E. Coli ultraskaņas liza

  • E. coli baktērijas ir visbiežāk lietotās baktērijas mikrobioloģijā un biotehnoloģijā.
  • Ultraskaņas šūnu disruptori nodrošina uzticamus un reproducējot E. coli līzes rezultātus.
  • Intensīvi, bet precīzi kontrolējamais kavitācija un bīdes spēki rada pilnīgas darbības traucējumus un augstu ekstrakcijas ražu (piemēram, olbaltumvielas, DNS).

Kāpēc vēlamā metode ir E. coli ultraskaņas šūnu darbības traucējumi?

Ultraskaņas homogenizatori vai zondes tipa ultrasonikatori piedāvā vairākas priekšrocības E. coli līzei, jo intensīva ultraskaņa efektīvi traucē šūnu sienas un membrānas. Zondes tipa ultrasonikatori tiek plaši izmantoti E. coli līzei šādu iemeslu dēļ:

  • Efektīvi šūnu sienu traucējumi: E. coli ir puscieta šūnu siena, kas sastāv no peptidoglikāna, kuru var būt grūti salauzt, izmantojot tradicionālās līzes metodes. Zondes tipa ultrasonikators rada intensīvus ultraskaņas viļņus, kas rada kavitācijas burbuļus šķidrumā, kas ieskauj šūnas. Kad šie burbuļi sabrūk, tie rada ātrgaitas šķidruma strūklas un triecienviļņus, kas izraisa mehāniskus šūnu sieniņu traucējumus, efektīvi atbrīvojot šūnu saturu, piemēram, biomolekulas.
  • Uzlabota iespiešanās: Zondes / sonotroda radītie ultraskaņas viļņi var iekļūt dziļi paraugā, sasniedzot lielāku skaitu E. coli šūnu un vienmērīgi apstrādājot tos. Tas palīdz nodrošināt, ka līze ir vienmērīgāka visā paraugā, kā rezultātā palielinās šūnu darbības traucējumu efektivitāte.
  • Samazināts apstrādes laiks: Zondes tipa ultrasonikatora piegādātā enerģija ir ļoti koncentrēta un lokalizēta, kas noved pie ātras un efektīvas šūnu līzes. Salīdzinot ar citām metodēm, piemēram, pērlīšu pukstēšanu vai fermentatīvo līzi, ultraskaņas apstrāde var sasniegt E. coli līzi dažu minūšu vai pat sekunžu laikā. Lai gan daudzām alternatīvām metodēm, piemēram, sasaldēšanai-atkausēšanai, ir nepieciešamas vairākas ārstēšanas kārtas, ultraskaņas līze atver šūnas vienā procesa posmā.
  • Temperatūras kontrole: Mūsdienīgākie ultrasonikatori ir aprīkoti ar temperatūras sensoriem un viedu programmatūru, kas ļauj iestatīt maksimālo procesa temperatūru. Ultrasonicator automātiski apstājas, kad tiek sasniegta temperatūras robeža, un sāk ultraskaņas procesu, kad tiek sasniegts iestatītais temperatūras punkts. Paraugu atdzesēšana ledus vannā ir vienkārša metode, lai uzturētu zemu parauga temperatūru un novērstu karstuma izraisītu parauga noārdīšanos.
  • Mērogojamība: Zondes tipa ultrasonikatori ir pieejami dažādos izmēros, sākot no rokas ierīcēm līdz liela mēroga rūpnieciskiem modeļiem. Tas padara tos piemērotus nelielu apjomu apstrādei laboratorijā vai paplašināšanai lielākiem bioapstrādes lietojumiem, piemēram, vakcīnu ražošanai vai molekulu biosintēzei.
  • Daudzpusība: Ultrasonicators var izmantot dažādiem lietojumiem ārpus šūnu līzes, piemēram, DNS nobīdes, olbaltumvielu ekstrakcijas, audu homogenizācijas, nanodaļiņu dispersijas un emulgācijas. Tāpēc ieguldījumi zondes tipa ultrasonikatorā nodrošina daudzpusību pētniecībā vai rūpnieciskos apstākļos.
  • Zondes tipa ultrasonikatori, piemēram, UP200St, ir uzticami audu homogenizatori un šūnu drupinātāji, tāpēc tos plaši izmanto paraugu sagatavošanai ģenētikā, piemēram, E.coli līzei

    Olbaltumvielu ekstrakcija no E.coli šūnām tiek efektīvi veikta ar ultraskaņas zonde UP200St

    Zondes tipa ultrasonicator piedāvā daudzas priekšrocības E. coli līzei. Uzticama un precīza ultraskaņas procesa parametru kontrole ļauj optimizēt darbības parametrus, piemēram, jaudu, ilgumu un paraugu apstrādi, lai sasniegtu vēlamos rezultātus.
     

