Tomēr tas pats process, kas padara izgulsnēšanu lietderīgu, rada arī grūtības atgūt olbaltumvielas no nogulsnēm. Pēc nogulšņu izveidošanās olbaltumvielas var kļūt cieši sablīvētas un daļēji denaturētas. Hidrofobā mijiedarbība var pastiprināties, starpmolekulārā saistīšanās var pieaugt, un dažas olbaltumvielas var aizturēt sāļus, lipīdus, nukleīnskābes vai citus matricas komponentus. Pat izmantojot spēcīgu solubilizācijas buferšķīdumu, pasīva resuspendēšana bieži ir lēna un nepilnīga.
Proteomikā tas ir nozīmīgi, jo nepilnīga nogulšņu izšķīšana ne tikai samazina kopējo iznākumu. Tā var selektīvi izslēgt noteiktas olbaltumvielu klases, īpaši membrānu olbaltumvielas, strukturālās olbaltumvielas vai olbaltumvielu veidus ar noslieci uz agregāciju. Tas nozīmē, ka galīgais analīzes rezultāts var vairs neatspoguļot sākotnējā parauga patieso sastāvu. Augstas izšķirtspējas proteomikā, kur nelielas atšķirības olbaltumvielu daudzumā vai pēctranslācijas modifikācijās var būt bioloģiski izšķirošas, šāds sagatavošanas radīts rezultātu izkropļojums ir nopietns ierobežojums.
Kā apstrāde ar ultraskaņu uzlabo olbaltumvielu nogulšņu solubilizāciju
Apstrāde ar ultraskaņu uzlabo solubilizāciju, ievadot paraugā augstfrekvences mehānisko enerģiju. Šī enerģija palīdz sašķelt kompakto nogulšņu materiālu un palielina saskari starp solubilizācijas buferšķīdumu un nogulsnēs esošajām olbaltumvielām. Tā vietā, lai paļautos tikai uz difūziju un manuālu maisīšanu, šis process aktīvi disperģē nogulsnes mazākās frakcijās, kuras ir vieglāk izšķīdināt.
Praktiskais ieguvums ir ievērojams. Apstrāde ar ultraskaņu var:
- paātrināt blīvu vai grūti izšķīdināmu olbaltumvielu nogulšņu izšķīšanu
- uzlabot slikti šķīstošu un agregētu olbaltumvielu atgūšanu
- samazināt sagatavošanas laiku proteomikas darbplūsmās
- veicināt viendabīgāku paraugu iegūšanu šķelšanai un analīzei
Šāda uzlabota dispersija ir īpaši noderīga, ja nogulsnes atkārtoti suspendē buferšķīdumos, kas satur urīnvielu, tiourīnvielu, detergentus, haotropos aģentus vai citus proteomikā plaši izmantotus reaģentus. Apstrāde ar ultraskaņu palīdz šiem komponentiem efektīvāk piekļūt nogulsnēm un tās solubilizēt, iegūstot viendabīgāku parauga šķīdumu.
Ultraskaņas solubilizācijas priekšrocības proteomikā
Ultraskaņas solubilizācijas galvenā priekšrocība ir tā, ka tā pārvērš bieži vien nepietiekami novērtētu sagatavošanas posmu par kontrolējamu un efektīvu procesu. Proteomikā tas tieši ietekmē analīzi.
- Pirmkārt, uzlabota solubilizācija palielina varbūtību, ka fermentatīvajai šķelšanai pakļautais paraugs reprezentē visu olbaltumvielu populāciju. Piemēram, šķelšana ar tripsīnu ir atkarīga no tā, vai olbaltumvielas šķīdumā ir pietiekami atritinātas un pieejamas. Ja daļa nogulšņu paliek neizšķīdusi, attiecīgās olbaltumvielas faktiski nepiedalās peptīdu veidošanā un tādējādi netiek detektētas.
- Otrkārt, apstrāde ar ultraskaņu var uzlabot reproducējamību. Manuālai nogulšņu atkārtotai suspendēšanai ir raksturīga mainība, īpaši tad, ja atšķiras operatori, nogulšņu daudzums vai paraugu matricas. Kontrolēta apstrāde ar ultraskaņu standartizē paraugam pievadīto fizikālo enerģiju, kas var samazināt atšķirības starp sagatavošanas reizēm un uzlabot rezultātu saskaņotību turpmākajās darbplūsmās, kurās izmanto LC-MS vai gēlu metodes.
