Ultraskaņas DNS nobīde

• DNS un RNS nobīdes laikā DNS molekulas tiek sadalītas mazākos gabalos. DNS / RNS fragmentācija ir viens no svarīgākajiem paraugu sagatavošanas soļiem, kas nepieciešami, lai izveidotu bibliotēkas nākamās paaudzes sekvencēšanai (NGS).
• Ultraskaņas DNS nobīde izmanto akustiskās kavitācijas spēkus, lai sadalītu DNS vai RNS gabalos pa 100 – 5 KB bp.
• Ultraskaņas nobīde ļauj precīzi DNS fragmentēt un pielāgoties vēlamajam DNS garumam.

DNS nobīde, izmantojot ultrasonication

Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus ultraskaņas risinājumus DNS, RNS un hromatīna bīdei. Izvēlieties starp zondes tipa ultrasonikatoriem (piemēram, UP100H) tiešai ultraskaņas apstrādei, izmantojot mikrotipu, vai izmantojiet VialTweeeter vai ultraskaņas cuphorn dažādu paraugu netiešai DNS sagatavošanai vienlaicīgi. Hielscher piedāvā ideālu ierīci, ņemot vērā jūsu vajadzības: vai jums ir 1 vai līdz 10 paraugiem, tilpumi no mikrolitra līdz litru tilpumiem – Hielscher ultraskaņas procesori ir pieejami, lai apmierinātu jūsu prasības sagatavot DNS, RNS un hromatīna fragmentus pareizajā garumā. Reproducējamība, ērta darbība un precīza vadība nodrošina uzticamu bibliotēku nākamās paaudzes sekvencēšanai.
Atšķirībā no fermentatīvās DNS sadrumstalotības, ultraskaņas nobīde izmanto tīrus mehāniskus bīdes spēkus, nepievienojot ķīmiskas vielas. Precīzi nosakot procesa parametrus, ultraskaņas nobīde rada augstas molekulmasas DNS fragmentus (plazmīdu un genoma DNS).
Attīrītas nukleīnskābes var pastiprināt pirms vai pēc fragmentācijas posma.
Ultraskaņas parametrus (jaudu, impulsa ciklu / pārrāvumus, laiku un temperatūru) var droši kontrolēt, izmantojot programmatūras iestatījumus.

Protokoli ultraskaņas DNS nobīdei

Hromatīna imūnprecipitācijas pārbaudei

Īsumā, šūnas tika pārklātas 60 mm diametra traukos (400 000 vienā traukā) un transficētas ar RhoA siRNS (kā aprakstīts); pēc 72 stundām tie tika inkubēti ar formaldehīdu (galīgā koncentrācija, 1%) 10 minūtes 37 ° C temperatūrā, lai savstarpēji saistītu proteīnus ar DNS. Šķērssaistīšanas reakcija tika apturēta, pievienojot vienu desmito tilpumu 1,25 mol/l glicīna, kas deva 125 mmol/l galīgo koncentrāciju. Šūnas divas reizes tika mazgātas ar ledusaukstu PBS, atkārtoti suspendētas radioimunoprecipitācijas testa buferšķīdumā [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% dezoksiholāts, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], kas satur 1 mmol/L fenilmetilsulfonilfluorīda, 1 Ag/ml approtinīna un 1 Ag/ml pepstatīna A, un turētas uz ledus 30 min. Pēc tam šūnu lizāti tika apstrādāti ar ultraskaņu uz ledus ar Hielscher UP200S ultraskaņas sonikators (3 x 40 s, amplitūda 40%, 1. cikls; Hielscher Ultrasonics GmbH), līdz šķērssaistītie hromatīni tika nocirsti, lai iegūtu DNS fragmentus no 200 līdz 1,000 bp. Lai kvantitatīvi noteiktu DNS daudzumu dažādos paraugos, tika izmantota viena desmitā daļa vesela lizāta, un to uzskatīja par “kopējās ievades DNS”. Supernatanti tika inkubēti ar laša spermas DNS/olbaltumvielu agarozes 50% vircu, lai samazinātu nespecifisko fonu. Pēc tam imūnprecipitācija tika veikta pa nakti 4 °C temperatūrā ar 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) vai bez antivielām (negatīvā kontrole). Šie centrifugāti tika papildināti ar 5 mol/L NaCl un pa nakti karsēti 65 °C temperatūrā, lai atjaunotu olbaltumvielu un DNS šķērssaites. Imūnkompleksi tika tālāk apstrādāti ar proteīnāzi K, kas nesatur DNase un RNase, un DNS tika attīrīta ar fenola/hloroforma ekstrakciju un etanola izgulsnēšanu. PCR tika veikta ar specifiskiem praimeriem, kas atbilst secībai cilvēka iNOS gēna promotora reģionā (p1 praimers: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 praimeris: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP ekspresijas pētījumi

