E. coli līze ar ultraskaņu

E. coli baktērijas ir mikrobioloģijā un biotehnoloģijā visbiežāk izmantotās baktērijas.
Ultraskaņas šūnu sagrāvēji nodrošina uzticamus un reproducējamus E. coli līzes rezultātus.
Intensīva, taču precīzi kontrolējama kavitācija un bīdes spēki nodrošina pilnīgu sagraušanu un augstu ekstrakcijas iznākumu (piemēram, olbaltumvielu, DNS).

Kāpēc E. coli šūnu sagraušana ar ultraskaņu ir vēlamā metode?

Ultraskaņas homogenizatori jeb zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīces sniedz vairākas priekšrocības E. coli līzē, jo intensīva ultraskaņa efektīvi sagrauj šūnu sieniņas un membrānas. Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīces plaši izmanto E. coli līzei šādu iemeslu dēļ:

Efektīva šūnu sieniņu sagraušana: E. coli ir daļēji stingra šūnas sieniņa, kas sastāv no peptidoglikāna un ko var būt grūti sagraut ar tradicionālajām līzes metodēm. Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīce ģenerē intensīvus ultraskaņas viļņus, kas šķidrumā ap šūnām rada kavitācijas burbuļus. Šiem burbuļiem sabrūkot, rodas ātrgaitas šķidruma strūklas un triecienviļņi, kas mehāniski sagrauj šūnu sieniņas, efektīvi atbrīvojot šūnu saturu, piemēram, biomolekulas.

Uzlabota iespiešanās spēja: Zondes / sonotrodes ģenerētie ultraskaņas viļņi var iespiesties dziļi paraugā, sasniedzot lielāku skaitu E. coli šūnu un vienmērīgi tās apstrādājot. Tas palīdz nodrošināt vienmērīgāku līzi visā paraugā, tādējādi palielinot šūnu sagraušanas efektivitāti.

Saīsināts apstrādes laiks: Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīces pievadītā enerģija ir ļoti koncentrēta un lokalizēta, nodrošinot ātru un efektīvu šūnu līzi. Salīdzinājumā ar citām metodēm, piemēram, mehānisku sagraušanu ar lodītēm vai fermentatīvu līzi, apstrāde ar ultraskaņu var nodrošināt E. coli līzi dažu minūšu vai pat sekunžu laikā. Lai gan daudzas alternatīvas metodes, piemēram, sasaldēšana un atkausēšana, prasa vairākus apstrādes ciklus, līze ar ultraskaņu atver šūnas vienā procesa posmā.

Temperatūras kontrole: Modernākās ultraskaņas apstrādes ierīces ir aprīkotas ar temperatūras sensoriem un viedo programmatūru, kas ļauj iestatīt maksimālo procesa temperatūru. Sasniedzot temperatūras robežvērtību, ultraskaņas apstrādes ierīce automātiski pārtrauc darbību un sāk apstrādi ar ultraskaņu, kad ir sasniegta iestatītā temperatūra. Paraugu dzesēšana ledus vannā ir vienkārša metode, kā uzturēt zemu parauga temperatūru un novērst karstuma izraisītu parauga degradāciju.

Mērogojamība: Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīces ir pieejamas dažādos izmēros – no rokas ierīcēm līdz liela mēroga rūpnieciskiem modeļiem. Tādēļ tās ir piemērotas nelielu tilpumu apstrādei laboratorijā vai procesa mēroga palielināšanai lielāka mēroga biotehnoloģiskās apstrādes lietojumos, piemēram, vakcīnu ražošanā vai molekulu biosintēzē.

Daudzpusība: Ultraskaņas apstrādes ierīces papildus šūnu līzei var izmantot dažādiem citiem lietojumiem, piemēram, DNS fragmentēšanai ar bīdes spēkiem, olbaltumvielu ekstrakcijai, audu homogenizācijai, nanodaļiņu disperģēšanai un emulģēšanai. Tādēļ ieguldījums zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīcē nodrošina daudzpusīgas izmantošanas iespējas pētniecībā vai rūpniecībā.