- Treškārt, apstrāde ar ultraskaņu ir īpaši vērtīga paraugiem ar nelielu sākotnējā materiāla daudzumu un vērtīgiem paraugiem. Klīniskajā proteomikā, biomarķieru atklāšanā, šūnu kultūru eksperimentos un audu pētījumos bieži ir pieejams ierobežots materiāla daudzums. Jebkāds olbaltumvielu zudums solubilizācijas laikā samazina parauga informatīvo vērtību. Efektīva atkārtota šķīdināšana ar ultraskaņu palīdz saglabāt pēc iespējas vairāk analīta.
- Visbeidzot, apstrāde ar ultraskaņu paātrina darbplūsmu. Proteomikas laboratorijām, kurās apstrādā daudzus paraugus, ir vajadzīgas uzticamas sagatavošanas metodes ar mazu laika patēriņu. Nogulsnes, kas izšķīst ātri un pilnībā, nav tikai ērtība; tas samazina aizkavēšanos un kļūdu risku darbā ar paraugiem, kā arī palielina paraugu apstrādes ražīgumu.
Apstrāde ar ultraskaņu salīdzinājumā ar tradicionālajām atkārtotas suspendēšanas metodēm
Tradicionālās nogulšņu atkārtotas suspendēšanas metodes parasti ietver pipetēšanu, maisīšanu, maisīšanu ar vorteksa maisītāju, ilgstošu inkubāciju vai atkārtotus karsēšanas posmus. Lai gan šīs metodes var būt iedarbīgas irdenām nogulsnēm, tās bieži vien nav pietiekami efektīvas ļoti blīva vai hidrofoba olbaltumvielu materiāla apstrādē. Ar mehānisku maisīšanu vien var neizdoties pilnībā sagraut nogulšņu struktūru, tādēļ var saglabāties redzamas daļiņas vai neredzamas nešķīstošas frakcijas.
Apstrāde ar ultraskaņu nodrošina aktīvāku un mērķtiecīgāku pieeju. Tā fiziski sagrauj nogulsnes un veicina ātru homogenizāciju, nepaļaujoties uz lēnu buferšķīduma difūziju. Tas nenovērš vajadzību pēc piemērota buferšķīduma atkārtotai suspendēšanai, taču būtiski uzlabo šā buferšķīduma iedarbību.
Salīdzinājumā ar pilnībā manuālām metodēm ultraskaņas solubilizācija bieži nodrošina labāku procesa kontroli, lielāku efektivitāti un labāku piemērotību sarežģītiem proteomikas lietojumiem. Laboratorijām, kas tiecas gan pēc analītiskās kvalitātes, gan darbības uzticamības, tas padara apstrādi ar ultraskaņu par pārliecinošu izvēli.
Piemērotākie olbaltumvielu nogulšņu ultraskaņas solubilizācijas lietojumi
Ultraskaņas solubilizācija ir īpaši noderīga darbplūsmās, kas ietver:
- olbaltumvielu izgulsnēšanu pirms masspektrometrijas,
- no šūnu lizātiem vai audu ekstraktiem iegūtu nogulšņu atkārtotu izšķīdināšanu,
- ar membrānām bagātu vai uz agregāciju tendētu olbaltumvielu atgūšanu,
- un paraugu sagatavošanu kvantitatīvajai proteomikai, kur reproducējamība ir būtiska.
Tā ir arī ļoti nozīmīga, ja nogulsnes ir uzglabātas, pārmērīgi izžāvētas vai iegūtas no sarežģītām bioloģiskām matricām. Šādos gadījumos pasīva atkārtota suspendēšana var kļūt īpaši neefektīva, savukārt apstrāde ar ultraskaņu palīdz atjaunot parauga lietojamību ar mazāku manuālā darba apjomu.
VialTweeter ultraskaņas apstrādes ierīce 10 paraugu vienlaicīgai apstrādei ar ultraskaņu, piemēram, olbaltumvielu ekstrakcijai un solubilizācijai
Atrodiet labāko ultraskaņas apstrādes ierīci savai olbaltumvielu solubilizācijas darbplūsmai!
