Rauga šūnu līze mikroplatēs, izmantojot augstas intensitātes apstrādi ar ultraskaņu
Mikrobiologi un dzīvības zinātņu pētnieki, kuri strādā ar Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, un citām rauga sistēmām, pazīst šo izaicinājumu: rauga šūnas ir izturīgas, reproducējamu līzi var būt grūti panākt, un manuāla paraugu sagraušana ātri kļūst par ierobežojošu faktoru, ja jāveic daudzu celmu, klonu, kultivēšanas apstākļu vai ekspresijas konstruktu skrīnings.
Rauga līze ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu mikrobioloģijai, molekulārajai bioloģijai un proteīnu analītikai
Hielscher mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīces, piemēram, UIP400MTP (400 W) un UIP550MTP (550 W), nodrošina risinājumu mehāniskai rauga šūnu līzei tieši mikroplatēs ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu. Tā vietā, lai paraugus apstrādātu pa vienam ar zondi, ar ultraskaņu var apstrādāt veselas mikroplates vienādos apstākļos. Tas padara rauga līzi ar ultraskaņu ātrāku, reproducējamāku un vieglāk integrējamu mūsdienu mikrobioloģijas, proteīnu ekspresijas, enzīmu skrīninga un omikas darbplūsmās.
Neatkarīgi no tā, vai nepieciešams atbrīvot rekombinantos proteīnus no P. pastoris, sagatavot rauga lizātus enzīmu testiem, sagraut S. cerevisiae proteīnu analīzei vai paralēli veikt desmitiem rauga klonu skrīningu, Hielscher mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīces nodrošina jaudīgu, uz kavitāciju balstītu šūnu sagraušanu ar precīzu procesa kontroli.
Vai nepieciešama reproducējama S. cerevisiae, P. pastoris, vai citu rauga celmu līze mikroplatēs? Pastāstiet mums par plates formātu, parauga tilpumu, šūnu blīvumu un mērķa analītu. Mēs palīdzēsim noteikt piemērotus apstrādes ar ultraskaņu parametrus jūsu darbplūsmai ar UIP400MTP vai UIP550MTP.
Hielscher daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce rauga līzei – paraugu sagatavošana ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu
Kāpēc rauga šūnām nepieciešama efektīva mehāniskā līze
Rauga šūnas ir grūtāk lizēt nekā daudzas baktēriju vai zīdītāju šūnas, jo tās aizsargā stingrs šūnapvalks, kas galvenokārt sastāv no polisaharīdiem, glikāniem, mannoproteīniem un hitīna. Šis šūnapvalks nodrošina mehānisko stabilitāti, taču tas arī ierobežo intracelulāro proteīnu, nukleīnskābju, metabolītu un enzīmu atbrīvošanu.
Tradicionālās rauga līzes metodes ietver mehānisku sagraušanu ar lodītēm, enzimātisku šķelšanu, sasaldēšanas un atkausēšanas ciklus, ķīmisko līzi un apstrādi ar ultraskaņas zondi. Šīs metodes var būt efektīvas, taču tām ir arī ierobežojumi. Sagraušana ar lodītēm var radīt atlūzas un uzsilšanu, enzimātiskā šķelšana var palielināt izmaksas un mainīgumu, savukārt atsevišķu paraugu apstrāde ar ultraskaņas zondi ir laikietilpīga, ja jāapstrādā liels paraugu skaits.
Augstas intensitātes fokusēta ultraskaņas kavitācija pārvar šos ierobežojumus, iedarbojoties uz rauga suspensiju ar spēcīgiem mehāniskiem bīdes spēkiem, spiediena svārstībām un mikroplūsmām. Rezultāts ir ātra šūnapvalku un membrānu sagraušana, uzlabota intracelulārā satura atbrīvošana un ļoti reproducējama paraugu sagatavošana plašu formātā.