Zondes tipa ultraskaņas ierīces, piemēram, UP200St, ir uzticami audu homogenizatori un šūnu smalcinātāji, tādēļ tās plaši izmanto paraugu sagatavošanai ģenētikā, piemēram, E.coli līzei

Olbaltumvielu ekstrakciju no E.coli šūnām efektīvi veic ar ultraskaņas zondi UP200St

Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīce sniedz daudzas priekšrocības E. coli līzē. Uzticama un precīza ultraskaņas procesa parametru kontrole ļauj optimizēt darbības parametrus, piemēram, jaudu, ilgumu un rīcību ar paraugu, lai sasniegtu vēlamos rezultātus.

Šajā pamācībā skaidrots, kāda veida ultraskaņas iekārta ir vispiemērotākā jūsu paraugu sagatavošanas uzdevumiem, piemēram, līzei, šūnu izjaukšanai, olbaltumvielu izolēšanai, DNS un RNS fragmentēšanai laboratorijās, analīzē un pētniecībā. Izvēlieties ultraskaņas iekārtas veidu, kas vislabāk atbilst jūsu lietojumam, paraugu tilpumam, paraugu skaitam un apstrādes ražīgumam. Hielscher Ultrasonics piedāvā jums ideāli piemērotu ultraskaņas homogenizatoru!

DNS fragmentēšanu ar ultraskaņu bieži izmanto kā paraugu sagatavošanas posmu nākamās paaudzes sekvenēšanā (NGS)

E. coli EDL933 genomiskās DNS elektroforētiskās analīzes pēc 0 – 15 min ilgas apstrādes ar ultraskaņu. L apzīmē DNS izmēru marķieri.
(pētījums un attēls: ©Basselet et al. 2008)

Šūnu sagraušana, izmantojot ultraskaņas kavitāciju

Zondes tipa ultraskaņas homogenizatori darbojas ar aptuveni 20 000 cikliem sekundē (pie 20kHz) un izraisa kavitāciju šķidrumos vai suspensijās. Akustiskās kavitācijas laikā veidojas mikroskopiski apgabali ar vakuumam līdzīgu spiedienu un augstu temperatūru, kas saplēš šūnas. Lai gan temperatūra var sasniegt vairākus tūkstošus Celsija grādu, kavitācijas apgabalu tilpumi ir tik mazi, ka tie būtiski nesasilda apstrādājamo materiālu. Ultraskaņas radītā akustiskā kavitācija un bīdes spēki perforē vai pārrauj tādu baktēriju kā E.coli šūnu membrānu. Hielscher ultraskaņas iekārtas ļauj precīzi kontrolēt tādus procesa parametrus kā ultraskaņas intensitāte, amplitūda, ievadītā enerģija un temperatūra. Tādējādi ultraskaņas līzes procesu var optimāli pielāgot šūnu tipam, šūnu kultūrai un procesa mērķim.

Ultraskaņas līzes priekšrocības

precīza līzes kontrole (intensitāte, amplitūda, temperatūra)
uzticami, reproducējami rezultāti
optimāla pielāgošana konkrētiem paraugiem
temperatūras kontrole
ļoti maziem līdz ļoti lieliem paraugiem (no µL līdz litriem)
tikai mehāniska apstrāde
lietotājam draudzīga, droša ekspluatācija
lineāra mēroga palielināšana no laboratorijas līdz ražošanai

Ultraskaņas ierīce VialTweeter ļauj vienlaikus sagatavot paraugus līdz pat 10 flakonos vienādos procesa apstākļos. (Noklikšķiniet, lai palielinātu!)

