Hielscher ultraskaņas tehnoloģija

Ultraskaņas DNA Nobīdes

  • DNS un RNS nobīdes laikā DNS molekulas ir sadalītas mazākos gabalos. DNS/RNS sadrumstalotība ir viens no svarīgiem parauga sagatavošanas soļiem, kas nepieciešams izveidot bibliotēkas nākamās paaudzes sekvences (NGS).
  • Ultraskaņas DNS nobīdes izmanto akustisko kavitāciju spēkus, lai izjauktu DNS vai RNS gabalos 100 – 5KB BP.
  • Ultraskaņas nobīdes ļauj precīzi DNS sadrumstalotību un pielāgojas vēlamo DNS garumu.

Ultraskaņas DNA Nobīdes

Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus ultraskaņas risinājumus DNS, RNS un hromatin nobīdes. Izvēlieties zondes tipa ultrasonikatorus (piem., UP100H) tiešai ultraskaņas apstrādei, izmantojot mikrouzgali, vai izmantojiet VialTweeeter vai ultraskaņas skapi, lai netiešā DNS sagatavotu dažādus paraugus vienlaicīgi. Hielscher piedāvā ideālu ierīci, ņemot vērā jūsu vajadzības: jums ir 1 vai līdz 10 paraugi, sējumi no mikrolitra līdz litru sējumiem – Hielscher ultraskaņas procesori ir pieejami atbilstoši jūsu prasībām, lai sagatavotu DNS, RNS un hromatin fragmentus pareizā garumā. Reproducējamība, vienkārša lietošana un precīza kontrole ļauj izveidot uzticamu bibliotēku nākamās paaudzes sekvences veidošanai.
Pretstatā fermentatīvā DNS fragmentācija, ultraskaņas nobīdes piemēro tīras mehāniskās bīdes spēkus, nepievienojot ķīmiskas vielas. Ar precīzu iestatījumu procesa parametriem, ultraskaņas nobīdes ražo lielu molekulmasu DNS fragmenti (plazmīds un genomiskais DNS).
Attīrītas nukleīnskābes var pastiprināt pirms vai pēc fragmentācijas soļa.
Sonication parametri (jauda, impulsu cikls/pārrāvumi, laiks un temperatūra) var droši kontrolēt, izmantojot programmatūras iestatījumus.

Priekšrocības:

  • precīza kontrole
  • ultraskaņu cikli un laiks, kas precīzi pielāgojams vēlamajam DNS izmēram
  • lielas molekulmasas DNS fragmenti
  • temperatūras kontrole
  • Ātri
  • Reproducēt rezultāti
  • autoklavējama
  • dažādi risinājumi: Zondes tips, VialTweeter un Cuphorns

Protokoli ultraskaņas DNS nobīdes

Hromatogrāfa Imunoprecisirdsklauves testā

Īsumā, šūnas tika pārklātas ar 60mm diametra ēdieniem (400 000 uz vienu trauku) un transfēti ar "RhoA siRNA" (kā aprakstīts); pēc 72 h, tie tika inkubēti ar formaldehīdu (galīgā koncentrācija 1%) 10 minūtes 37 ° c temperatūrā, lai proteīnus savienotu ar DNS. Krusteniskā sasaistes reakcija tika rūdītas, pievienojot vienu desmitdaļu 1,25 mol/L glicīna, dodot 125 mmol/L galīgā koncentrācijā. Divas reizes nomazgā šūnas ar ledus aukstu PBS, atkārtoti suspendētas radioimūnopreciksila testa buferšķīdumā [150 mmol/L NaCl, 1% NP40%, 0,5% dezoksiholāta, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], kas satur 1 mmol/L fenilmetilsulfonila fluorīda, 1 AG/mL 1 AG/mL pepstatīna A, un tur uz ledus 30 min. Tad, šūnu lysates bija apstrādāt ultraskaņu uz ledus ar Hielscher UP200S Ultraskaņas sonikators (3 x 40 s, amplitūda 40%, 1. cikls; Hielscher Ultrasonics GmbH), līdz ar to savstarpēji saistīti hromatīni tika nocirpta, lai iegūtu DNS fragmentus no 200 līdz 1 000 BP. Viena desmitdaļa no visa lizāta tika izmantota, lai kvantitatīvi iegūtu DNS daudzumu dažādos paraugos un uzskatītu par “kopējā ievade DNS”. Supernatants inkubē ar lašu spermas DNS/olbaltumvielu agradās-50% vircu, lai samazinātu nespecifisku fonu. Imunoprecisirdsklauves pēc tam tika veikta uz nakti pie 4 ° c ar 5 AG Anti-NF-nB P65 (upstate) vai bez antivielas (negatīva kontrole). Šos centrifugātu papildināja ar 5 mol/L NaCl un uz nakti silda 65 ° c temperatūrā, lai atjaunotu proteīnu DNS šķērssaites. Imūnsalikumu tālāk ārstēja ar Dnāzes un Rnāzi nesaturošu proteināzes K un DNS attīrīts ar fenola/hloroforma ekstrakciju un etanola izgulsnēšanu. PCR tika veikta ar konkrētiem praimeriem, kas atbilst sekvences ietvaros promotoru reģionā cilvēka iNOS gēnu (P1 primer: 5 ļ-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3 ļ; P2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3 ļ). (Doublier et al., 2008)