Mikroplašu apstrāde ar ultraskaņu paralēlai rauga paraugu sagatavošanai
Hielscher UIP400MTP un UIP550MTP ir paredzētas vienmērīgai mikroplašu, daudziedobju plašu, PCR plašu un piemērotu paraugu statīvu apstrādei ar ultraskaņu. Atšķirībā no apstrādes ar ultraskaņas zondi paraugi nav jāapstrādā atsevišķi. Visa plate tiek pakļauta kontrolētai ultraskaņas enerģijas iedarbībai, tāpēc šī darbplūsma ir ļoti piemērota paralēlai paraugu apstrādei.
Tas ir īpaši noderīgi šādiem uzdevumiem:
- Skrīninga veikšana S. cerevisiae mutantiem vai ekspresijas celmiem
- Lizēt P. pastoris / K. phaffii klonus pēc rekombinanto proteīnu ekspresijas
- Rauga lizātu sagatavošana enzīmu testiem
- Proteīnu ekstrakcija SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS vai aktivitātes testēšanai
- Intracelulāro metabolītu atbrīvošana metabolomikai
- DNS un RNS paraugu sagatavošana pēc piemērotas turpmākās attīrīšanas
- Līzes buferšķīdumu, piedevu un ekstrakcijas apstākļu optimizācija ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu
Kā ultraskaņas kavitācija sagrauj rauga šūnas
Apstrādes ar ultraskaņu laikā fokusēta lielas jaudas ultraskaņa šķidrajā paraugā rada pārmaiņus saspiešanas un retinājuma ciklus. Ja intensitāte ir pietiekama, šīs spiediena svārstības izraisa akustisko kavitāciju. Kavitācijas burbuļi veidojas, svārstās un sabrūk, radot lokālus bīdes spēkus, mikrostrūklas, turbulenci un spēcīgus spiediena gradientus.
Rauga suspensijās šī mehāniskā iedarbība vājina un pārrauj šūnas sienu un šūnas membrānu. Intracelulārās olbaltumvielas, fermenti, nukleīnskābes un metabolīti izdalās līzes buferšķīdumā. Tā kā process ir mehānisks, to var izmantot ar daudzām dažādām buferšķīdumu sistēmām un kombinēt ar proteāžu inhibitoriem, reducētājiem, detergentiem, sāļiem vai saudzīgu enzimātisku priekšapstrādi.
Vispārīgs protokols: rauga šūnu līze mikroplatēs
Tālāk sniegtais protokols ir praktisks sākumpunkts rauga līzei, izmantojot Hielscher UIP400MTP vai UIP550MTP mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci. Parametri jāoptimizē atbilstoši rauga celmam, šūnu blīvumam, mērķa molekulai, buferšķīduma sastāvam, plates veidam un turpmākajai analīzei.
1. Savāciet un nomazgājiet rauga šūnas
Audzējiet Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces vai citu rauga celmu vēlamajos kultivēšanas apstākļos. Savāciet šūnas, centrifugējot, un noņemiet kultivēšanas barotni. Nomazgājiet nogulsnes ar aukstu destilētu ūdeni, PBS vai izvēlēto līzes buferšķīdumu, lai atdalītu atlikušos barotnes komponentus, kas var traucēt turpmākajai analīzei.
Olbaltumvielu ekstrakcijas laikā uzturiet paraugus aukstus un strādājiet ātri. Ja proteāzes var radīt problēmas, iepriekš atdzesējiet visus buferšķīdumus un palīgmateriālus.
2. Resuspendējiet šūnu nogulsnes
Resuspendējiet rauga nogulsnes piemērotā aukstā līzes buferšķīdumā. Efektīvai olbaltumvielu izdalīšanai bieži ir izdevīgs augsts šūnu blīvums. Sākotnēji izmantojiet aptuveni 10–20% w/v mitru šūnu nogulšņu vai blīvu suspensiju, kas atbilst OD600 > 10, atkarībā no analīzes.