    Informācijas pieprasījums




    Ņemiet vērā, ka mūsu Privātuma politika.


     

    Šī apmācība izskaidro, kāda veida sonikators ir vislabākais jūsu paraugu sagatavošanas uzdevumiem, piemēram, līzei, šūnu darbības traucējumiem, olbaltumvielu izolācijai, DNS un RNS sadrumstalotībai laboratorijās, analīzei un pētniecībai. Izvēlieties savam pieteikumam ideālo ultraskaņas veidu, parauga tilpumu, parauga numuru un caurlaidspēju. Hielscher Ultrasonics ir ideāls ultraskaņas homogenizators jums!

    Kā atrast perfektu Sonicator šūnu darbības traucējumiem un olbaltumvielu ekstrakcijai zinātnē un analīzē

    Video sīktēls

    Ultraskaņas DNS fragmentācija bieži tiek izmantota kā paraugu sagatavošanas solis nākamās paaudzes sekvencēšanā (NGS)

    E. coli EDL933 genoma DNS elektroforētiskās analīzes pakļautas 0 – 15 min ultrasonikācijai. L norāda DNS kāpnes.
    (pētījums un attēls: ©Basselet et al. 2008)

    Šūnu darbības traucējumi, izmantojot ultraskaņas kavitāciju

    Ultraskaņas zondes tipa homogenizatori darbojas ar aptuveni 20 000 cikliem sekundē (pie 20 kHz) un izraisa kavitāciju šķidrumos vai suspensijās. Akustiskā kavitācija mikroskopiskas vietas ar vakuumam līdzīgu spiedienu un augstu temperatūru, kas saplēš šūnas. Lai gan temperatūra var sasniegt vairākus tūkstošus grādu pēc Celsija, kavitācijas apjomi ir tik mazi, ka tie būtiski neuzsilda procesu. Ultraskaņas radītie akustiskie kavitācijas un bīdes spēki perforē vai izjauc baktēriju šūnu, piemēram, E.coli, šūnu membrānu. Hielscher ultrasonikatori ļauj precīzi kontrolēt procesa parametrus, piemēram, ultraskaņas intensitāti, amplitūdu, enerģijas ievadi un temperatūru. Tādējādi ultraskaņas līzes procesu var optimāli pielāgot šūnu tipam, šūnu kultūrai un procesa mērķim.
     

    Ultraskaņas līzes priekšrocības

    • precīza līzes (intensitātes, amplitūdas, temperatūras) kontrole;
    • ticami, reproducējami rezultāti
    • optimālu pielāgošanu konkrētiem paraugiem
    • temperatūras kontrole
    • ļoti maziem līdz ļoti lieliem paraugiem (ģl līdz litros)
    • Tīri mehāniska apstrāde
    • Lietotājam draudzīga, droša ekspluatācija
    • lineārais mērogs no laboratorijas līdz ražošanai
    Ultraskaņas ierīce VialTweeter nodrošina vienlaicīgu paraugu sagatavošanu līdz 10 flakoniem ar vienādiem procesa nosacījumiem. (Noklikšķiniet, lai palielinātu!)

    VialTweeter Ultraskaņas līzes

    Informācijas pieprasījums




    Ņemiet vērā, ka mūsu Privātuma politika.