VialTweeter ultraskaņas līzei

Ultraskaņas homogenizators salīdzinājumā ar citām līzes metodēm

Lai gan ķīmiskā un enzimātiskā līze var būt problemātiska – jo ķīmiskā līze var mainīt olbaltumvielu struktūras un radīt attīrīšanas problēmas, savukārt enzimātiskā līze prasa ilgu inkubācijas laiku un nav reproducējama –, sagraušana ar ultraskaņu ir progresīva, ātra šūnu sagraušanas metode.
Ultraskaņas līze balstās tikai uz mehāniskiem spēkiem. Ķīmiskas vielas netiek pievienotas; apstrāde ar ultraskaņu sagrauj šūnas sienu ar bīdes spēkiem. Ķīmiskā līze var mainīt olbaltumvielu struktūru un radīt attīrīšanas problēmas. Enzimātiskā sagraušana prasa ilgu inkubācijas laiku un nav reproducējama. E.coli baktēriju šūnu sagraušana ar ultraskaņu ir ātra, vienkārša, uzticama un reproducējama. Tāpēc Hielscher ultraskaņas iekārtas izmanto bioloģijas un bioķīmijas laboratorijās visā pasaulē paraugu sagatavošanai, pirmsanalītiskajā posmā, in vitro diagnostikā un daudzveidīgās analīzēs.

Vispārīgi ieteikumi ultraskaņas līzei

Apstrāde ar ultraskaņu ir vispopulārākā metode ļoti mazu, vidēju un lielu šūnu suspensiju daudzumu līzei – no pikolitriem līdz pat 100L/hr (izmantojot ultraskaņas plūsmas šūnu). Šūnas tiek lizētas ar šķidruma bīdes spēkiem un kavitāciju. Apstrādes ar ultraskaņu laikā tiek fragmentēta arī DNS, tāpēc šūnu suspensijai nav nepieciešams pievienot DNāzi.

Temperatūras kontrole E.coli ultraskaņas līzes laikā
Iepriekš atdzesējot paraugu un apstrādes ar ultraskaņu laikā turot to uz ledus, var viegli novērst parauga termisko noārdīšanos.
Ideālā gadījumā līzes laikā paraugi jāuztur ledusauksti, taču lielākajai daļai paraugu pietiek, ja temperatūra nepārsniedz kultūras vai audu avota temperatūru. Tāpēc suspensiju ieteicams turēt uz ledus un apstrādāt ar vairākiem īsiem 5–10 sekunžu ultraskaņas impulsiem un 10–30 sekunžu pauzēm. Paužu laikā siltums var izkliedēties, lai atjaunotos zema temperatūra. Lielākiem šūnu paraugiem ir pieejami dažādi plūsmas šūnu reaktori ar dzesēšanas apvalkiem.
Lasiet šeit detalizētus padomus un ieteikumus veiksmīgai ultraskaņas līzei!

Protokoli E. coli lizātu sagatavošanai ar ultraskaņu

Pētnieki izmanto Hielscher ultraskaņas homogenizatorus E.coli šūnu sagraušanai. Zemāk ir pieejami dažādi pārbaudīti un praksē apstiprināti protokoli E.coli līzei ar Hielscher ultraskaņas homogenizatoriem dažādiem ar E. coli saistītiem lietojumiem.

Šūnu augšana, šķērssaistīšana un E. coli šūnu ekstraktu sagatavošana ar ultraskaņu