Tipisks līzes buferšķīdums rauga olbaltumvielu iegūšanai var saturēt:
- buferšķīduma sistēmu, piemēram, Tris-HCl, fosfātu buferšķīdumu vai HEPES
- sāli, piemēram, NaCl vai KCl
- proteāžu inhibitoru maisījumu
- pēc izvēles pievienotu reducētāju, piemēram, DTT vai β-merkaptoetanolu
- pēc izvēles pievienotu detergentu, piemēram, Triton X-100, NP-40, SDS vai CHAPS, atkarībā no saderības ar turpmākajām procedūrām
- pēc izvēles pievienotus fosfatāžu inhibitorus fosforilēšanas pētījumiem
Grūti lizējamiem rauga celmiem vai ļoti saudzīgai olbaltumvielu ekstrakcijai pirms apstrādes ar ultraskaņu var izmantot īsu priekšapstrādi ar Zymolyase, Lyticase vai citu šūnas sienu šķeļošu fermentu. Šī enzimātiskā priekšapstrāde nav obligāta, taču tā var uzlabot līzes efektivitāti vai samazināt nepieciešamo ultraskaņas intensitāti.
3. Pārnesiet paraugus piemērotā mikroplatē
Iepildiet rauga suspensiju mikroplatē, kas piemērota apstrādei ar ultraskaņu. Bieži priekšroku dod platēm ar apaļdibena iedobēm, jo tās uzlabo paraugu savākšanu un samazina neaktīvās zonas. Lai uzlabotu reproducējamību, visās iedobēs izmantojiet vienādu paraugu tilpumu.
Noslēdziet plati ar piemērotu blīvēšanas paklājiņu vai plēvi, lai novērstu iztvaikošanu, aerosolu veidošanos un savstarpēju piesārņošanos. Pārliecinieties, ka blīvējums ir piemērots izvēlētajai temperatūrai un apstrādes ar ultraskaņu apstākļiem.
Tipiskie darba tilpumi ir atkarīgi no plates formāta un lietojuma. Izplatīti formāti ir 96 iedobju plates, dziļo iedobju plates, PCR plates vai piemēroti mēģeņu statīvi.
4. Nodrošiniet dzesēšanu
Rauga līzei nepieciešama augsta ultraskaņas intensitāte, un mehāniskā sagraušana rada siltumu. Tādēļ temperatūras kontrole ir izšķiroši svarīga, īpaši olbaltumvielu, fermentu, RNS vai fosforilēšanas analīzei.
Izmantojiet piemērotu dzesēšanas paņēmienu, piemēram:
- iepriekš atdzesētu līzes buferšķīdumu
- iepriekš atdzesētas mikroplates
- dzesēšanas pauzes starp apstrādes ar ultraskaņu intervāliem
- ultraskaņas apstrādes platformas ārēju dzesēšanu, ja tā ir piemērojama
Mērķis ir uzturēt paraugu pietiekami aukstu, lai novērstu olbaltumvielu denaturāciju, fermentu inaktivāciju, RNS noārdīšanos un karstuma izraisītu paraugu mainīgumu.
5. Apstrādājiet rauga suspensiju ar ultraskaņu
Ievietojiet noslēgto plati Hielscher UIP400MTP vai UIP550MTP mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīcē un izvēlieties impulsu ultraskaņas apstrādes programmu. Ieteicams izmantot impulsu režīmu, jo tas ļauj veikt mehānisku sagraušanu ieslēguma fāzēs un izkliedēt siltumu izslēguma fāzēs.
Kā sākumpunktu rauga šūnu līzei izmantojiet šādus parametrus:
| Parametrs | Ieteicamais sākotnējais diapazons | Mērķis |
|---|---|---|
| Amplitūda | 60–100% | Augsta kavitācijas intensitāte izturīgām rauga šūnām |
| Impulsu režīms | 10–30 sec IESLĒGTS / 30–60 sec IZSLĒGTS | Efektīva līze ar kontrolētu siltuma uzkrāšanos |
| Kopējais ieslēguma laiks | 5–15 min | Pielāgojiet atbilstoši celmam, blīvumam un mērķa molekulai |
| Temperatūra | Uzturiet paraugus aukstus | Aizsargāt olbaltumvielas, enzīmus, RNS un metabolītus |
| Plates noslēgšana | Ieteicama | Novērš iztvaikošanu, aerosolu veidošanos un savstarpēju kontamināciju |
Ļoti izturīgu rauga suspensiju, blīvas P. pastoris biomasas vai sarežģītas rekombinanto olbaltumvielu ekstrakcijas gadījumā pakāpeniski palieliniet kopējo ieslēguma laiku. Termojutīgām olbaltumvielām vai enzīmu analīzēm izmantojiet īsākus impulsus, ilgākas dzesēšanas pauzes un zemāku sākotnējo amplitūdu.