    Ultraskaņas homogenizators vs Citas līzes metodes

    Lai gan ķīmiskā un fermentatīvā līze var būt problemātiska – tā kā ķīmiskā līze var izmainīt olbaltumvielu struktūru un ieviest attīrīšanas problēmas un fermentatīvā līzes prasa ilgu inkubācijas laiku un nav reproducējamās – Ultraskaņas traucējumi ir sarežģīta, ātra šūnu pārtraukšanas metode.
    Ultraskaņas līze balstās tikai uz mehāniskiem spēkiem. Ķimikālijas netiek pievienotas, ultraskaņas apstrāde izjauc šūnu sienu ar bīdes spēkiem. Ķīmiskā līze var mainīt olbaltumvielu struktūru un radīt attīrīšanas problēmas. Fermentatīviem traucējumiem ir nepieciešams ilgs inkubācijas laiks, un tie nav reproducējami. E.coli baktēriju šūnu ultraskaņas šūnu darbības traucējumi ir ātri, vienkārši, uzticami un reproducējami. Tāpēc Hielscher ultrasonikatori tiek izmantoti bioloģiskajās un bioķīmiskajās laboratorijās visā pasaulē paraugu sagatavošanai, pirms analītiskiem līdzekļiem, in vitro diagonstikai un kolektoru testiem.

    Vispārīgi ieteikumi ultraskaņas līzei

    Sonication ir populārākā tehnika, lai šanā ļoti maza, vidēja un liela daudzuma šūnu suspensijas – no Pico-litriem līdz 100L/h (izmantojot ultraskaņas plūsmas šūnu). Šūnas ir šķīdināts fibrīns ar šķidro bīdes un kavitāciju. DNS ir arī apcirstām laikā ultraskaņas, tāpēc nav nepieciešams pievienot dnase uz šūnu apturēšanu.
     

    Temperatūras kontrole ultraskaņas E.coli līzes laikā
    Ultraskaņas šūnu traucētājs UP100H (100W) šūnu darbības traucējumiem un augu savienojumu ekstrakcijai.Pirms parauga atdzesēšanas un parauga turēšanas ultraskaņas laikā uz ledus, parauga termisko degradāciju var viegli novērst.
    Ideālā gadījumā paraugi līzes laikā būtu jātur ledusaukstā, bet lielākajai daļai paraugu pietiek ar to, ka temperatūra nepaaugstinās virs kultūras vai audu avota temperatūras. Tāpēc ir ieteicams saglabāt suspensiju uz ledus un apstrādāt ar ultraskaņu ar vairākiem īsiem ultraskaņas impulsiem 5-10 sek un pauzēm 10-30 sek. Pauzes laikā siltums var izkliedēties, lai atjaunotu zemu temperatūru. Lielākiem šūnu paraugiem ir pieejami dažādi plūsmas šūnu reaktori ar dzesēšanas apvalkiem.
    Lasiet šeit detalizētus padomus un ieteikumus veiksmīgai ultraskaņas līzei!

    Protokoli E. coli lizātu ultraskaņas sagatavošanai

    Pētnieki izmanto Hielscher ultraskaņas homogenizatorus E.coli šūnu darbības traucējumiem. Zemāk jūs varat atrast dažādus pārbaudītus un pārbaudītus E.coli līzes protokolus, izmantojot Hielscher ultraskaņas homogenizatorus dažādiem ar E. coli saistītiem lietojumiem.
     

    Šis video klips parāda Hielscher ultraskaņas homogenizatoru UP100H, ultrasonicator, ko plaši izmanto paraugu sagatavošanai laboratorijās.

    Ultraskaņas homogenizators UP100H

    Video sīktēls

    Šūnu augšana, šķērssaistīšana un E. coli šūnu ekstraktu sagatavošana, izmantojot Ultrasonics

    Attiecībā uz SeqA un RNS polimerāzes mikroshēmu-chip E. coli MG1655 vai MG1655 ΔseqA tika audzētas 37 ° c līdz OB600. no aptuveni 0,15 50 ml LB (+ 0,2% glikoze) pirms 27 μl formaldehīda (37%) (galīgā koncentrācija 1%). Crosslinking tika veikta ar lēnu kratīšanu (100 apgr./min.) istabas temperatūrā 20 min, kam sekoja 10 ml 2,5 M glicīna (galīgā koncentrācija 0,5 M). Attiecībā uz karstuma šoka eksperimentiem E. coli MG1655 izaudzē 65 ml LB barotnē 30 ° c līdz OB600. apmēram 0,3. Pēc tam 30 ml kultūras pārnesa uz iepriekš sasildītu kolbu 43 °C temperatūrā, bet atlikušo daļu turēja 30 °C temperatūrā. Šķērssaistīšana un rūdīšana notika, kā aprakstīts iepriekš, izņemot to, ka šūnas tika turētas 30 vai 43 °C temperatūrā 5 minūtes pirms turpmākas lēnas kratīšanas istabas temperatūrā. Šūnas savāca centrifugējot un divas reizes mazgāja ar aukstu TBS (pH7,5). Pēc atkārtotas suspendēšanas 1 ml līzes buferšķīdumā (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharozes, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizocīma) un inkubācijas 37 ° C temperatūrā 30 minūtes, kam sekoja 4 ml IP buferšķīduma pievienošana, šūnas tika apstrādātas ar ultraskaņu uz ledus ar 12 reizes 30 sek un 30 sek pārtraukumiem, izmantojot Hielscher ultraskaņas procesoru UP400St ar 100% jaudas iestatījumu. Pēc centrifugēšanas 10 minūtes 9000 g temperatūrā 800 μl centrifugāta alikvotās daļas uzglabāja -20°C temperatūrā. (Waldminghaus 2010)
     