SeqA un RNS polimerāzes ChIP-Chip analīzei E. coli MG1655 vai MG1655 ΔseqA audzēja 37°C temperatūrā līdz OD₆₀₀ aptuveni 0,15 50 ml LB barotnes (+ 0,2% glikozes), pēc tam pievienoja 27 μl formaldehīda (37%) uz katru ml barotnes (galīgā koncentrācija 1%). Šķērssaistīšanu veica istabas temperatūrā 20 min, lēni kratot (100 rpm), pēc tam reakciju apturēja ar 10 ml 2,5 M glicīna (galīgā koncentrācija 0,5 M). Karstuma šoka eksperimentiem E. coli MG1655 audzēja 65 ml LB barotnes 30°C temperatūrā līdz OD₆₀₀ aptuveni 0,3. Pēc tam 30 ml kultūras pārnesa iepriekš līdz 43°C uzsildītā kolbā, bet atlikušo daļu turēja 30°C temperatūrā. Šķērssaistīšanu un reakcijas apturēšanu veica, kā aprakstīts iepriekš, izņemot to, ka pirms turpmākas lēnas kratīšanas istabas temperatūrā šūnas 5 min turēja 30 vai 43°C temperatūrā. Šūnas savāca centrifugējot un divreiz mazgāja ar aukstu TBS (pH7.5). Pēc resuspendēšanas 1 ml līzes buferšķīduma (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharozes, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizocīma) un inkubēšanas 37°C temperatūrā 30 min, kam sekoja 4 ml IP buferšķīduma pievienošana, šūnas uz ledus apstrādāja ar ultraskaņu 12 reizes pa 30 sec ar 30 sec pārtraukumiem, izmantojot Hielscher ultraskaņas procesoru UP400St ar 100% jaudas iestatījumu. Pēc centrifugēšanas 10 min pie 9000 g supernatanta alikvotas pa 800 μl glabāja -20°C temperatūrā. (Waldminghaus 2010)

Enzīmu pārprodukcija un attīrīšana ar ultraskaņas zondi

Lai panāktu ar dekahistidīna (His10) marķieri iezīmētu olbaltumvielu pārprodukciju, E. coli BL21(DE3) transformēja ar pET19b konstrukcijām. Pa nakti audzētu priekškultūru savāca centrifugējot, un 1% izmantoja ekspresijas kultūras inokulēšanai. Šūnas, kas saturēja pET19mgtB, audzēja 22°C temperatūrā, līdz optiskais blīvums pie 600 nm (OD600) sasniedza 0,7. Kultūru pārnesa uz 17°C temperatūru, un ekspresiju inducēja ar 100 μM IPTG. Pēc 16 h kultūru savāca centrifugējot pie 7 500 × g 4°C temperatūrā. Šūnas resuspendēja 50 mM fosfātu buferētā fizioloģiskajā šķīdumā (PBS) ar 0,3 M NaCl pie pH 7,4 un sagrāva, apstrādājot ar ultraskaņu ar Hielscher ultraskaņas ierīci UP200St, kas aprīkota ar S2 mikrouzgaļa sonotrodi, pie cikla iestatījuma 0,5 un amplitūdas 75%.
Ar dekahistidīna marķieri iezīmētā GtfC pārprodukciju inducēja 37°C temperatūrā pie OD₆₀₀ 0,6 ar 100 μM IPTG. Pēc tam šūnas inkubēja 4 h, savāca un lizēja, kā iepriekš aprakstīts MgtB gadījumā.
Neattīrītos šūnu ekstraktus centrifugēja pie 15 000 × g 4°C temperatūrā, lai nogulsnētu šūnu atliekas. Dzidrinātos ekstraktus uznesa uz 1-ml HisTrap FF Crude kolonnām, izmantojot ÄKTAprime Plus sistēmu. Enzīmus attīrīja saskaņā ar ražotāja protokolu ar His marķieri iezīmētu olbaltumvielu gradienta eluēšanai. Eluētos olbaltumvielu šķīdumus divreiz dializēja pret 1 000 tilpumiem 50 mM PBS, pH 7,4, ar 0,3 M NaCl 4°C temperatūrā. Attīrīšanu analizēja ar 12% SDS-PAGE. Olbaltumvielu koncentrāciju noteica ar Bredforda metodi, izmantojot Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Olbaltumvielu ekstrakcija no E. coli baktērijām ar ultraskaņu
Interesējošo ēsmas olbaltumvielu (šajā gadījumā Arabidopsis thaliana MTV1) sapludina ar GST marķieri un ekspresē BL21 Escherichia coli (E. coli) šūnās.