EGFP ekspresijas pētījumi

Izteiksmes pētījumos rekombinanto celmu L. tarentolae P10:: F9Begfp 1.4 dBsat # 12 (jena BioScience, Vācija) ar gēnu EGFP (Enhanced Green luminiscējošo proteīnu), hromosomu SSU integrēts, tika kultivēts dažādos medijos, kā aprakstīts iepriekš un papildus papildināta ar 100 mg l-1 Nourseothricin (jena BioScience, Vācija). Kultivēšanas laikā tika ņemti 1 ml paraugi, kas ir centrifugēti (2000 × g, 20 ° c, 10 minūtes) un mazgāti ar 0,9% NaCl šķīduma. Granulveida nogulsnes saskaloja buferšķīdumā (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) un samalta ar ultraskaņas procesoru, UP400S (enerģijas piemērošana ∼ 400 ws). Šūnu gružus aizvāc centrifugējot (6000 × g, 4 ° c, 5 min) un analizē ar nātrija dodecilsulfātu – poliakrilamīda gela elektroforēzi (SDS-PAGE) ar reducēšanas nosacījumiem saskaņā ar Laemmli metodi (1970) ar 12,5% poliakralamīda gelu. "EGFP" ekspresiju pētīja uzbudināta kultūrā. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Ar E. coli EDL933-15 min. ultrasonikācijas palīdzību veikta elektrofohoretisko analīžu analīze. L norāda DNS kāpnes. (Basselet et al. 2008)

Informācijas pieprasījums




Ņemiet vērā, ka mūsu Privātuma politika.


Hromatin imunopreciprācija

Ultraskaņas šūnu disruptor UP100H (100W) līzes, šūnu traucējumus un DNS nobīdes.Hromatā imunoprecipitācijas pārbaude tika veikta, izmantojot ChIP-ITTm Express (Active motif, Carlsbad, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja instrukcijām ar dažām modifikācijām. Īsumā, diferencēti cilvēka podoti tika savstarpēji saistīti ar 1% formaldehīdu 10 min istabas temperatūrā. Šūnas izskaloja ar ledus aukstā PBS un fiksācijas reakcija tika apturēta, pievienojot 0,125 M glicīnu 5 min istabas temperatūrā. Šūnas tika atkal mazgāti ar ledus aukstā PBS un nokasītas no trauka. Šūnas granulētas, centrifugējot un atkārtoti suspendētas līzes buferšķīdumā. Pēc centrifugēšanas, granulētie kodoli tika saskaloti ar nobīdes buferšķīdumu, uz ledus uz 30 min, un Hromatīns tika nocirstas ar ultraskaņu, piemēram, UP100H (Hielscher ultrasonics GmbH, Teltow, Vācija) pie 25% jauda 5 impulsus 20 SEK katru uz ledus fragmenti aptuveni 200-600 BP. Pēc tam nocirpta hromatogrāfā centrifugēja un centrifugātu savāca. Imunoprecipito gadījumā 60 μl hromatina inkubē ar 1 ģg SP1 (Santa Cruz biotehnoloģija, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB P65 (Abcam, Cambridge, UK) vai NF κB Autoceļš P50 (Abcam) antivielas vai trušu IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), kā ar negatīvu kontroli uz nakti 4 ° c temperatūrā ar maigu rotāciju. Imūnkompleksi, kas saistās ar magnētiskajām lodītēm, tika savākti, izmantojot magnētisko statīvu, kas tika plaši nomazgāts, un olbaltumvielu/DNS crosslinks tika apgrieztas un DNS eluētas reālā laika PCR analīzei. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA sagatavošana chip masīvs analīze