Rauga līze daudziedobju platēs ar augstu paraugu caurlaidspēju, izmantojot UIP400MTP
6. Dzidriniet lizātu
Pēc apstrādes ar ultraskaņu centrifugējiet mikroplati vai pārnesiet paraugus mēģenēs centrifugēšanai. Atdaliet šūnu atliekas, centrifugējot piemērotā ātrumā un temperatūrā. Savāciet supernatantu turpmākai analīzei.
Atkarībā no pielietojuma lizātu var izmantot:
- olbaltumvielu kvantitatīvai noteikšanai
- enzīmu aktivitātes analīzēm
- SDS-PAGE un Western blot analīzei
- ELISA un imūnanalīzēm
- LC-MS/MS proteomikai
- metabolītu analīzei
- DNS vai RNS attīrīšanai
7. Optimizējiet un dokumentējiet metodi
Lai nodrošinātu reproducējamu rauga līzi, dokumentējiet visus būtiskos parametrus, tostarp celmu, kultivēšanas apstākļus, OD600, mitro šūnu masu, bufera sastāvu, plates veidu, parauga tilpumu, amplitūdu, impulsu ciklu, kopējo ieslēguma laiku, dzesēšanas metodi un parauga beigu temperatūru.
Ja Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīce ir aprīkota ar automātisku datu reģistrēšanu, procesa datus var izmantot dokumentēšanai, metodes izstrādei, mēroga palielināšanai un kvalitātes kontrolei.
Ieteikumi rauga līzes optimizēšanai
Lai panāktu maksimālu olbaltumvielu izdalīšanos, izmantojiet blīvas rauga suspensijas, augstu ultraskaņas intensitāti un pietiekamu kopējo ieslēguma laiku. Jutīgām olbaltumvielām samaziniet amplitūdu, pagariniet dzesēšanas pauzes un uzturiet plati aukstu visas apstrādes laikā.
Ja līze ir nepilnīga, pakāpeniski palieliniet apstrādes ar ultraskaņu laiku, izmēģiniet enzimātisku priekšapstrādi, samaziniet parauga viskozitāti vai optimizējiet buferi. Ja olbaltumvielas noārdās vai zaudē aktivitāti, uzlabojiet dzesēšanu, saīsiniet ieslēguma intervālus, pievienojiet inhibitorus un pārbaudiet, vai detergentu sistēma ir saderīga ar mērķa olbaltumvielu.
Tā kā rauga celmi būtiski atšķiras pēc šūnapvalka struktūras, augšanas fāzes, ekspresijas sistēmas un biomasas blīvuma, ieteicama neliela optimizācijas matrica. Piemēram, pārbaudiet trīs amplitūdas, divus impulsu ciklus un divus kopējos ieslēguma laikus, pēc tam novērtējiet līzes efektivitāti un olbaltumvielu integritāti.
Neatkarīgi no tā, vai apstrādājat dažas analīžu plates vai veicat rauga skrīningu ar augstu paraugu caurlaidspēju, Hielscher var palīdzēt izvēlēties piemērotu mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci un izstrādāt uzticamu līzes protokolu. Sazinieties ar mums un norādiet savu rauga celmu, darba plūsmu un prasības attiecībā uz paraugu caurlaidspēju!
Hielscher mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīču priekšrocības rauga līzei
Hielscher mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīces ir ideāli piemērotas laboratorijām, kurām nepieciešama reproducējama līze daudzos paraugos. Tās novērš lēno paraugu apstrādi pa vienam, kas nepieciešama ultraskaņas apstrādē ar zondi, un samazina mainīgumu, ko rada manuāla zondes pozicionēšana, iegremdēšanas dziļums un atšķirības atsevišķu paraugu apstrādē.