Ekspresijas pētījumos rekombinantais celms L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Vācija) ar gēnu EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), hromosomu ssu, integrēts, tika kultivēts dažādās barotnēs, kā aprakstīts iepriekš, un papildus papildināts ar 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Vācija). Audzēšanas laikā tika ņemts 1 ml paraugu, centrifugēts (2000 × g, 20°C, 10 min) un mazgāts ar 0,9% NaCl šķīdumu. Granulas tika atkārtoti suspendētas buferī (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) un sadalītas ar sonifikāciju ar ultraskaņas procesoru UP400S (enerģijas pielietojums ∼ 400 Ws). Šūnu atliekas tika noņemtas centrifugējot (6000 × g, 4°C, 5 min) un analizētas ar nātrija dodecilsulfātu – poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAGE) reducējošos apstākļos pēc Laemmli (1970) metodes ar 12,5% poliakralamīda gēliem. EGFP ekspresija tika pārbaudīta satrauktā kultūrā. (Fritsche et al. 2007)

hromatīna imūnprecipitācija

Hromatīna imūnprecipitācijas tests tika veikts, izmantojot ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem ar dažām izmaiņām. Īsumā, diferencētie cilvēka podocīti bija savstarpēji saistīti ar 1% formaldehīdu 10 min istabas temperatūrā. Šūnas tika mazgātas ar ledusaukstu PBS, un fiksācijas reakcija tika apturēta, pievienojot 0,125 M glicīnu 5 minūtes istabas temperatūrā. Šūnas atkal mazgāja ar ledusaukstu PBS un nokasīja no trauka. Šūnas tika granulētas centrifugējot un atkārtoti suspendētas līzes buferšķīdumā. Pēc centrifugēšanas granulētie kodoli tika atkārtoti suspendēti bīdes buferī, inkubēti uz ledus 30 minūtes, un hromatīns tika nogriezts ar ultraskaņu, piemēram, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Vācija) ar 25% jaudu 5 impulsi pa 20 sekundēm katrs uz ledus aptuveni 200–600 bp fragmentos. Pēc tam nocirpto hromatīnu centrifugēja un savāca centrifugātu. Imūnprecipitācijām 60 μl hromatīna inkubēja ar 1 μg Sp1 (Santakrusas biotehnoloģija, Santakrusa, CA, ASV), NF-κB p65 (Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste) vai NF-κB p50 (Abcam) antivielām, vai ar trušu IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) kā negatīvu kontroli pa nakti 4 °C temperatūrā ar vieglu rotāciju. Imūnkompleksi, kas saistīti ar magnētiskajām lodītēm, tika savākti, izmantojot magnētisko statīvu, plaši mazgāti, un olbaltumvielu / DNS šķērssaites tika apgrieztas un DNS eluētas reālā laika PCR analīzei. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNS sagatavošana mikroshēmu masīvu analīzei

Šūnu lizātu un ekstrahēto DNS izvietojums
Baktēriju granulas, kas suspendētas PBS līdz vēlamajai galīgajai koncentrācijai, tika apstrādātas ar ultraskaņas traucētājs UP100H (Hielscher GmbH, Vācija), kas aprīkots ar mikrotipu MS1 (1mm diametrā). Darba frekvence bija 30 kHz un efektīvā izejas jauda bija 100 W. Operācijas laikā paraugi tika atdzesēti ledus ūdens vannā, sajaukti un centrifugēti. Paraugi tika izmantoti plūsmas citometrijas pētījumiem, savukārt vēlākai apstrādei paraugi tika pakļauti termiskai apstrādei (95 ° C, 5 min). Kopšūnu lizātus apstrādāja ar fenola:hloroforma:izoamilspirta maisījumu (25:24:1). Lizāta paraugam pievienoja vienādu daudzumu šā maisījuma, šķīdumu enerģiski virpulināja 15 sekundes un centrifugēja 15 000 x g 2 minūtes istabas temperatūrā (RT) ap 22 °C. Augšējā ūdens fāze, kas satur genoma DNS, tika rūpīgi atdalīta un savākta jaunā sterilā Eppendorf mēģenē.
Pēc tam paraugi tika apstrādāti ar ultraskaņu, lai fragmentētu DNS. Ultraskaņas solis tika realizēts tādos pašos apstākļos, kā aprakstīts iepriekš. Lai novērtētu fragmentācijas ietekmi uz genoma DNS, paraugi tika analizēti, izmantojot agarozes gēla elektroforēzi.
(…) Paraugi, kas iepriekš apstrādāti ar ultraskaņu 2,5 minūtes, pēc termiskās apstrādes un centrifugēšanas tika pakļauti ekstrakcijas posmam. Izdalītā DNS tika ekstrahēta divas reizes ar fenola:hloroforma:izoamilspirta maisījumu un pēc tam pakļauta otrajai ultraskaņas apstrādei 0–15 min. Agarozes gēla elektroforēze tika izmantota, lai noteiktu DNS lieluma sadalījumu, kas pakļauts pēcekstrakcijas ultraskaņas sadrumstalotībai (att. augšējā labajā pusē). Ļoti sadrumstalota DNS bija acīmredzama no DNS uztriepes klātbūtnes, nevis augstas molekulmasas joslām, kas tika izvadītas no paraugiem, kas apstrādāti ar ultraskaņu 2,5 minūtes vai ilgāk. Ilgāka ultraskaņas apstrāde pakāpeniski samazināja fragmentu garumus līdz aptuveni 150–600 bp, un ultraskaņas apstrāde 15 minūtes vēl vairāk pasliktināja šos fragmentus, kā to var redzēt galvenokārt uztriepes augšējā daļā. Tādējādi vidējais DNS fragmenta lielums pakāpeniski samazinājās ar ultrasonication laiku, un 5 minūšu apstrāde ļāva iegūt DNS fragmentu izmērus, kas ir vispiemērotākie mikroshēmu masīvu testiem. Visbeidzot, tika izveidota DNS analīta sagatavošanas procedūra, kas sastāv no pirmās 2 minūtes ultraskaņas apstrādes, DNS ekstrakcijas (2×) un turpmākās 5 min ultraskaņas apstrādes. (Basselet et al. 2008)

