Hielscher ultraskaņas tehnoloģija

E. Coli ultraskaņas liza

  • E. coli baktērijas ir visbiežāk lietotās baktērijas mikrobioloģijā un biotehnoloģijā.
  • Ultraskaņas šūnu disruptori nodrošina uzticamus un reproducējot E. coli līzes rezultātus.
  • Intensīvi, bet precīzi kontrolējamais kavitācija un bīdes spēki rada pilnīgas darbības traucējumus un augstu ekstrakcijas ražu (piemēram, olbaltumvielas, DNS).

Šūnu traucējumi, kavitācija

Escherichia coli baktērijas ir precīzi lizētas, izmantojot ultraskaņas audu homogenizatori.Ultraskaņas zondes tipa homogenizatori darbojas ar aptuveni 20 000 cikliem sekundē (pie 20kHz) un izraisa kavitāciju šķidrumos vai guļus stāvoklī. Akustiskā kavitācija mikroskopiskās vietās vakuuma līdzīgu spiedienu un augstas temperatūras, kas saplīst šūnas intervālu. Lai gan temperatūra var sasniegt vairākus tūkstošus grādiem pēc Celsija, kavitāciju apjomi ir tik mazi, ka tie nav sakarst process ievērojami. Ultraskaņas radīts akustiskais kavitācija un bīdes spēki perforē vai salauž E. coli šūnu membrānu – atkarībā no ultraskaņas homogenizatora ierīces iestatījuma.

Ultraskaņas līzes priekšrocības

  • precīza līzes (intensitātes, amplitūdas, temperatūras) kontrole;
  • optimālu pielāgošanu konkrētiem paraugiem
  • temperatūras kontrole
  • ļoti maziem līdz ļoti lieliem paraugiem (ģl līdz litros)
  • tīra mehāniska apstrāde
  • lineārais mērogs no laboratorijas līdz ražošanai
Ultraskaņas ierīce VialTweeter nodrošina vienlaicīgu paraugu sagatavošanu līdz 10 flakoniem ar vienādiem procesa nosacījumiem. (Noklikšķiniet, lai palielinātu!)

VialTweeter Ultraskaņas līzes

Informācijas pieprasījums




Ņemiet vērā, ka mūsu Privātuma politika.


Kaut arī ķīmiskā un enzymtic sabrukšana var būt problemātiska – tā kā ķīmiskā līze var izmainīt olbaltumvielu struktūru un ieviest attīrīšanas problēmas un fermentatīvā līzes prasa ilgu inkubācijas laiku un nav reproducējamās – Ultraskaņas traucējumi ir sarežģīta, ātra šūnu pārtraukšanas metode.
Ultraskaņas sabrukšana ir balstīta tikai uz mehāniskiem spēkiem. Nav ķimikāliju pievienošanas, ultraskaņas pauzes šūnu sienas ar bīdes spēkiem. Ķīmiskā līze var mainīt olbaltumvielu struktūru un ieviest attīrīšanas problēmas. Fermentatīvi traucējumi prasa ilgu inkubācijas laiku un nav reproducējami. E.coli baktēriju šūnu ultraskaņas šūnu pārtraukums ir ātrs, vienkāršs, uzticams un reproducējams. Tāpēc Hielscher ultrasonicators tiek izmantoti bioloģiskās un bioķīmiskajās laboratorijās visā pasaulē paraugu sagatavošanai, pirms ananītismiskiem, in-vitro diagonstics un kolektora testiem.

Vispārēji ieteikumi

UP400St ultrasonikators ar plūsmas reaktoruSonication ir populārākā tehnika, lai šanā ļoti maza, vidēja un liela daudzuma šūnu suspensijas – no Pico-litriem līdz 100L/h (izmantojot ultraskaņas plūsmas šūnu). Šūnas ir šķīdināts fibrīns ar šķidro bīdes un kavitāciju. DNS ir arī apcirstām laikā ultraskaņas, tāpēc nav nepieciešams pievienot dnase uz šūnu apturēšanu.
Temperatūras kontrole:
Pirms parauga atdzesēšanas un parauga turēšanas ultraskaņas laikā uz ledus, parauga termisko degradāciju var viegli novērst.
Ideālā gadījumā paraugi līzes laikā jātur ledus aukstums, bet lielākajai daļai paraugu pietiek, ja temperatūra nepacelsies virs kultūras vai audu avota temperatūras. Tāpēc ir ieteicams, lai saglabātu apturēšanu uz ledus un īsu ar vairākiem īsiem Ultrasonics impulsus 5-10 SEC un pauzes no 10-30 sek. Laikā pauzes, siltums var izkliedēt, lai atjaunotu zemu temperatūru. Lielākiem šūnu paraugiem ir pieejami dažādi plūsmas šūnu reaktori ar dzesēšanas žaketes.