Paņemiet pa vienai GST-MTV1 un GST nogulšņu porcijai (kas atbilst 50 ml baktēriju kultūras) un katru resuspendējiet 2,5 mL ledusauksta ekstrakcijas buferšķīduma.
Izmantojiet ultraskaņas ierīci UP100H (kas aprīkota ar MS3 mikrouzgaļa sonotrodi maziem tilpumiem, aptuveni 2–5mL), lai sagrautu baktēriju šūnas līdz to līzei, par ko liecina samazināta duļķainība un palielināta viskozitāte. Tas jāveic uz ledus, un apstrādi ar ultraskaņu ieteicams veikt ar pārtraukumiem (piemēram, 10 sec apstrāde ar ultraskaņu, kam seko 10 sec pauze uz ledus, un tā tālāk). Jāuzmanās, lai apstrādes ar ultraskaņu intensitāte nebūtu pārāk augsta. Ja novēro putošanu vai baltu nogulšņu veidošanos, intensitāte jāsamazina.
Pārnesiet lizēto baktēriju šķīdumu 1,5 mL mikrocentrifūgas stobriņos un centrifugējiet 4°C temperatūrā pie 16 000 x g 20 min.

Ultraskaņas zondes izmanto akustiskās kavitācijas spēkus, lai sagrautu šūnas un ekstrahētu molekulas un DNS no E.coli.

Zondes tipa ultraskaņas ierīces, piemēram, UP400St, izmanto akustiskās kavitācijas darbības principu efektīvai E.coli līzei.

Rekombinantās olbaltumvielas ekspresijas analīze un attīrīšana, izmantojot apstrādi ar ultraskaņu

E. coli šūnu nogulsnes apstrādāja ar Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīci UP100H. Šim nolūkam šūnu nogulsnes resuspendēja atdzesētā līzes buferšķīdumā (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) un 10 min dzesēja uz ledus. Pēc tam šūnu suspensiju apstrādāja ar 10 īsiem, 10 s ilgiem ultraskaņas impulsiem, pēc katra ievērojot 30 s intervālu dzesēšanai. Visbeidzot šūnu atliekas atdalīja, veicot ultracentrifugēšanu 4°C temperatūrā 15 min ar 14 000 rpm. Lai apstiprinātu rPR ekspresiju, supernatantu analizēja ar elektroforēzi 12% poliakrilamīda gelā, SDS-PAGE un Western blot metodi. rPR attīrīja, izmantojot Ni2+-NTA sveķus (Invitrogen, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Šajā posmā izmantoja attīrīšanas metodi natīvos apstākļos. Attīrītā proteīna tīrību novērtēja ar elektroforēzi 12% poliakrilamīda gelā un sekojošu krāsošanu ar Coomassie zilo. Attīrītā proteīna koncentrāciju noteica ar Micro BCA proteīnu noteikšanas komplektu (PIERCE, ASV). (Azarnezhad et al. 2016)

Šajā video parādīta 200 vatu ultraskaņas kausveida sonotrode laboratorijas paraugu disperģēšanai, homogenizēšanai, ekstrakcijai vai degazēšanai.

Ultraskaņas homogenizatori E. coli līzei

Hielscher Ultrasonics projektē, ražo un piegādā augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus uzticamai un efektīvai E. coli baktēriju un citu šūnu tipu, audu un šūnu kultūru līzei.
Plašais ultraskaņas zonžu un netiešās apstrādes ar ultraskaņu sistēmu klāsts ļauj mums piedāvāt jums ideālu ultraskaņas audu homogenizatoru jūsu šūnu sagraušanas un ekstrakcijas pielietojumam.

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Vācijā radīta kvalitāte

Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces ir labi pazīstamas ar saviem visaugstākajiem kvalitātes un projektēšanas standartiem. Vieda programmatūra, intuitīva izvēlne, programmējami iestatījumi un automātiska datu reģistrēšana ir tikai dažas no Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīču funkcijām. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas apstrādes ierīces viegli integrēt pētniecības un biotehnoloģijas iestādēs. Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces viegli darbojas pat skarbos apstākļos un prasīgā vidē.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas apstrādes ierīcēm ar modernākajām tehnoloģijām un ērtu lietošanu. Protams, Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces atbilst CE prasībām un izpilda UL, CSA un RoHs prasības.