Galvenās priekšrocības:
- Apstrāde ar augstu paraugu caurlaidspēju: Vienlaikus apstrādājiet ar ultraskaņu daudzus rauga paraugus mikroplatēs vai saderīgos paraugu statīvos.
- Reproducējami apstākļi: Vienādi apstrādes ar ultraskaņu apstākļi visās iedobēs nodrošina vienmērīgus, salīdzināmus līzes rezultātus.
- Nav zondes izraisītas savstarpējas kontaminācijas: Apstrādes ar ultraskaņu laikā paraugi paliek noslēgti, samazinot materiāla pārnesi starp paraugiem un tīrīšanas darbību skaitu.
- Piemērotas izturīgām šūnām: Augstas intensitātes ultraskaņa veicina rauga šūnapvalku sagraušanu.
- Efektīva darbplūsma: Ideāli piemērota celmu, klonu, ekspresijas apstākļu un līzes buferšķīdumu skrīningam.
- Efektīva darbplūsma: Programmējami iestatījumi, automatizēta datu reģistrēšana un piemērotība laboratorijas automatizācijai.
Lietojums rauga biotehnoloģijā un dzīvības zinātņu pētījumos
Rauga šūnu līze ar ultraskaņu mikroplatēs nodrošina daudzas pētniecības un skrīninga darbplūsmas. Rekombinanto olbaltumvielu ekspresijas procesā P. pastoris un S. cerevisiae klonus var lizēt paralēli, lai salīdzinātu ekspresijas līmeņus vai enzīmu aktivitāti. Sistēmbioloģijā un omikas pētījumos standartizēta līze uzlabo rezultātu salīdzināmību dažādos apstākļos. Mikrobioloģijā apstrāde ar ultraskaņu ļauj ātri sagatavot lizātus no vairākiem celmiem, kas audzēti dažādos barotnes apstākļos vai pakļauti dažādām stresa iedarbībām.
Tipiskas lietojuma jomas ir:
- rauga olbaltumvielu ekstrakcija
- rekombinanto olbaltumvielu skrīnings
- enzīmu aktivitātes skrīnings
- klonu atlase pēc transformācijas
- fermentācijas optimizācija
- paraugu sagatavošana proteomikai
- paraugu sagatavošana metabolomikai
- šūnu sieniņu sagraušanas pētījumi
- mikrobioloģiskās analīzes ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu
Uzticama rauga šūnu līze sākas ar kontrolētu apstrādi ar ultraskaņu
Palielinoties paraugu skaitam, rauga šūnu līze var kļūt sarežģīta, taču Hielscher mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīces padara šo procesu ātrāku, tīrāku un reproducējamāku. UIP400MTP un UIP550MTP ļauj pētniekiem apstrādāt veselas plates noteiktos ultraskaņas apstākļos, palielinot paraugu apstrādes ražīgumu un vienlaikus samazinot manuālo darbu.
Mikrobiologiem, molekulārbiologiem, olbaltumvielu pētniekiem un biotehnoloģiju laboratorijām mikroplašu apstrāde ar ultraskaņu ir jaudīgs līdzeklis efektīvai un reproducējamai rauga intracelulāro komponentu atbrīvošanai.
Biežāk uzdotie jautājumi par rauga šūnu līzi, apstrādājot mikroplates ar ultraskaņu
Vai rauga šūnas var lizēt ar ultraskaņu?
Jā. Rauga šūnas, piemēram, Saccharomyces cerevisiae un Pichia pastoris, var lizēt ar augstas intensitātes ultraskaņu. Ultraskaņas kavitācija rada spēcīgus mehāniskus bīdes spēkus, kas sagrauj rauga šūnu sieniņu un membrānu, atbrīvojot olbaltumvielas, enzīmus, nukleīnskābes un metabolītus.
Kāpēc rauga šūnas ir grūtāk lizēt nekā baktēriju šūnas?