Protokoli, lai sagatavotu E. coli Lysates

Rekombinantā proteīna ekspresijas analīze un attīrīšana

E. coli ekstrakta koncentrāta apstrāde ar ultraskaņas sistēmu UP100H (Hielscher). Šim nolūkam šūnu granulu atkārtoti saskaloja atdzesētā līzes buferšķīdumā (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) un atdzesē uz ledus 10 min. Tad, šūnu suspensija bija apstrādāt ultraskaņu ar 10 īsiem pārrāvumi 10 s, kam seko intervāls 30 s dzesēšanai. Visbeidzot, šūnu gruži tika izņemti, ultracentrifugējot pie 4 ° c 15 min pie 14000 apgr./min. Lai apstiprinātu rPR ekspresiju, centrifugātu izmanto 12% poliakrilamīda gela un analizē ar SDS-PAGE un Western blotting. Attīrīšanas rPR tika darīts, izmantojot nino 2 līdz-NTA sveķi (Invitrogen, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Šajā posmā tika izmantota vietējā attīrīšanas metode. Attīrītā proteīna tīrību vērtēja, izmantojot elektroforēzi ar 12% poliakrilamīda gelu un sekojošu Coomassie Blue krāsošanu. Attīrīta olbaltumvielu koncentrācija tika mērīta pēc Micro BCA proteīna testa komplekta (PIERCE, ASV). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultraskaņas šūnu disruptor UP100H (100W) līzes, šūnu traucējumus un DNS nobīdes.

Ultraskaņas homogenizators UP100H 100W

Šūnu augšana, crosslinking un sagatavošana E. coli šūnu ekstrakti

Attiecībā uz SeqA un RNS polimerāzes mikroshēmu-chip E. coli MG1655 vai MG1655 ΔseqA tika audzētas 37 ° c līdz OB600. no aptuveni 0,15 50 ml LB (+ 0,2% glikoze) pirms 27 μl formaldehīda (37%) (galīgā koncentrācija 1%). Crosslinking tika veikta ar lēnu kratīšanu (100 apgr./min.) istabas temperatūrā 20 min, kam sekoja 10 ml 2,5 M glicīna (galīgā koncentrācija 0,5 M). Attiecībā uz karstuma šoka eksperimentiem E. coli MG1655 izaudzē 65 ml LB barotnē 30 ° c līdz OB600. aptuveni 0,3. Pēc tam 30 ml kultūras pārnes uz iepriekš uzsildītā kolbā 43 ° c un atlikušo temperatūru 30 ° c. Crosslinking un slāpē bija, kā aprakstīts iepriekš, izņemot to, ka šūnas tika turēti 30 vai 43 ° c uz 5 min pirms vēl lēni kratot istabas temperatūrā. Šūnas tika savāktas centrifugējot un divreiz nomazgā ar aukstu TBS (pH 7.5). Pēc saskalošanas 1 ml līzes buferšķīdumā (10 mm tris (pH 8,0), 20% saharozes, 50 mm NaCl, 10 mm EDTA, 10 mg/ml lizocīma) un inkubācijas 37 ° c temperatūrā 30 min, kam seko 4 ml IP buferšķīduma pievienošana, šūnas apstrādāt ultraskaņu uz ledus ar 12 reižu 30 sek un 30 sek pārtraukumiem ieturēt UP400St Ultraskaņas procesors (hielscher ultrasonics GmbH) ar 100% jaudu. Pēc centrifugēšanas 10 min pie 9000 g, 800 ģl centrifugātu uzglabā-20 ° c temperatūrā. (Waldminghaus 2010)

Pārprodukcija un attīrīšana fermentu.

