Ultraskaņas DNS bīdīšana

DNS un RNS bīdīšanas laikā garas DNS molekulas tiek sadalītas mazākos fragmentos, kas ir svarīgs solis paraugu sagatavošanā nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS) bibliotēku izveidei. Ultraskaņas DNS bīdīšana izmanto akustiskās kavitācijas spēkus, lai sadalītu DNS vai RNS fragmentos, kuru garums svārstās no 100 bp līdz 5 kb. Šī metode ļauj precīzi kontrolēt fragmentu izmēru, atvieglojot pielāgošanu vēlamajam DNS garumam optimāliem sekvencēšanas rezultātiem.

DNS bīdīšana, izmantojot ultraskaņu

Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus ultraskaņas risinājumus DNS, RNS un hromatīna bīdīšanai. Izvēlieties starp zondes tipa ultraskaņas ierīcēm (piemēram, UP100H) tiešai apstrādei ar ultraskaņu, izmantojot mikrotipu, vai izmantojiet VialTweeeter vai ultraskaņas cuphorn netiešai dažādu paraugu DNS sagatavošanai vienlaikus. Hielscher piedāvā ideālu ierīci, ņemot vērā jūsu vajadzības: vai jums ir 1 vai līdz 10 paraugiem, tilpumi no mikrolitriem līdz litru tilpumiem – Hielscher sonikatori atbildīs jūsu prasībām, lai sagatavotu DNS, RNS un hromatīna fragmentus pareizajā garumā. Atkārtojamība, viegla darbība un precīza kontrole ļauj izveidot uzticamu bibliotēku nākamās paaudzes sekvencēšanai.
Atšķirībā no fermentatīvas DNS fragmentācijas, ultraskaņas bīdīšana pielieto tīrus mehāniskos bīdes spēkus, nepievienojot nekādas ķīmiskas vielas. Precīzi iestatot procesa parametrus, ultraskaņas bīdīšana rada augstas molekulmasas DNS fragmentus (plasmīdu un genomisko DNS).
Purificētas nukleīnskābes var tikt pastiprinātas pirms vai pēc fragmentācijas soļa.
Sonifikācijas parametrus (jaudu, impulsu ciklu / sprādzienus, laiku un temperatūru) var droši kontrolēt, izmantojot programmatūras iestatījumus.

Protokoli ultraskaņas DNS bīdīšanai

Hromatīna imūnprecipitācijas analīzei

Īsumā, šūnas tika izplatītas 60 mm diametra traukos (400 000 uz trauku) un transfectētas ar RhoA siRNS (kā aprakstīts); pēc 72 h tās tika inkubētas ar formaldehīdu (galīgā koncentrācija, 1%) 10 min 37°C, lai savienotu proteīnus ar DNS. Savienojuma reakcija tika apturēta, pievienojot vienu desmito daļu tilpuma no 1,25 mol/L glicīna, iegūstot 125 mmol/L galīgo koncentrāciju. Šūnas tika mazgātas divas reizes ar ledussauktu PBS, resuspendētas radioimūnprecipitācijas analīzes buferī [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksicolāts, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], kas saturēja 1 mmol/L fenilmetilsulfonilfluorīdu, 1 Ag/mL aprotinīnu un 1 Ag/mL pepstatīnu A, un tika turētas uz ledus 30 min. Tad šūnu lizāti tika sonificēti uz ledus ar Hielscher UP200S ultraskaņas sonikatoru (3 x 40 s, amplitūda 40%, cikls 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), līdz savienotie hromatīni tika bīdīti, lai iegūtu DNS fragmentus no 200 līdz 1 000 bp. Viena desmitā daļa no visa lizāta tika izmantota, lai kvantificētu DNS daudzumu dažādos paraugos, un tika uzskatīta par “kopējo ievades DNS”. Supernatanti tika inkubēti ar laša spermatozoīdu DNS/proteīna agaroza-50% suspensiju, lai samazinātu nespecifisko fonu. Imūnprecipitācija tika veikta naktī 4°C ar 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) vai bez antivielas (negatīvā kontrole). Šie supernatanti tika papildināti ar 5 mol/L NaCl un karsēti naktī 65°C, lai atgrieztu proteīna-DNS savienojumus. Imūnkompleksi tika tālāk apstrādāti ar DNāzes- un RNāzes nesaturošu proteināzi K, un DNS tika purificēta, izmantojot fenola/hloroforma ekstrakciju un etanola nogulsnēšanu. PCR tika veikta ar specifiskiem praimeriem, kas atbilst sekvencei cilvēka iNOS gēna promotoru reģionā (p1 praimeris: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 praimeris: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP ekspresijas pētījumi

