Rauga šūnu līze mikroplāksnēs, izmantojot augstas intensitātes ultraskaņas apstrādi

Mikrobiologi un dabaszinātņu pētnieki, kas strādā ar saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, un citu rauga sistēmu pētniekiem šis izaicinājums ir labi pazīstams: rauga šūnas ir izturīgas, to reproducējamu līzi var būt grūti panākt, un manuāla paraugu sadalīšana ātri kļūst par šauru vietu, ja ir jāpārbauda daudzi celmi, kloni, kultivēšanas apstākļi vai ekspresijas konstrukti.

Augstas caurlaidspējas rauga šūnu līze mikrobioloģijā, molekulārajā bioloģijā un proteīnu analītikā

Hielscher mikropateņu ultraskaņas iekārtas, piemēram, UIP400MTP (400 W) un UIP550MTP (550 W), nodrošina augstas caurlaidspējas risinājumu rauga šūnu mehāniskai līzei tieši mikropateņos. Tā vietā, lai paraugus apstrādātu pa vienam ar zondi, visas mikroplates var apstrādāt ar ultraskaņu vienādos apstākļos. Tas padara rauga šūnu ultraskaņas līzi ātrāku, reproducējamāku un vieglāk integrējamu mūsdienu mikrobioloģijas, proteīnu ekspresijas, fermentu skrīninga un omikas darba plūsmās.
Neatkarīgi no tā, vai jums ir nepieciešams izdalīt rekombinantos proteīnus no P. pastoris, sagatavot rauga lizātus enzīmu analīzēm, sadalīt S. cerevisiae šūnas proteīnu analīzei vai vienlaikus pārbaudīt desmitiem rauga klonu, Hielscher mikroplākšņu ultraskaņas iekārtas nodrošina spēcīgu, uz kavitāciju balstītu šūnu sadalīšanu ar precīzu procesa kontroli.

Kāpēc rauga šūnām nepieciešama efektīva mehāniska līze

Rauga šūnas ir grūtāk lizēt nekā daudzas baktēriju vai zīdītāju šūnas, jo tās aizsargā stingra šūnu siena, kas sastāv galvenokārt no polisaharīdiem, glikāniem, manoproteīniem un hitīna. Šī šūnu siena nodrošina mehānisko stabilitāti, taču tā arī ierobežo intracelulāro proteīnu, nukleīnskābju, metabolītu un fermentu izdalīšanos.
Parastās rauga līzes metodes ietver granulu sasmalcināšanu, fermentatīvo hidrolīzi, sasaldēšanas–atkausēšanas ciklus, ķīmisko līzi un zondes tipa ultraskaņas apstrādi. Šīs metodes var būt efektīvas, taču tām ir arī ierobežojumi. Sfēru sasmalcināšana var radīt atliekas un pārkaršanu, fermentatīvā hidrolīze var palielināt izmaksas un variabilitāti, savukārt viena parauga ultraskaņošana ar zondi ir laikietilpīga, ja jāapstrādā liels paraugu skaits.
Augstas intensitātes, fokusa ultraskaņas kavitācija pārvar šos ierobežojumus, uz rauga suspensiju iedarbojoties ar intensīvām mehāniskām šķēres spēkām, spiediena svārstībām un mikrostrāvām. Rezultātā notiek strauja šūnu sienu un membrānu sabrukšana, uzlabota vielu atbrīvošanās šūnu iekšienē un ļoti reproducējama paraugu sagatavošana plāksnīšu formātā.

Mikroplates ultraskaņošana rauga paraugu paralēlai sagatavošanai

Hielscher UIP400MTP un UIP550MTP ir paredzēti mikroplākšņu, daudzkameru plākšņu, PCR plākšņu un piemērotu paraugu turētāju vienmērīgai ultraskaņas apstrādei. Atšķirībā no ultraskaņas apstrādes ar zondi paraugus nav nepieciešams apstrādāt atsevišķi. Visa plāksne tiek pakļauta kontrolētai ultraskaņas enerģijai, tādējādi šis darba process ir īpaši piemērots paraugu paralēlai apstrādei.