Tālāk redzamā tabula sniedz priekšstatu par mūsu ultraskaņas apstrādes ierīču aptuveno apstrādes jaudu:

Partijas tilpums	Plūsmas ātrums	Ieteicamās ierīces
daudziedobju / mikrotitrēšanas plates	n.a.	UIP400MTP
CupHorn flakoniem vai vārglāzei	n.a.	Ultraskaņas CupHorn
ultraskaņas mikroplūsmas reaktors	n.a.	GDmini2
līdz 10 flakoniem ar tilpumu no 0,5 līdz 1,5mL	n.a.	VialTweeter
no 0,5 līdz 1,5mL	n.a.	VialTweeter
no 1 līdz 500mL	no 10 līdz 200mL/min	UP100H
no 10 līdz 2000mL	no 20 līdz 400mL/min	UP200Ht, UP400St
no 0,1 līdz 20L	no 0,2 līdz 4L/min	UIP2000hdT
no 10 līdz 100L	no 2 līdz 10L/min	UIP4000
n.a.	no 10 līdz 100L/min	UIP16000
n.a.	lielāks	grupā savienotas ierīces UIP16000

Sazinieties ar mums! / Jautājiet mums!

Video parādīta ultraskaņas paraugu sagatavošanas sistēma UIP400MTP, kas ļauj uzticami sagatavot paraugus jebkurās standarta daudziedobju platēs, izmantojot augstas intensitātes ultraskaņu. UIP400MTP tipiskie lietojumi ietver šūnu līzi, DNS, RNS un hromatīna fragmentēšanu, kā arī olbaltumvielu ekstrakciju.

Papildu protokoli E. coli līzei ar ultraskaņu

Ar alicīnu modificēti proteīni E. coli šūnās, izmantojot ultraskaņas ierīci VialTweeter

Sulfhidrilgrupu satura noteikšana ar 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoskābes) (DTNB) testu
E. coli MG1655 nakts kultūru izmantoja MOPS minimālās barotnes inokulēšanai (1:100). Kultūru audzēja aerobos apstākļos, līdz A600 sasniedza 0,4. Kultūru sadalīja trīs 15-ml kultūrās pakļaušanai stresa iedarbībai. Neapstrādātu kultūru izmantoja kā negatīvo kontroli. Vienai no abām atlikušajām kultūrām pievienoja 0,79 mM alicīna (128 μg ml-1), bet otrai – 1 mM diamīda. Kultūras inkubēja 15 min. No katras kultūras ar centrifugēšanu savāca šūnas no 5 ml (8 525 × g, 4°C, 10 min). Šūnas divreiz mazgāja ar 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, pirms lietošanas uzglabāts anaerobos apstākļos) un centrifugēja (13 000 × g, 4°C, 10 min). Pirms sagraušanas ar ultraskaņu 4°C temperatūrā šūnas resuspendēja līzes buferšķīdumā (PBS ar 6 mM guanidīnija HCl, pH 7,4) (VialTweeter ultraskaņas ierīce, Hielscher GmbH, Vācija) (3 × 1 min). Šūnu atliekas nogulsnēja centrifugējot (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatantu pārnesa 3,5-ml QS-macro kivetē (10 mm) ar magnētiskā maisītāja stienīti un sajauca ar 1 ml līzes buferšķīduma. Paraugu ekstinkciju uzraudzīja pie 412 nm ar Jasco V-650 spektrofotometru, kas aprīkots ar PSC-718 termostatējamu kivešu turētāju, istabas temperatūrā. Pievienoja 100μl 3 mM ditiobis(2-nitrobenzoskābes) šķīduma. Ekstinkciju uzraudzīja, līdz tā sasniedza piesātinājumu. Tiolu koncentrāciju aprēķināja, izmantojot ekstinkcijas koeficientu ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 tio-2-nitrobenzoskābei (TNB). Tiolu koncentrāciju šūnās aprēķināja, pamatojoties uz E. coli šūnu tilpumu 6,7 × 10^-15 litri un šūnu blīvumu A600 = 0,5 (atbilst 1 × 10⁸ šūnas ml^-1 kultūras). (Müller et al. 2016)