Izsaukšanas pētījumiem rekombinanto celmu L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Vācija) ar EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) gēnu, hromosomāli ssu integrētu, audzēja dažādās barotnēs, kā aprakstīts iepriekš, un papildus bagātināja ar 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Vācija). Audzēšanas laikā ņēma 1 ml paraugus, centrifugēja (2000 × g, 20°C, 10 min) un mazgāja ar 0,9% NaCl šķīdumu. Nogulsnīti atkārtoti suspendēja buferšķīdumā (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) un sadalīja ar ultraskaņas apstrādi, izmantojot ultraskaņas procesoru UP400S (enerģijas pielietošana ∼ 400 Ws). Šūnu atliekas noņēma ar centrifugēšanu (6000 × g, 4°C, 5 min) un analizēja ar nātrija dodecilsulfāta – poliakrilamida gēla elektroforēzi (SDS-PAGE) reducējošos apstākļos saskaņā ar Laemmli (1970) metodi, izmantojot 12,5% poliakrilamida gēlus. EGFP ekspresiju pārbaudīja maisītā kultūrā. (Fritsche et al. 2007)

Hromatīna imūnprecipitācija

Hromatīna imūnprecipitācijas analīzi veica, izmantojot ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem ar dažām modifikācijām. Īsumā, diferencētus cilvēka podocītus šķērsojoši saistīja ar 1% formaldehīdu 10 min istabas temperatūrā. Šūnas mazgāja ar ledussaušu PBS un fiksācijas reakciju apturēja, pievienojot 0,125 M glicīnu 5 min istabas temperatūrā. Šūnas vēlreiz mazgāja ar ledussaušu PBS un nokasīja no trauka. Šūnas nogulsnēja ar centrifugēšanu un atkārtoti suspendēja līzes buferšķīdumā. Pēc centrifugēšanas nogulsnētos kodolus atkārtoti suspendēja bīdes buferšķīdumā, inkubēja ledū 30 min un hromatīnu bīdīja ar ultraskaņas apstrādi, piemēram, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Vācija) ar 25% jaudu, 5 impulsiem pa 20 s katrs ledū, līdz fragmentiem aptuveni 200–600 bp. Bīdīto hromatīnu pēc tam centrifugēja un savāca supernatantu. Imūnprecipitācijām 60 μl hromatīna inkubēja ar 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) vai NF-κB p50 (Abcam) antivielām vai ar trušs IgG (Zymed Laboratories) kā negatīvu kontroli, visu nakti 4°C ar vieglu rotāciju. Imūnkompleksi, kas saistīti ar magnētiskām lodītēm, tika savākti, izmantojot magnētisku statīvu, plaši izmazgāti, un proteīna/DNS šķērsojošās saites tika atgrieztas, un DNS tika eluēta reāllaika PCR analīzei. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNS sagatavošana čipu masveida analīzei

Šūnu līzātu un ekstrahētās DNS izkārtojums
Baktēriju nogulsnes, suspendētas PBS līdz vēlamajai galīgajai koncentrācijai, apstrādāja ar ultraskaņas šūnu sagrauvēju UP100H (Hielscher GmbH, Vācija) ar mikrouzgali MS1 (diametrs 1 mm). Darba frekvence bija 30 kHz un efektīvā izejas jauda bija 100 W. Darbības laikā paraugi tika dzesēti ledus-ūdens vannā, maisīti un centrifugēti. Paraugi tika izmantoti plūsmas citometrijas pētījumiem, bet turpmākai apstrādei paraugi tika pakļauti apstrādei ar karstumu (95°C, 5 min). Neapstrādāti šūnu lizāti tika apstrādāti ar fenola:hloroforma:izamilspirta maisījumu (25:24:1). Lizāta paraugam tika pievienots vienāds šī maisījuma tilpums, šķīdums tika intensīvi vortexēts 15 s un centrifugēts pie 15 000 x g 2 min istabas temperatūrā (IT) aptuveni 22°C. Augšējā ūdens fāze, kas saturēja genomisko DNS, tika uzmanīgi atdalīta un savākta jaunā sterilā Eppendorf mēģenē.
Pēc tam paraugi tika apstrādāti ar ultraskaņu, lai fragmentētu DNS. Apstrādes ar ultraskaņu posms tika veikts tajos pašos apstākļos, kā aprakstīts iepriekš. Lai novērtētu fragmentācijas ietekmi uz genomisko DNS, paraugi tika analizēti, izmantojot agarozes gēla elektroforēzi.
(…) Paraugi, kas iepriekš tika apstrādāti ar ultraskaņu 2,5 min, tika pakļauti ekstrakcijas posmam pēc apstrādes ar karstumu un centrifugēšanas. Atbrīvotā DNS tika divas reizes ekstrahēta ar fenola:hloroforma:izamilspirta maisījumu, un pēc tam pakļauta otrai apstrādei ar ultraskaņu 0 – 15 min. Agarozes gēla elektroforēze tika izmantota, lai noteiktu DNS, kas pakļauta ultraskaņas fragmentācijai pēc ekstrakcijas, izmēra sadalījumu (attēls augšējā labajā pusē). Ļoti fragmentēta DNS bija redzama no DNS izplūšanas klātbūtnes, nevis augstas molekulmasas joslu klātbūtnes, kas tika eliminētas no paraugiem, kas apstrādāti ar ultraskaņu 2,5 min vai ilgāk. Garāka apstrāde ar ultraskaņu pakāpeniski samazināja fragmentu garumus līdz aptuveni 150 – 600 bp, un apstrāde ar ultraskaņu 15 min turpināja degradēt šos fragmentus, kā var redzēt galvenokārt izplūšanas augšējā daļā. Tādējādi vidējais DNS fragmentu izmērs pakāpeniski samazinājās līdz ar ultraskaņas apstrādes laiku, un 5 min apstrāde ļāva iegūt DNS fragmentu izmērus, kas vislabāk piemēroti čipu mikroshēmu analīzēm. Visbeidzot tika izveidota DNS analīta sagatavošanas procedūra, kas ietver pirmo 2 min ultraskaņas apstrādi, DNS ekstrakciju (2×) un turpmāko 5 min apstrādi ar ultraskaņu. (Basselet et al. 2008)