Tas ir īpaši noderīgi:

• Skrīninga Maizes raugs mutanti vai ekspresijas celmi
• Līze Tēvs, gans / K. phaffii kloni pēc rekombinantā proteīna ekspresijas
• Rauga lizātu sagatavošana enzīmu analīzēm
• Olbaltumvielu ekstrakcija SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS vai aktivitātes noteikšanai
• Intracelulāro metabolītu atbrīvošana metabolomikas vajadzībām
• DNS un RNS paraugu sagatavošana pēc atbilstošas turpmākas attīrīšanas
• Līzes buferu, piedevu un ekstrakcijas apstākļu optimizācija ar augstu caurlaidspēju

Kā ultraskaņas kavitācija izjauc rauga šūnas

Ultraskaņas apstrādes laikā fokusa veidā virzīts lieljaudas ultraskaņas vilnis šķidrajā paraugā rada mainīgus saspiešanas un retināšanas ciklus. Pie pietiekamas intensitātes šīs spiediena svārstības izraisa akustisko kavitāciju. Kavitācijas burbuļi veidojas, svārstās un sabrūk, radot lokalizētus šķērsspēkus, mikrostrūklas, turbulenci un spēcīgus spiediena gradientus.
Rauga suspensijās šie mehāniskie efekti vājina un pārrauj šūnu sienu un šūnu membrānu. Šūnu iekšējās olbaltumvielas, fermenti, nukleīnskābes un metabolīti tiek atbrīvoti līzes buferā. Tā kā process ir mehānisks, to var izmantot ar daudzām dažādām buferu sistēmām un kombinēt ar proteāžu inhibitoriem, reducētājiem, detergentiem, sāļiem vai vieglu fermentatīvu priekšapstrādi.

Vispārīgais protokols: rauga šūnu līze mikroplāksnēs

Šis protokols sniedz praktisku sākumpunktu rauga šūnu līzes veikšanai, izmantojot Hielscher UIP400MTP vai UIP550MTP mikroplates ultraskaņas iekārtu. Parametri jāoptimizē atbilstoši rauga celmam, šūnu blīvumam, mērķmolekulai, bufera sastāvam, plāksnes tipam un turpmākajai analīzei.

1. Rauga šūnu ievākšana un mazgāšana

Audzējiet Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces vai citu rauga celmu vēlamajos kultivēšanas apstākļos. Savāciet šūnas, izmantojot centrifugēšanu, un nolejiet kultivēšanas barotni. Nomazgājiet nogulsnes ar aukstu destilētu ūdeni, PBS vai izvēlēto līzes buferu, lai noņemtu barotnes atliekas, kas var traucēt turpmāko analīzi.
Lai ekstrahētu olbaltumvielas, paraugus jāuzglabā aukstumā un darbs jāveic ātri. Ja pastāv proteāžu risks, visus buferus un palīgmateriālus iepriekš jāatdzesē.

2. Atkārtoti suspendējiet šūnu nogulsnes

Rauga nogulsnes atkārtoti suspendējiet piemērotā aukstā līzes buferā. Lai nodrošinātu efektīvu proteīnu atbrīvošanu, bieži vien ir vēlama augsta šūnu blīvums. Kā sākuma punktu izmantojiet aptuveni 10–20 % (masas/tilpuma) mitru šūnu nogulsni vai blīvu suspensiju, kas atbilst OD₆₀₀ > 10, atkarībā no analīzes.

Tipisks rauga proteīnu līzes buferis var saturēt:

• buferu sistēma, piemēram, Tris-HCl, fosfāta buferis vai HEPES
• sāls, piemēram, NaCl vai KCl
• Proteāzes inhibitoru kokteilis
• pēc izvēles reducējošs līdzeklis, piemēram, DTT vai β-merkaptetanols
• pēc izvēles mazgāšanas līdzeklis, piemēram, Triton X-100, NP-40, SDS vai CHAPS, atkarībā no saderības ar turpmākajiem procesiem
• fakultatīvi fosfatāzes inhibitori fosforilācijas pētījumiem

Grūti apstrādājamo rauga celmu gadījumā vai ļoti saudzīgai proteīnu ekstrakcijai pirms ultraskaņas apstrādes var veikt īsu priekšapstrādi ar Zymolyase, Lyticase vai citu šūnu sienu noārdījošu fermentu. Šī fermentatīvā priekšapstrāde nav obligāta, taču tā var uzlabot līzes efektivitāti vai samazināt nepieciešamo ultraskaņas intensitāti.