Glutationa noteikšana in vivo, izmantojot ultraskaņas šūnu smalcinātāju

E.coli MG1655 audzēja MOPS minimālajā barotnē ar kopējo tilpumu 200ml, līdz tika sasniegts A600 0,5. Kultūru sadalīja 50-ml kultūrās apstrādei ar stresa faktoriem. Pēc 15 min inkubācijas ar 0,79 mM alicīnu, 1 mM diamīdu vai dimetilsulfoksīdu (kontrole) šūnas savāca, centrifugējot pie 4 000g 4°C temperatūrā 10 min. Šūnas divreiz mazgāja ar KPE buferšķīdumu, pēc tam nogulsnes atkārtoti suspendēja 700µl KPE buferšķīduma. Olbaltumvielu atdalīšanai pievienoja 300l 10% (w/v) sulfosalicilskābes, pēc tam šūnas sagrāva, apstrādājot ar ultraskaņu (3 x 1 min; VialTweeter ultraskaņas ierīce). Supernatantus savāca pēc centrifugēšanas (30 min, 13 000g, 4°C). Sulfosalicilskābes koncentrāciju samazināja līdz 1%, pievienojot 3 tilpumus KPE buferšķīduma. Kopējā glutationa un GSSG mērījumus veica, kā aprakstīts iepriekš. Glutationa koncentrāciju šūnās aprēķināja, pamatojoties uz E. coli šūnu tilpumu 6,7×10^-15 litri un šūnu blīvumu A600 0,5 (atbilst 1×10⁸ šūnas ml^-1 kultūras). GSH koncentrācijas aprēķināja, atņemot 2[GSSG] no kopējā glutationa. (Müller et al. 2016)

Cilvēka mAspAT ekspresija E. coli, izmantojot ultraskaņas homogenizatoru

Vienu E. coli BL21 (DE3) koloniju, kas satur ekspresijas vektoru, kultivēja 30 mL Luria-Bertani (LB) barotnes, kas satur 100μg/mL ampicilīna, 37ºC temperatūrā, līdz optiskais blīvums (OD₆₀₀) sasniedza 0,6. Šūnas savāca, centrifugējot pie 4 000 × g 10 min, un atkārtoti suspendēja 3L svaigas LB barotnes, kas satur 100μg/mL ampicilīna.
Pēc tam olbaltumvielas ekspresiju inducēja ar 1 mM izopropil-β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozīdu (IPTG) 20 h 16ºC temperatūrā. Šūnas savāca, centrifugējot pie 8 000 × g 15 min, un mazgāja ar buferšķīdumu A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). No 3 L kultūras ieguva aptuveni 45g šūnu (mitrā masa). Pēc centrifugēšanas šūnu nogulsnes atkārtoti suspendēja 40 mL (uz 1 L kultūras) ledusauksta ekstrakcijas buferšķīduma A un lizēja ledusaukstā temperatūrā, apstrādājot ar ultraskaņu ar Hielscher ultraskaņas šūnu smalcinātāju UP400St. Šūnu lizātu centrifugēja pie 12 000 rpm 15 min, lai atdalītu šķīstošo frakciju (supernatantu) un nogulsnēto frakciju (nogulsnes). (Jiang et al. 2015)