Rauga šūnām ir bieza un mehāniski izturīga šūnas sieniņa, kas sastāv galvenokārt no glikāniem, mannoproteīniem un hitīna. Šī stingrā struktūra padara rauga šūnas grūtāk sagraujamas nekā daudzas baktēriju vai zīdītāju šūnas. Tāpēc rauga šūnu līzei parasti nepieciešama augstāka intensitāte, ilgāka apstrāde vai pēc izvēles veicama iepriekšēja enzimātiska apstrāde.
Kuras Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces ir piemērotas rauga šūnu līzei mikroplatēs?
Hielscher UIP400MTP un UIP550MTP ir piemērotas rauga šūnu līzei mikroplatēs ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu. UIP400MTP ir ideāli piemērota ikdienas paralēlai paraugu sagatavošanai, savukārt UIP550MTP nodrošina lielāku ultraskaņas jaudu sarežģītiem līzes uzdevumiem, blīvām suspensijām un izturīgiem rauga celmiem.
Vai Pichia pastoris var lizēt mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīcē?
Jā. Pichia pastoris, kas pazīstama arī kā Komagataella phaffii, var lizēt, apstrādājot mikroplates ar augstas intensitātes ultraskaņu. Tā kā P. pastoris var veidot blīvu biomasu un tai ir izturīga šūnas sieniņa, ieteicams optimizēt amplitūdu, impulsu ciklu, dzesēšanu un kopējo apstrādes laiku ar ultraskaņu.
Kādi ir tipiski ultraskaņas apstrādes parametri rauga šūnu līzei?
Noderīgs sākuma diapazons ir 50–80% amplitūda, darbība impulsu režīmā, piemēram, 10–30 sekundes ieslēgtā stāvoklī (ON) un 30–60 sekundes izslēgtā stāvoklī (OFF), un 5–15 minūtes ilgs kopējais ieslēguma laiks. Precīzie parametri ir atkarīgi no rauga celma, šūnu blīvuma, parauga tilpuma, plates veida, buferšķīduma un mērķa molekulas.
Kāpēc rauga šūnu līze jāveic impulsu režīmā?
Impulsu režīms samazina siltuma uzkrāšanos apstrādes laikā ar ultraskaņu. Ieslēguma fāzē (ON) ultraskaņas kavitācija sagrauj šūnas. Izslēguma fāzē (OFF) paraugs var atdzist. Tas ir svarīgi, jo pārmērīgs karstums var denaturēt olbaltumvielas, samazināt enzīmu aktivitāti, noārdīt RNS un pasliktināt reproducējamību.
Vai pirms rauga šūnu apstrādes ar ultraskaņu nepieciešama iepriekšēja enzimātiska apstrāde?
Enzimātiska priekšapstrāde ne vienmēr ir nepieciešama, taču tā var uzlabot līzes efektivitāti. Tādi enzīmi kā Zymolyase vai Lyticase daļēji noārda rauga šūnapvalku un var samazināt pilnīgai līzei nepieciešamo ultraskaņas intensitāti vai apstrādes laiku. Tas var būt noderīgi jutīgu olbaltumvielu vai grūti lizējamu celmu gadījumā.
Kā novērst pārkaršanu rauga apstrādes laikā ar ultraskaņu?
Izmantojiet iepriekš atdzesētus buferšķīdumus, impulsu režīmu, dzesēšanas pauzes un dzesējamu plates sistēmu. Turiet mikroplati noslēgtu un, ja iespējams, uzraugiet temperatūru. Jutīgu olbaltumvielu gadījumā izmantojiet īsākus ON intervālus, garākus OFF intervālus un apstrādājiet paraugus aukstumā.
Vai apstrāde ar ultraskaņu mikroplatēs var aizstāt mehānisku sagraušanu ar lodītēm rauga līzei?