Par pārprodukciju decahistidīna (His10)-tagged olbaltumvielas, E. coli BL21 (DE3) tika pārveidots ar pET19b konstrukcijas. Nakts pirmskultūra tika ievākta centrifugējot, un 1% tika izmantoti, lai inokulētu izteiksmes kultūru. Šūnas, kas pārvadā pET19mgtB, tika audzētas 22 ° c temperatūrā, līdz 600 nm (OD600.) 0,7. Kultūra tika pārnests uz 17 ° c un inducēja 100 μM IPTG. Pēc 16 stundām kultūru novāc centrifugējot pie 7 500 × g 4 ° c temperatūrā. Šūnas tika atkārtoti suspendētas 50 mM fosfāta buferšķīdumā (PBS) ar 0,3 M NaCl pie pH 7,4 un iztraucēja ar ultraskaņu ar S2 mikro-tip sonotrode pie UP200St ultraskaņotājs (Hielscher, Teltow, Vācija) ciklā 0,5 un amplitūda 75%.
Par decahistidīns-tagged GtfC tika inducēta pie 37 ° c pie OB600. 0,6 ar 100 μM IPTG. Tad šūnas tika inkubētas 4 stundas, novāktas un noārda, kā norādīts iepriekš attiecībā uz MgtB.
Neapstrādāti šūnu ekstrakti tika centrifugēti ar 15 000 × g un 4 ° c, lai nogulsnē šūnu gružus. Dzidrās ekstrakti tika iekrauti 1 ml HisTrap FF Crude kolonnas izmantojot sistēmu ÄKTAprime plus (GE Healthcare). Fermenti tika attīrīti saskaņā ar ražotāja protokolu par viņa tagged olbaltumvielu gradientu eluēšanu. Eluēti olbaltumvielu šķīdumi tika divreiz dializēti, salīdzinot ar 1 000 tilpuma 50 mM PBS, pH 7,4, ar 0,3 M NaCl 4 ° c temperatūrā. Attīrīšana tika analizēta par 12% SDS-PAGE. Proteīna koncentrācija tika noteikta ar Bradford metodi, izmantojot Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsrūe, Vācija). (Rabausch et al. 2013)

Proteīna ekstrakcija no E. coli baktērijām
Procentu ēsmas proteīnu (šajā gadījumā MTV1 Arabidopsis thaliana) tiek kausēts uz GST tagu un izteikts BL21 Escherichia coli (E. coli) šūnās.
1. ņem vienu granulveida GST-MTV1 un GST (kas atbilst 50 ml baktēriju kultūrām) un atkārtoti suspendē katru 2,5 mL ledus aukstā ekstrakcijas buferšķīduma.
2. Izmantojiet ultrasonikatoru. UP100H (aprīkots ar MS3 microtip-sonotrode nelieliem tilpumiem (2-5mL)), lai sagrautu baktēriju šūnas, līdz tās tiek liktas, kas ir norādīta ar samazinātu dūmainību un palielinātu viskozitāti. Tas ir jāveic uz ledus, un ir ieteicams ar ultraskaņu periodiski (piem., 10 sek sonicating, kam seko 10 sek uz ledus utt.). Jāuzmanās, lai netiktu veikta ultraskaņas apstrāde ar pārāk augstu intensitāti. Ja tiek konstatēta putošanās vai ir atklātas baltas nogulsnes, intensitāte ir jāsamazina.
3. pārnes lizēto baktēriju šķīdumu uz 1,5 mL mikrocentrifūgas mēģenēm un centrifugē 4 ° c temperatūrā, 16 000 x g 20 min.