Hromatīna imūnprecipitācija (ChIP)

HEK293 šūnas tika audzētas, kā aprakstīts iepriekš, un fiksētas ar 2 mM disukcinimidil-glutarātu 45 min istabas temperatūrā. Pēc tam šūnas divas reizes mazgāja ar PBS. Hromatīns tika savienots ar šķērssaitēm 10 min istabas temperatūrā, izmantojot 1% (v/v) formaldehīdu, un divas reizes mazgāts ar ledus aukstu PBS. Šķērssaišu veidošanās reakcija tika apturēta, inkubējot ar glicīnu beigu koncentrācijā 0,125 M 5 min istabas temperatūrā. Pēc inkubācijas ar tripsīnu šūnas tika noberztas no šūnu audzēšanas trauka un divas reizes mazgātas ar PBS. Šūnu nogulsnes tika resuspendētas lizēšanas buferšķīdumā (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl un 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubētas uz ledus 10 min un homogenizētas ar Dounce homogenizatoru. Pēc tam kodoli tika nogulsnēti, centrifugējot (3500 x g, 5 min, 4 °C), un resuspendēti kodolu buferšķīdumā (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA un 1% (w/v) SDS). Kodoli tika sagrauti, apstrādājot ar ultraskaņu ar trim 20 s impulsiem UP50H ultraskaņas homogenizatorā (Hielscher Ultraschall Technologie) ar iestatījumu cikls 0,5 un amplitūda 30%, iegūstot genomiskās DNS fragmentus ar kopējo izmēru 200 – 1000 bp. ChIP analīzei 50g DNS tika atšķaidīts 4 reizes imūnprecipitācijas buferšķīdumā (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 un 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histonu modifikāciju analīze, izmantojot hromatīna imūnprecipitāciju (ChIP)

Īsumā, 6 x 10⁶ šūnas divas reizes nomazgāja ar PBS un uz kultūras plates savienoja ar 0,5% formaldehīdu istabas temperatūrā 15 min. Savienojuma reakciju pārtrauca, pievienojot 0,125 M glicīnu. Visus turpmākos posmus veica 48°C. Visi buferšķīdumi bija iepriekš atdzesēti un saturēja proteāžu inhibitorus (Complete Mini, Roche). Šūnas divas reizes nomazgāja ar PBS un pēc tam noberza. Savāktos nogulsnējumus izšķīdināja 1 ml līzes buferšķīduma (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) un apstrādāja ar ultraskaņu aukstā etanola vannā 10 ciklus ar 100% amplitūdu, izmantojot UP50H ultraskaņas homogenizatoru (Hielscher, Teltow, Vācija). Hromatīna fragmentāciju vizualizēja 1% agarozes gēlā. Iegūtie fragmenti bija 200–500 bp diapazonā. Šķīstošu hromatīnu iegūta, centrifugējot ultraskaņā apstrādātos paraugus ar 14 000 g 10 min 48°C. Šķīstošo frakciju atšķaidīja 1/10 atšķaidīšanas buferšķīdumā (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), pēc tam sadalīja alikvotos un uzglabāja 80°C līdz lietošanai. (Rodriguez et al. 2008)