3. Pārvietojiet paraugus uz piemērotu mikroplati

Ielejiet rauga suspensiju ultraskaņas apstrādei piemērotā mikroplatē. Bieži vien priekšroka tiek dota apaļgrīdas platēm, jo tās uzlabo paraugu savākšanu un samazina „mirušās zonas”. Lai uzlabotu reproducējamību, visās bedrītēs izmantojiet vienādus paraugu tilpumus.
Noslēdziet plāksni ar piemērotu noslēgšanas paklājiņu vai plēvi, lai novērstu iztvaikošanu, aerosola veidošanos un savstarpējo piesārņojumu. Pārliecinieties, ka noslēgums ir saderīgs ar izvēlētajiem temperatūras un ultraskaņas apstrādes apstākļiem.
Tipiskie darba tilpumi ir atkarīgi no plāksnes formāta un pielietojuma. Bieži sastopamie formāti ir 96-bedrīšu plāksnes, dziļo bedrīšu plāksnes, PCR plāksnes vai piemēroti mēģenu turētāji.

4. Dzesēšanas sistēmas uzstādīšana

Rauga šūnu līzei nepieciešama augsta ultraskaņas intensitāte, un mehāniska sadalīšanās rada siltumu. Tāpēc temperatūras kontrole ir ļoti svarīga, jo īpaši proteīnu, enzīmu, RNS vai fosforilācijas analīzē.

Izmantojiet atbilstošu dzesēšanas stratēģiju, piemēram:

• iepriekš atdzesēts līzes buferis
• iepriekš atdzesētas mikroplates
• atdzesēšanas pārtraukumi starp ultraskaņas apstrādes intervāliem
• sonikācijas platformas ārējā dzesēšana, ja nepieciešams

Mērķis ir saglabāt paraugu pietiekami aukstu, lai novērstu proteīnu denaturāciju, fermentu inaktivāciju, RNS noārdīšanos un siltuma izraisītas parauga variācijas.

5. Rauga suspensiju apstrādājiet ar ultraskaņu

Ievietojiet noslēgto plāksni Hielscher UIP400MTP vai UIP550MTP mikroplāksņu ultraskaņas apstrādes iekārtā un izvēlieties impulsu ultraskaņas apstrādes programmu. Impulsu režīms ir ieteicams, jo tas nodrošina mehānisku sadalīšanu „ON” fāzēs un siltuma izkliedēšanu „OFF” fāzēs.
Kā sākumpunkts rauga šūnu līzei:

Ja ir darīšana ar ļoti izturīgām rauga suspensijām, blīvu P. pastoris biomasu vai ja rekombinantā proteīna ekstrakcija ir apgrūtināta, pakāpeniski palieliniet kumulatīvo ieslēgšanas laiku. Ja tiek izmantoti siltumjutīgi proteīni vai enzīmu analīzes, izmantojiet īsākus impulsus, garākas atdzišanas pauzes un zemāku sākotnējo amplitūdu.

Rauga šūnu līze ar augstu caurlaidspēju daudzkameru plāksnēs, izmantojot UIP400MTP

6. Noskaidrot lizātu

Pēc ultraskaņas apstrādes mikroplati centrifugējiet vai pārnesiet paraugus uz mēģenēm centrifugēšanai. Noņemiet šūnu atliekas, centrifugējot ar piemērotu ātrumu un temperatūru. Savāciet supernatantu turpmākai analīzei.

Atkarībā no pielietojuma lizātu var izmantot:

• Olbaltumvielu kvantitatīvā noteikšana
• enzīmu aktivitātes noteikšanas metodes
• SDS-PAGE un Western blotting
• ELISA un imūnanalīzes
• LC-MS/MS proteomika
• metabolītu analīze
• DNS vai RNS attīrīšana

7. Metodes optimizēšana un dokumentēšana

Lai nodrošinātu rauga šūnu līzes procesa atkārtojamību, reģistrējiet visus būtiskos parametrus, tostarp celmu, kultivēšanas apstākļus un optisko blīvumu (OD)₆₀₀, mitrās šūnu masas, bufera sastāva, plāksnes tipa, parauga tilpuma, amplitūdas, impulsa cikla, kumulatīvā ieslēgšanās laika, dzesēšanas metodes un parauga galīgās temperatūras.
Ja Hielscher ultraskaņas iekārta ir aprīkota ar automātisko datu reģistrēšanu, procesa datus var izmantot dokumentācijai, metožu izstrādei, ražošanas mēroga palielināšanai un kvalitātes kontrolei.