Saistītās tēmas

Noderīgi fakti

E.coli

Escherichia coli (E. coli) ir gramnegatīva, fakultatīvi anaeroba, nūjiņveida koliforma Escherichia ģints baktērija, kas parasti sastopama siltasiņu organismu (endotermu) zarnu apakšējā daļā. Pastāv daudz E. coli celmu (vai apakštipu) ar dažādām īpašībām. Lielākā daļa E. coli celmu cilvēkiem ir nekaitīgi, piemēram, B un K-12 celmi, kurus laboratorijās bieži izmanto pētniecībā. Tomēr daži celmi ir kaitīgi un var izraisīt nopietnas slimības.
E. coli ir nozīmīga loma mūsdienu bioinženierijā un rūpnieciskajā mikrobioloģijā, jo ar šo baktēriju ir viegli manipulēt. E. coli bieži izmanto laboratorijās, piemēram, rekombinantās dezoksiribonukleīnskābes (DNS) veidošanai vai kā modeļorganismu.
E. coli ir ļoti daudzpusīgs saimniekorganisms heterologu olbaltumvielu ražošanai, un rekombinanto olbaltumvielu ražošanai E. coli šūnās ir pieejamas daudzas olbaltumvielu ekspresijas sistēmas. Izmantojot plazmīdas, kas nodrošina augstu olbaltumvielu ekspresijas līmeni, baktērijās var ievadīt gēnus, tādējādi ļaujot rūpnieciskās fermentācijas procesos ražot šādas olbaltumvielas lielos daudzumos.
E.coli izmanto kā šūnu fabrikas insulīna ražošanai. Citi lietojumi ietver modificētu E. coli šūnu izmantošanu vakcīnu un imobilizētu enzīmu izstrādei un ražošanai, biodegvielu ražošanai, kā arī bioremediācijai.
K-12 celms ir E. coli mutanta forma, kurā notiek pastiprināta enzīma sārmainās fosfatāzes (ALP) ekspresija. Šī mutācija rodas defekta dēļ gēnā, kas pastāvīgi kodē šo enzīmu. Ja gēns veido produktu bez jebkādas inhibīcijas, to sauc par konstitutīvu aktivitāti. Šo konkrēto mutanta formu izmanto ALP enzīma izolēšanai un attīrīšanai.
E. coli baktērijas plaši izmanto arī kā šūnu fabrikas. Inženiertehniski pārveidotus mikroorganismus (piemēram, baktērijas) un augu šūnas var izmantot kā tā dēvētās šūnu fabrikas. Šīs ģenētiski modificētās šūnas ražo molekulas, ķīmiskas vielas, polimērus, olbaltumvielas un citas vielas, kuras izmanto, piemēram, farmācijas, pārtikas un ķīmiskajā rūpniecībā. Lai atbrīvotu šādu bioinženierijas ceļā pārveidotu šūnu iekšienē saražotās molekulas, šūnapvalku sagraušanai un mērķvielu pārnešanai apkārtējā šķidrumā bieži izmanto ultraskaņas līzi. Lasiet vairāk par bioinženierijas ceļā pārveidotu šūnu līzi!

DNS fragmentēšana ar ultraskaņas bīdes spēkiem

Ultraskaņas bīdes spēku izmantošana ir izplatīta metode molekulu, organoīdu un olbaltumvielu atbrīvošanai no šūnas iekšienes, kā arī DNS pavedienu sadalīšanai fragmentos. Akustiskā kavitācija sagrauj šūnapvalkus un membrānas, lai no šūnām ekstrahētu DNS un iegūtu aptuveni 600–800 bp garus fragmentus, kas ir ideāli piemēroti analīzei.
Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk par ultraskaņas homogenizatoriem DNS fragmentēšanai!

Literatūra / Atsauces

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Augstas veiktspējas ultraskaņas tehnoloģija! Hielscher produktu klāsts aptver visu spektru – no kompakta laboratorijas ultraskaņas aparāta un galda ierīcēm līdz pilna rūpnieciskā mēroga ultraskaņas sistēmām.

Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no laboratorijas mēroga līdz rūpnieciskam mērogam.