Laboratorijām, kas strādā ar vērtīgiem paraugiem, nelielu izejmateriāla daudzumu vai proteomikā ar lielu paraugu apstrādes ražīgumu, Hielscher piedāvā vairākus apstrādes ar ultraskaņu formātus, kurus var precīzi pielāgot darbplūsmai.
Neatkarīgi no tā, vai izvēlaties Hielscher zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīci, vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīci VialTweeter vai mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP, katrs ultraskaņas apstrādes ierīces modelis ir paredzēts atšķirīgam paraugu sagatavošanas scenārijam, vienlaikus nodrošinot vienu un to pašu galveno priekšrocību: reproducējamu ultraskaņas enerģiju efektīvai un kontrolētai paraugu apstrādei.
Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīces
Ultraskaņas zondes, piemēram, UP200Ht, ir īpaši piemērotas atsevišķu paraugu tiešai apstrādei ar ultraskaņu. Proteomikas laboratorijām UP200Ht ir laba izvēle, ja olbaltumvielu nogulsnes intensīvi jāresuspendē mazos līdz vidējos tilpumos, īpaši gadījumos, kad svarīga ir metodes kontrole un atkārtojamība. Tieša apstrāde ar ultraskaņas zondi var ātri sagraut blīvo nogulšņu materiālu un palīdzēt solubilizācijas buferšķīdumiem piekļūt olbaltumvielām, kas citādi paliktu daļēji neizšķīdušas.
Visu zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīču pārskats!
Vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīce VialTweeter
Ja vairāki slēgti flakoni jāapstrādā identiskos apstākļos, vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīce VialTweeter sniedz nepārprotamu priekšrocību. VialTweeter ļauj intensīvi apstrādāt ar ultraskaņu mazus tilpumus, apstrādājot vairākus slēgtus flakonus sterilos apstākļos. Vienlaicīga paraugu sagatavošana vairākās mēģenēs vienādos apstākļos, kā arī samazināts savstarpējas piesārņošanās, paraugu zuduma un aerosolu veidošanās risks apstrādes laikā slēgtos flakonos padara VialTweeter par uzticamu paraugu sagatavošanas rīku. Proteomikā tas ir īpaši būtiski, strādājot ar vērtīgām nogulsnēm no vairākiem atkārtojumiem vai klīniskiem paraugiem, kad kritiski svarīga ir apstākļu vienādība dažādās mēģenēs.
Uzziniet vairāk par VialTweeter!
Mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP
Laboratorijās ar lielu paraugu apstrādes ražīgumu mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP ļauj izmantot apstrādes ar ultraskaņu priekšrocības darbplūsmās, kurās izmanto plates. UIP400MTP ir mikroplašu un daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce vienmērīgai apstrādei ar ultraskaņu visā standarta platē, tostarp 96 iedobju formātos, un tā uzsver savu piemērotību automatizētai paraugu sagatavošanai tādās jomās kā proteomika, diagnostika un zāļu atklāšana. Platforma ir paredzēta daudzu paraugu vienlaicīgai apstrādei, sniedzot tādas priekšrocības kā samazināts savstarpējas piesārņošanās risks, mazāka darbietilpība, uzlabota paraugu atgūšana un integrācija automatizētās darbplūsmās.
Praktiskajā proteomikā tas nozīmē, ka nogulšņu solubilizācijas, šūnu līzes, ekstrakcijas un saistīto sagatavošanas posmu mērogu var palielināt daudz efektīvāk. Tā vietā, lai apstrādātu paraugus pa vienam, laboratorijas var apstrādāt ar ultraskaņu veselas plates, nodrošinot vienādu ievadītās enerģijas daudzumu. Tas ir vērtīgi ikreiz, kad darbplūsmās paraugu apstrādes ražīgums jāapvieno ar analītisko precizitāti, piemēram, skrīninga pētījumos, kvantitatīvajā proteomikā vai standartizētās paraugu sagatavošanas procedūru ķēdēs. Tādēļ UIP400MTP nav tikai ērtību nodrošinošs rīks; tā ir platforma, kas atbalsta plašāku virzību uz automatizāciju, reproducējamību un uzticamu proteomiku ar lielu paraugu apstrādes ražīgumu.
Uzziniet vairāk par mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP!
VialTweeter dzesēšanas kamerā – kontrolēti procesa parametri apstrādes ar ultraskaņu laikā.