Daudzās darbplūsmās – jā. Apstrāde ar ultraskaņu mikroplatēs var aizstāt mehānisku sagraušanu ar lodītēm, ja nepieciešama tīra, reproducējama un paralēla līze. Tā ļauj izvairīties no darbībām ar lodītēm, samazina patēriņa materiālu izmantošanas sarežģītību un vienkāršo automatizāciju. Tomēr katrs lietojums ir jāvalidē, salīdzinot līzes iznākumu, olbaltumvielu integritāti un analīzes veiktspēju.
Vai apstrāde ar ultraskaņu mikroplatēs ir piemērota olbaltumvielu ekstrakcijai no rauga?
Jā. Apstrāde ar ultraskaņu mikroplatēs ir labi piemērota olbaltumvielu ekstrakcijai no rauga, īpaši tad, ja jāsalīdzina daudzi kloni vai kultivēšanas apstākļi. Proteāžu inhibitori, auksti buferšķīdumi un kontrolēti impulsu iestatījumi palīdz saglabāt olbaltumvielu kvalitāti.
Vai vienu un to pašu metodi var izmantot DNS, RNS un olbaltumvielu ekstrakcijai?
Var izmantot to pašu apstrādes ar ultraskaņu pamatprincipu, taču buferšķīdums un procesa apstākļi jāpielāgo mērķa molekulai. Olbaltumvielu apstrādes darbplūsmās nepieciešama proteāžu inhibēšana un temperatūras kontrole. RNS apstrādes darbplūsmās nepieciešams darbs apstākļos bez RNāzēm un intensīva dzesēšana. DNS apstrādes darbplūsmās var būt nepieciešami atšķirīgi līzes un attīrīšanas apstākļi atkarībā no tā, vai vēlama neskarta genomiskā DNS vai fragmentēta DNS.
Kāda veida plate jāizmanto rauga līzei?
Izmantojiet apstrādei ar ultraskaņu piemērotu mikroplati vai dziļo iedobju plati ar piemērotu noslēgumu. Plates ar noapaļotu iedobju dibenu bieži ir noderīgas darbam ar suspensijām. Platei jāiztur izvēlētie apstrādes ar ultraskaņu apstākļi, parauga temperatūra un centrifugēšanas posmi.
Kā noteikt, vai rauga līze ir pilnīga?
Līzes efektivitāti var pārbaudīt ar mikroskopiju, pēc olbaltumvielu iznākuma, enzīmu aktivitātes, viskozitātes samazināšanās, SDS-PAGE analīzes, DNS/RNS iznākuma vai salīdzinājumā ar zināmu līzes metodi. Izstrādājot metodi, novērtējiet gan atbrīvotās mērķa molekulas iznākumu, gan kvalitāti.
UIP400MTP vai UIP550MTP: kuru mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci izvēlēties?
UIP400MTP ir jaudīga mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce ikdienas paraugu sagatavošanai ar augstu ražību, tostarp rauga līzei, olbaltumvielu ekstrakcijai, DNS fragmentēšanai ar bīdes spēkiem, bioplēves atdalīšanai un paraugu sagatavošanai analīzēm. Tā ir piemērota laboratorijām, kurām nepieciešama reproducējama apstrāde ar ultraskaņu standarta formāta platēs.
UIP550MTP nodrošina lielāku ultraskaņas jaudu un ir ieteicama gadījumos, kad sarežģītākiem lietojumiem nepieciešama lielāka akustiskā intensitāte, īsāks apstrādes laiks, lielāks paraugu materiāla daudzums vai intensīvāki sagraušanas apstākļi. Rauga līzei UIP550MTP ir īpaši noderīga blīvas biomasas, grūti lizējamu celmu, lielāku darba tilpumu un ekspresijas skrīninga ar augstu ražību gadījumā.
Vai rauga līzi ar ultraskaņu mikroplatēs var automatizēt?
Jā. Apstrāde ar ultraskaņu mikroplatēs ir labi piemērota automatizētām laboratorijas darbplūsmām, jo paraugi paliek platēs. Tas veicina integrāciju ar pipetēšanas sistēmām, darbībām ar platēm, centrifugēšanu, paraugu sagatavošanu analīzēm un skrīninga darbplūsmām ar augstu ražību.
Literatūra / Atsauces
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.