Šūnu lizsates un ekstrahēto DNAs izvietojums
Bakteriālās granulas, kas suspendētas PBS līdz vēlamajai galīgajai koncentrācijai, tika Ultraskaņas disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Vācija) ar mikrotip MS1 (1 mm diametrā). Darbības frekvence bija 30 kHz un efektīva izejas jauda bija 100 W. Operācijas laikā paraugi tika atdzesēti ledus ūdens vannā, jauktā un centrifugētā. Paraugi tika izmantoti plūsmas citometometrijas pētījumos, bet vēlākai apstrādei paraugi tika pakļauti termiskai apstrādei (95 ° c, 5 min). Jēlšūnu lizētas tika apstrādātas ar fenola maisījumu: hloroformu: izoamilspirtu (25:24:1). Lizātam paraugam pievieno vienādu tilpumu šā maisījuma, un šķīdums tika intensīvi samaisīts ar 15 s un centrifugēts ar 15 000 x g 2 min istabas temperatūrā (RT) ap 22 ° c. Augstākā ūdens fāze, kas satur genomu DNS, tika rūpīgi atdalīta un savākta jaunā sterilā Eppendorf caurulē.
Pēc tam, paraugi tika apstrādāt ultraskaņu, lai fragments DNS. Ultraskaņu solis tika realizēta ar tādiem pašiem nosacījumiem, kā aprakstīts iepriekš. Lai novērtētu sadrumstalotības ietekmi uz genomikas DNS, paraugi tika analizēti, izmantojot agarozes gela elektroforēzi.
(…) Paraugi, kas pirms tam 2,5 min, tika pakļauti ekstrakcijas solim pēc termiskās apstrādes un centrifugēšanas. DNS izdalīja divas reizes ar fenolu: hloroforma: isoamyl Alcohol mix, un pēc tam pakļauts otrajai ultraskaņas apstrādei 0-15 min. agarozes gela elektroforēze tika izmantota, lai noteiktu DNS izmēru sadalījumu pēc ekstrahēšanas Ultraskaņas fragmentācija (att. augšējā labajā pusē). Ļoti sadrumstalota DNS bija redzams no klātbūtnes DNS uztriepes, nevis augstas molekulmasas joslām, kas tika izslēgti no paraugiem apstrādāt ultraskaņu 2,5 min vai ilgāk. Ilgāks ultraskaņas apstrāde pakāpeniski samazina fragmentu garumu līdz aptuveni 150-600 BP, un ultraskaņas apstrāde 15 min tālāk degradēti šie fragmenti, kā redzams galvenokārt augšējo daļu uztriepes. Tādējādi, vidējais DNS fragments izmērs pakāpeniski samazinājās ar ultrasonication laiku un 5 min ārstēšana ļāva iegūt izmēru DNS fragmenti visvairāk piemērotas chip Array testos. Visbeidzot, tika izveidota DNS analizējamās vielas sagatavošanas procedūra, kas ietver pirmo 2 min ultraskaņas apstrādi, DNS ekstrakciju (2 ×) un sekojošu 5 minūšu ultraskaņu. (Basselet et al. 2008)

Hromatin Imunoprecisirdsklauves (ChIP)

Ultraskaņas procesors UP100H DNS, RNS un hromatin nobīdes. (Noklikšķiniet, lai palielinātu!)HEK293 šūnas tika kultivētas, kā aprakstīts iepriekš, un nostiprināti ar 2 mM disukcinimidil-glutarātu uz 45 min istabas temperatūrā. Pēc tam šūnas divreiz nomazgā ar PBS. Hromatīns bija savstarpēji saistīts 10 minūtes istabas temperatūrā, izmantojot 1% (v/v) formaldehīdu un mazgāti divreiz ar ledus aukstā PBS. Krusteniskā sasaistes reakcija tika pārtraukta, to inkubējot ar glicīnu galīgajā koncentrācijā 0,125 M 5 min istabas temperatūrā. Pēc inkubācijas ar triypsin, šūnas tika nokasītas no šūnu kultūras trauka un mazgā divas reizes ar PBS. Šūnu granulu saskaloja līzes buferšķīdumā (5 mM caurules, pH 8,0, 85 mM KCl un 0,5% (v/v) Nonidet P-40), 10 min inkubē uz ledus un homogenizē ar Dounce homogenizatoru. Pēc tam kodols tika granulēts ar centrifugēšanu (3500 x g, 5 min, 4 ° c) un atkārtoti suspendētas kodolu buferšķīdumā (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA un 1% (m/v) SDS). Kodolu iztraucēja ar ultraskaņu ar 3 20-s impulsiem UP50H sonikators (Hielscher Ultraschall Tehnoloģie), nosakot cikla 0,5 un amplitūdu 30%, iegūstot genomisko DNS fragmenti ar liela izmēra 200 – 1000 BP. Mikroshēmas gadījumā 50 g DNS tika atšķaidīta 4 reizes ar imunopreciktilbuferšķīdumu (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 un 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histona modifikācija analīzē, izmantojot hromatin imunoprecipitācijas (ChIP)