Olbaltumvielu ekstrakcija un solubilizācija ar lielu paraugu apstrādes ražīgumu ar mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP
Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Vācijā radīta kvalitāte
Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces ir labi pazīstamas ar visaugstākajiem kvalitātes un projektēšanas standartiem. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas apstrādes ierīces netraucēti integrēt rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces viegli tiek galā ar skarbiem apstākļiem un prasīgu darba vidi.
Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas apstrādes ierīcēm ar vismodernākajām tehnoloģijām un ērtu lietošanu. Protams, Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces atbilst CE, kā arī UL, CSA un RoHs prasībām.
Literatūra / Atsauces
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
- Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
Biežāk uzdotie jautājumi
Kāpēc ultraskaņas vannas nav piemērotas proteīnu solubilizācijai?
Ultraskaņas vannās kavitācija, kas ir apstrādes ar ultraskaņu darbības pamatā, notiek ļoti nevienmērīgi, tādēļ paraugi tiek pakļauti atšķirīgai apstrādei ar ultraskaņu. Atkarībā no paraugu stobriņu novietojuma ultraskaņas vannā uz katru paraugu iedarbojas atšķirīga intensitāte. Proteomikā būtiska ir salīdzināmība. Ja vienas nogulsnes ir izšķīdušas nepilnīgi, bet citas ir pilnībā resuspendētas, iegūtie dati var atspoguļot paraugu sagatavošanas radītas novirzes, nevis patiesās bioloģiskās atšķirības. Atšķirībā no ultraskaņas vannām bezkontakta ultraskaņas apstrādes ierīces, piemēram, VialTweeter vai mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP, nodrošina standartizētāku apstrādi, ļaujot vairākus paraugus apstrādāt paralēli vienādos ultraskaņas apstākļos, kas var palīdzēt uzlabot rezultātu reproducējamību dažādos eksperimentos. Tas ir īpaši noderīgi biomarķieru pētījumos, salīdzinošajā proteomikā un darbplūsmās ar vairākiem bioloģiskiem vai tehniskiem atkārtojumiem.
Kādas ir proteomikā visbiežāk izmantotās analīzes?
Proteomikā visbiežāk izmanto proteīnu kvantitatīvās noteikšanas analīzes un proteīnu raksturošanas metodes, ko lieto paraugu sagatavošanas un analīzes laikā. Proteīnu koncentrācijas mērīšanai bieži izmanto Bredforda metodi, BCA metodi, Lowry metodi un UV absorbcijas mērījumus pie 280 nm. Plašākās proteomikas darbplūsmās proteīnu daudzuma, tīrības, molekulmasas un identitātes novērtēšanai plaši izmanto arī SDS-PAGE, imūnblotēšanu, ELISA, šķelšanu gelā un uz masspektrometriju balstītas analīzes.
Kas ir Kumasi briljantzilais?
Kumasi briljantzilais ir trifenilmetāna krāsviela, ko plaši izmanto proteīnu pētniecībā proteīnu krāsošanai gelos un kolorimetriskai proteīnu kvantitatīvai noteikšanai. Tā saistās galvenokārt ar bāzisko un aromātisko aminoskābju atlikumiem, īpaši ar arginīnu, un, saistoties ar proteīniem, tās spektrs nobīdās. Šī īpašība padara to noderīgu gan proteīnu vizualizēšanai pēc elektroforēzes, gan proteīnu noteikšanai ar Bredforda metodi.
Kā darbojas Bredforda metode?
Bredforda metodes pamatā ir proteīnu parauga sajaukšana ar Kumasi briljantzilo krāsvielu skābā vidē. Krāsvielai saistoties ar proteīniem, tās absorbcijas maksimums nobīdās no aptuveni 465 nm uz 595 nm, izraisot izmērāmu krāsas maiņu no sarkanbrūnas uz zilu. Absorbcijas pieaugums pie 595 nm noteiktā diapazonā ir proporcionāls proteīnu koncentrācijai, ļaujot to kvantitatīvi noteikt, salīdzinot ar kalibrēšanas līkni, ko parasti sagatavo ar liellopu seruma albumīnu.
Fokusēta paraugu apstrāde ar ultraskaņu daudziedobju platēs
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus mērogiem no laboratorijas līdz rūpnieciskajam mērogam.