Hromatīna imūnprecipitācija (ChIP)

HEK293 šūnas tika kultivētas, kā aprakstīts iepriekš, un fiksētas ar 2 mM disuccinimidil-glutarātu 45 minūtes istabas temperatūrā. Pēc tam šūnas divreiz mazgāja ar PBS. Hromatīns tika šķērssaistīts 10 minūtes istabas temperatūrā, izmantojot 1% (v/v) formaldehīdu, un divas reizes mazgāts ar ledusaukstu PBS. Šķērssaistīšanas reakcija tika apturēta, inkubējot ar glicīnu galīgajā koncentrācijā 0,125 M 5 min istabas temperatūrā. Pēc inkubācijas ar tripsīnu šūnas tika nokasītas no šūnu kultūras trauka un divas reizes mazgātas ar PBS. Šūnu granulas tika atkārtoti suspendētas līzes buferšķīdumā (5 mM caurules, pH 8,0, 85 mM KCl un 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubētas uz ledus 10 minūtes un homogenizētas ar Dounce homogenizatoru. Pēc tam kodolus granulēja centrifugējot (3500 x g, 5 min, 4 °C) un atkārtoti suspendēja kodolu buferšķīdumā (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA un 1% (m/V) SDS). Kodolus izjauca ultraskaņas apstrāde ar trim 20-s impulsiem a UP50H sonikators (Hielscher Ultraschall Technologie) pie cikla 0,5 un amplitūdas 30% iestatījuma, iegūstot genoma DNS fragmentus ar lielāko izmēru 200 – 1000 bp. ChIP gadījumā 50 g DNS tika atšķaidīts 4 reizes imūnprecipitācijas buferšķīdumā (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 un 0,01% (m/V) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histonu modifikācijas analīze ar hromatīna imūnprecipitāciju (ChIP)

Īsumā, 6 x 10⁶ šūnas divas reizes tika mazgātas ar PBS un šķērssaistītas uz kultūras plates 15 minūtes istabas temperatūrā 0,5% formaldehīda klātbūtnē. Šķērssaistīšanas reakcija tika pārtraukta, pievienojot 0,125 M glicīnu. Visi turpmākie posmi tika veikti 48°C temperatūrā. Visi buferšķīdumi bija iepriekš atdzesēti un saturēja proteāzes inhibitorus (Complete Mini, Roche). Šūnas divas reizes mazgāja ar PBS un pēc tam nokasīja. Savāktās granulas tika izšķīdinātas 1 ml līzes buferšķīdumā (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) un tika apstrādātas ar ultraskaņu aukstā etanola vannā 10 ciklus ar 100% amplitūdu, izmantojot UP50H sonikators (Hielscher, Teltova, Vācija). Hromatīna fragmentācija tika vizualizēta 1% agarozes gēlā. Iegūtie fragmenti bija 200–500pb diapazonā. Šķīstošo hromatīnu ieguva, centrifugējot apstrādātos paraugus 14 000 g 10 minūtes 48 ° C temperatūrā. Šķīstošā frakcija tika atšķaidīta 1/10 atšķaidīšanas buferšķīdumā (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), pēc tam alikotēta un uzglabāta 80 °C temperatūrā līdz lietošanai. (Rodrigess u.c. 2008)