Īsumā, 6 x 106 šūnas tika divas reizes mazgātas ar PBS un savstarpēji saistītas kultūras plātne 15 min istabas temperatūrā 0,5% formaldehīda klātbūtnē. Krusteniskā sasaistes reakcija tika pārtraukta, pievienojot 0,125 M glicīnu. Visi turpmākie soļi tika veikti 48 ° c temperatūrā. Visi buferi tika iepriekš atdzesēti un ietvēra proteāzes inhibitorus (Complete mini, Roche). Šūnas tika mazgāti divreiz ar PBS un tad nokasītas. Savāktās granulas tika izšķīdinātas 1 ml līzes buferšķīdumā (1% SDS, 5 mm EDTA, 50 mm tris pH 8) un tika apstrādāt ultraskaņu aukstā etanolā vannā uz 10 cikliem pie 100% amplitūdas, izmantojot UP50H sonikators (Hielscher, Teltow, Vācija). Hromatin fragmentācija tika vizualizēta 1% agarozes gēlam. Iegūtie fragmenti bija 200-500pb diapazonā. Šķīstošo hromatīnu iegūst, centrifugējot apstrādāt ultraskaņu paraugus pie 10000 g 10 min 48 ° c temperatūrā. Šķīstošā frakcija atšķaidīja 1/10 atšķaidīšanas buferšķīdumā (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), pēc tam alikē un uzglabā 80 ° c temperatūrā līdz lietošanai. (Rodriguez et al. 2008)

Ierīci Jauda [W] Tipa Tilpums [mL]
VialTweeter 200. Atsevišķa 0.5. 1,5.
UP50H 50. rokas vai standmounted 0.01. 250.
UP100H 100. rokas vai standmounted 0.01. 500.
UP200Ht 200. rokas vai standmounted 0.1. 1000.
UP200St 200. standmounted ar 0.1. 1000.
UP400St 400. standmounted ar 5,0. 2000.
Cuphorns 200. Taure, sonoreactor 10 200.
GDmini2 200. piesārņojuma plūsmas šūna

Informācijas pieprasījums




Ņemiet vērā, ka mūsu Privātuma politika.


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter Ultraskaņas parauga ieplūdes

Sazinies ar mums! / Uzdot mums!

Lūgt vairāk informācijas

Lūdzu, izmantojiet zemāk esošo veidlapu, ja vēlaties pieprasīt papildu informāciju par ultraskaņas homogenizāciju. Mēs priecāsimies piedāvāt jums ultraskaņas sistēmu, kas atbilst jūsu prasībām.









Lūdzu, ņemiet vērā mūsu Privātuma politika.


Literatūra / Literatūras saraksts

  • Basselet P., WEGRZYN G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): paraugu apstrāde DNS chip masīva balstītu analīzi Enterohemorāģisko Escherichia coli (EHEC). Mikrobu šūnu rūpnīcas 7:29. 2008.
  • Doublier S., Riganti CH., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing atgūst rezistenci pret doksorubicīnu cilvēka resnās zarnas vēža šūnās. Molekulārais vēzis Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): metodes novērtējums Fusarium DNS ekstrakcijai no micēlijas un kviešiem, kas paredzēti reālā laika PCR kvantitatīvai noteikšanai un korelācija ar mikotoksīnu līmeņiem. Žurnālu mikrobioloģisko metožu 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): raksturojums augšanas uzvedības Leishmania tarentolae – jauna ekspresijas sistēma rekombinanto proteīnu. Vēstnesis Basic microbiology 47, 2007. 384 – 393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Neph3 gēnu Regula podocītu-galvenās lomas transkripcijas faktori NF-κB un SP1. BMC Molekulārā bioloģija 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-Wide izsekošana unmethylated DNS alu atkārto normālā un vēža šūnās. Nukleīnskābju pētniecības Vol. 36, no 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): histidīna triāde olbaltumvielu Hint1 izraisa apoptozes neatkarīga no tās fermentatīvā aktivitāte. Bioloģisko ķīmijas Vēstnesis. 281. sēj., Nr. 37, 2006. 27356–27366.


Fakti ir vērts zināt

Ultraskaņas/akustiskā kavitācija rada ļoti intensīvus spēkus, kas veicina kristalizāciju un nokrišņu procesus (noklikšķiniet, lai palielinātu!)

Ultraskaņas DNS nobīdes pamatā ir akustiskās kavitāciju un tās hidrodinamisko bīdes spēki