Padomi rauga līzes optimizācijai

Lai panāktu maksimālu proteīnu atbrīvošanos, izmantojiet blīvas rauga suspensijas, augstu ultraskaņas intensitāti un pietiekamu kopējo darbības laiku. Ja strādājat ar jutīgiem proteīniem, samaziniet amplitūdu, pagariniet dzesēšanas pārtraukumus un visā procesa laikā uzturiet plati aukstu.
Ja līze nav pilnīga, pakāpeniski palieliniet ultraskaņošanas laiku, izmēģiniet fermentatīvo priekšapstrādi, samaziniet parauga viskozitāti vai optimizējiet buferu. Ja proteīni sadalās vai zaudē aktivitāti, uzlabojiet dzesēšanu, saīsiniet ieslēgšanas intervālus, pievienojiet inhibitorus un pārliecinieties, ka detergentu sistēma ir saderīga ar mērķa proteīnu.
Tā kā rauga celmi būtiski atšķiras pēc šūnu sienu struktūras, augšanas fāzes, ekspresijas sistēmas un biomasas blīvuma, ieteicams izmantot īsu optimizācijas matricu. Piemēram, pārbaudiet trīs amplitūdas, divus impulsu ciklus un divus kopējos ieslēgšanās laikus, pēc tam novērtējiet līzes efektivitāti un proteīnu integritāti.

Hielscher mikroplākšņu ultraskaņas iekārtu priekšrocības rauga šūnu līzes procesā

Hielscher mikropaliktņu ultraskaņas iekārtas ir ideāli piemērotas laboratorijām, kurām nepieciešama reproducējama šūnu līze daudzos paraugos. Tās novērš lēno, pa vienam paraugam notiekošo apstrādi, kas raksturīga ultraskaņas zondes izmantošanai, kā arī samazina variabilitāti, ko izraisa zondes manuālā novietošana, iegremdēšanas dziļums un atšķirības paraugu apstrādē.

Galvenās priekšrocības:

• Augstas caurlaidspējas apstrāde: Vienlaikus apstrādājiet ar ultraskaņu daudzus rauga paraugus mikroplāksnēs vai ar tām saderīgās paraugu turētājplāksnēs.
• Atkārtojami apstākļi: Vienādi ultraskaņas apstrādes apstākļi visās akās, lai nodrošinātu vienveidīgus un salīdzināmus līzes rezultātus.
• Nav zondes savstarpējās piesārņošanas: Paraugi ultraskaņas apstrādes laikā paliek noslēgti, tādējādi samazinot pārnesumu un tīrīšanas darbību skaitu.
• Piemērots izturīgām šūnām: Augstas intensitātes ultraskaņa veicina rauga šūnu sienu sabrukšanu.
• Efektīva darba plūsma: Ideāli piemērots celmu, klonu, ekspresijas apstākļu un līzes buferu skrīningam.
• Efektīva darba plūsma: Programmējami iestatījumi, automatizēta datu reģistrēšana un piemērots laboratorijas automatizācijai.

Piemēri rauga biotehnoloģijā un dzīvības zinātņu pētniecībā

Rauga šūnu līze ar ultraskaņu mikroplātnēs atbalsta daudzus pētniecības un skrīninga darba procesus. Rekombinantās olbaltumvielas ekspresijas gadījumā P. pastoris un S. cerevisiae klonus var lizēt paralēli, lai salīdzinātu ekspresijas līmeņus vai fermentu aktivitāti. Sistēmu bioloģijā un omikās standartizēta līze uzlabo salīdzināmību dažādos apstākļos. Mikrobioloģijā ultraskaņas apstrāde nodrošina ātru lizātu sagatavošanu no dažādiem celmiem, barotņu apstākļiem vai stresa apstrādēm.
Tipiskās pielietojuma jomas ietver:

• rauga proteīnu ekstrakcija
• rekombinantā proteīna skrīnings
• enzīmu aktivitātes skrīnings
• klonu atlase pēc transformācijas
• raudzēšanas optimizācija
• proteomikas paraugu sagatavošana
• metabolomikas paraugu sagatavošana
• pētījumi par šūnu sienu bojājumiem
• mikrobioloģiskie testi ar augstu caurlaidspēju

Uzticama rauga līze sākas ar kontrolētu ultraskaņas apstrādi

Rauga līze var būt sarežģīta, ja paraugu skaits palielinās, taču Hielscher mikroplākšņu ultraskaņas iekārtas padara šo procesu ātrāku, tīrāku un reproducējamāku. Iekārtas UIP400MTP un UIP550MTP ļauj pētniekiem apstrādāt pilnas plāksnes noteiktos ultraskaņas apstākļos, uzlabojot caurlaidspēju un vienlaikus samazinot manuālo darbu apjomu.
Mikrobiologiem, molekulārajiem biologiem, proteīnu pētniekiem un biotehnoloģijas laboratorijām mikroplākšņu ultraskaņošana ir efektīvs līdzeklis, lai efektīvi un reproducējami atbrīvotu rauga intracelulāros komponentus.

Literatūra / Atsauces