Alicīna modificētie proteīni E. coli

VialTweeter ir ērts ultraskaņotājs mazu paraugu homogenizācijasSulfhidrila satura noteikšana par 5,5 ′-Ditiobis (2-nitrobenzoskābe) (DTNB) tests
E. coli MG1655 nakti kultūra tika izmantota, lai inokulētu MOPS minimālu barotni (1:100). Kultūra tika audzētas aerobi līdz A600 0,4 tika sasniegts. Kultūra tika sadalīta 3 15-ml kultūrām stresa ārstēšanai. Neapstrādāta kultūra kalpoja kā negatīva kontrole. 0,79 mM allicin (128 ģg ml-1) vai 1 mM diamīdu pievienoja vienai no atlikušajām divām kultūrām. Kultūras inkubēja 15 minūtes. 5 ml katras kultūras tika ievāktas centrifugēšanas gaitā (8 525 × g, 4 ° c, 10 min). Šūnas divreiz izskaloja ar 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 2 mM KH2Po4, pH 7,4, pirms lietošanas uzglabātā anaerobos apstākļos) un centrifugēta (13 000 × g, 4 ° c, 10 min). Šūnas tika saskalotas līzes buferšķīdumā (PBS ar 6 mM guanidīnija HCl, pH 7,4) pirms pārtraukuma 4 ° c temperatūrā, ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Vācija) (3 × 1 min). Šūnu gruži tika granulēti, tos centrifugējot (13 000 × g, 4 ° c, 15 min). Centrifugātu pārnes uz 3,5-ml q-makrokivetes (10 mm) ar magnētisko maisīšanas joslu un sajauc ar 1 ml līzes buferšķīduma. Paraugu dzēšanu uzraudzīja pie 412 nm ar Jasco V-650 spektrofotometru, kas aprīkots ar PSC-718 temperatūras kontrolēto šūnu turētāju (Jasco) istabas temperatūrā. tika pievienotas 100 μl 3 mM ditiobis (2-nitrobenzoskābes) šķīdums. Izmiršana tika kontrolēta, līdz tā sasniedza piesātinājumu. Tiola koncentrācijas aprēķināšana tika veikta, izmantojot ekstinkcijas koeficientu ε.412. = 13 700 M-1 Cm-1 par thio-2-nitrobenzoskābi (TNB). Šūnu tiola koncentrācija tika aprēķināta, pamatojoties uz tilpumu E. coli šūnu 6,7 × 10-15 litru un šūnu blīvumu A600. = 0,5 (atbilst 1 × 108 šūnu skaits ml-1 kultūras jomā). (Müller et al. 2016)

In vivo Glutathione noteikšana

E. coli MG1655 tika audzēta MOPS minimālisma barotnē ar kopējo tilpumu 200 ml minūtē, līdz A600. 0,5 tika sasniegta. Kultūra tika sadalīta 50-ml kultūrām stresa ārstēšanai. Pēc 15 minūšu inkubācijas ar 0,79 mM alicīnu, 1 mM diamīdu vai dimetilsulfoksīdu (kontroli), šūnas 10 minūtes novāc ar 4000 g, 4 ° c temperatūrā. pirms granulu suspenēšanas kivetes divas reizes skalo ar KPE buferšķīdumu 700 μl KPE buferšķīduma. Attiecībā uz deproteinācijas, 300L 10% (w/v) sulfosalicilskābi tika pievienotas pirms šūnu pārrāvumu ar ultrasonication (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants tika savākts pēc centrifugēšanas (30 min, 13, 000G, 4 ° c). Sulfosalicilskābes koncentrācija samazinājās līdz 1%, pievienojot 3 tilpumus KPE buferšķīdumā. Kopējās glutationa un GSSG mērījumi tika veikti, kā aprakstīts iepriekš. Celulāro glutationa koncentrāciju aprēķināja, pamatojoties uz tilpumu E. coli šūnu 6,7×10-15 litru un šūnu blīvumu A600. 0.5 (atbilst 1×108 šūnu skaits ml-1 kultūras jomā). GSH koncentrācijas aprēķināja, no kopējās glutationa atņemot 2 [GSSG]. (Müller et al. 2016)

Ultraskaņas disruptors šūnu līzei un bioloģiskā materiāla ekstrakcijai (noklikšķiniet, lai palielinātu!)

Zondes tipa ultrasonikators UP400St

Human mAspAT izpausme E. coli

Ultraskaņas šūnu disruptors UP400St (400W) intracelulārās vielas iegūšanai (piemēram, proteīni, organelles, DNS, RNS utt.)Viena kolonija E. coli BL21 (DE3), kas ietver ekspresijas vektora 30 mL Luria-Bertani (LB) barotni, kas satur 100μg/mL ampicilīna, un pēc tam audzē 37 ° C temperatūrā, līdz optiskais blīvums (OB600.) sasniedza 0,6. Šūnas tika novāktas, centrifugējot 10 minūtes ar 4 000 × g, un atkārtoti suspendē 3L svaiga LB vidē, kas satur 100 μg/mL ampicilīna.
Pēc tam tika inducēta olbaltumvielu ekspresija ar 1 mM izopropilā-ᴅ- -1-tiogalaktopikranozīdu (IPTG) 20 h pie 16 º C. Šūnas novāc centrifugējot 15 minūtes ar 8 000 × g un mazgā ar buferšķīdumu A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Aptuveni 45 g (mitrās masas) šūnas tika iegūtas no 3 L kultūras. Pēc centrifugēšanas šūnu granulas tika atkārtoti suspendētas 40 mL (1 L kultūrai) ledus aukstā ekstrakcijas buferšķīdumā A un, izmantojot ultrasonikāciju ledus aukstā temperatūrā, UP400St (Dr. Hielscher GmbH, Vācija). Šūnu sabrukšanu centrifugēja pie 12 000 apgriezieniem minūtē 15 minūtes, lai atdalītu šķīstošo (centrifugātu) un nogulsnētu (ekstrakta koncentrāta) frakcijas. (Jiang et al. 2015)

Zemāk redzamā tabula sniedz norādes par mūsu ultraskaņas aparātu aptuveno apstrādes jaudu:

partijas apjoms Plūsmas ātrums Ieteicamie ierīces
0.5 līdz 1.5mL nav | VialTweeter
1 līdz 500mL 10 līdz 200 ml / min UP100H
10 līdz 2000mL 20 līdz 400 ml / min UP200Ht, UP400St
0.1 līdz 20L 0.2 līdz 4 l / min UIP2000hdT
10 līdz 100 l 2 līdz 10 l / min UIP4000
nav | 10 līdz 100 l / min UIP16000
nav | lielāks klasteris UIP16000

Sazinies ar mums! / Uzdot mums!

Lūdzu, izmantojiet zemāk esošo veidlapu, ja vēlaties pieprasīt papildu informāciju par ultraskaņas homogenizāciju. Mēs priecāsimies piedāvāt jums ultraskaņas sistēmu, kas atbilst jūsu prasībām.









Lūdzu, ņemiet vērā mūsu Privātuma politika.


Literatūra / Literatūras saraksts



Fakti ir vērts zināt

E. coli

Escherichia coli (E. coli) ir Gram-negatīvs, facultatively anaerobās, stieņa formas, koliformas baktērija no Escherichia ģints, kas parasti atrodas siltām zarnām organismiem (endotermiem). Ir liels skaits E. coli celmu (vai apakštipu) ar atšķirīgām īpašībām. Lielākā daļa E. coli celmu ir nekaitīgi cilvēkiem, piemēram, B un K-12 celmiem, ko parasti izmanto pētnieciskiem pielietojumiem laboratorijās. Tomēr daži celmi ir kaitīgi un var izraisīt nopietnu saslimšanu.
E. coli ir liela nozīme mūsdienu bioloģiskajās inženierzinātnēs un industriālajā mikrobioloģijā, jo baktērijas ir viegli manipulēt. Bieži lietota laboratorijas lietojumprogramma, kas bieži ietver E. coli izmantošanu, piemēram, lai izveidotu rekombinanto dezokribonukleīnskābi (DNS) vai darbotos kā modeļa organisms.
E. coli ir ļoti daudzpusīga heterologu proteīnu ražošanas saimniekviela, un kolektora proteīnu ekspresijas sistēmas ir pieejamas rekombinanto proteīnu E. coli ražošanai. Izmantojot plazmīdas, kas pieļauj augsta līmeņa olbaltumvielu ekspresiju, baktērijas var ievest baktērijās, kas ļauj ražot šādus proteīnus lielā daudzumā rūpnieciskās fermentācijas procesos.
E. coli tiek izmantotas kā šūnu rūpnīcas insulīna ražošanai. Papildu lietojumi ietver modificētu E. coli šūnu izmantošanu, lai izstrādātu un ražotu vakcīnas un imoreizētos enzīmus, ražotu biodegvielu, kā arī bioattīrīšanai.
Celms K-12 ir mutants forma E. coli, ka pārāk izsaka enzīmu sārmainās fosfatāzes (ALP). Šī mutācija rodas sakarā ar gēnu, kas pastāvīgi kodē enzīmu, defektu. Ja gēns ražo produktu bez kavēšanas, to dēvē par Konstitutīvo aktivitāti. Šī īpašā mutantu forma tiek izmantota izolācijai un attīrīšanas ALP fermentu.

Ultraskaņas DNA Nobīdes

Ultraskaņas bīdes spēki ir parasti izmanto metodi, lai atdalītu no šūnas un pauze DNS dzīslas gabalos. Akustiskā kavitācija pārtraukumiem šūnu sienām un membrānām, lai iegūtu DNS no šūnām un radīt fragmentus apmēram 600 – 800 BP garumā, kas ir ideāli piemērots analīzei.
Spiediet šeit, lai uzzinātu vairāk par ultraskaņas homogenizētājiem DNS sadrumstalotībai!