    Fermentu pārprodukcija un attīrīšana ar ultraskaņas zondi

    Ultrasonicator UP100H ir laboratorijas homogenizators, ko bieži izmanto šūnu kultūras plākšņu paraugu sagatavošanai.Dekahistidīna (His10) marķēto proteīnu pārprodukcijai E. coli BL21(DE3) tika pārveidots ar pET19b konstrukcijām. Nakts prekultūra tika novākta centrifugējot, un 1% tika izmantots, lai inokulētu ekspresijas kultūru. Šūnas ar pET19mgtB tika audzētas 22 °C temperatūrā līdz optiskajam blīvumam pie 600 nm (OD600) 0,7. Kultūra tika pārnesta uz 17°C un inducēta ar 100 μM IPTG. Pēc 16 stundām kultūru novāca, centrifugējot 7 500 × g 4 °C temperatūrā. Šūnas tika atkārtoti suspendētas 50 mM fosfātu buferētā sāls šķīdumā (PBS) ar 0,3 M NaCl pie pH 7,4 un traucētas ar ultrasonikāciju ar S2 mikro-galu sonotrodu Hielscher ultrasonicator UP200St ciklā 0,5 un amplitūdā 75%.
    Par decahistidīns-tagged GtfC tika inducēta pie 37 ° c pie OB600. 0,6 ar 100 μM IPTG. Tad šūnas tika inkubētas 4 stundas, novāktas un noārda, kā norādīts iepriekš attiecībā uz MgtB.
    Kopšūnu ekstraktus centrifugēja 15 000 × g un 4 °C temperatūrā, lai nogulsnētu šūnu atliekas. Dzidrinātie ekstrakti tika ielādēti 1 ml HisTrap FF Crude kolonnās, izmantojot ÄKTAprime Plus sistēmu. Fermenti tika attīrīti saskaņā ar ražotāja protokolu par Viņa marķēto proteīnu gradienta eluēšanu. Eluēto olbaltumvielu šķīdumi tika dializēti divas reizes, salīdzinot ar 1,000 tilpumiem 50 mM PBS, pH 7,4, ar 0,3 M NaCl 4 °C temperatūrā. Attīrīšana tika analizēta ar 12% SDS-PAGE. Olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta ar Bredforda metodi, izmantojot Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
     

    Olbaltumvielu ultraskaņas ekstrakcija no E. coli baktērijām
    Procentu ēsmas proteīnu (šajā gadījumā MTV1 Arabidopsis thaliana) tiek kausēts uz GST tagu un izteikts BL21 Escherichia coli (E. coli) šūnās.

    1. Ņem vienu GST-MTV1 un GST granulu (kas atbilst 50 ml baktēriju kultūras) un katru atkārtoti saskalo 2,5 ml ledus aukstuma ekstrakcijas buferšķīdumā.
    2. Izmantojiet ultrasonikatoru UP100H (aprīkots ar MS3 mikrotip-sonotrode maziem apjomiem aptuveni 2-5 ml), lai izjauktu baktēriju šūnas, līdz tās tiek lizētas, ko norāda samazināta necaurredzamība un palielināta viskozitāte. Tas jāveic uz ledus, un ieteicams apstrādāt ar ultraskaņu intervālos (piemēram, 10 sekundes ar ultraskaņu, kam seko 10 sekunžu pauze uz ledus un tā tālāk). Jāuzmanās, lai neapstrādātu ar ultraskaņu ar pārāk augstu intensitāti. Ja tiek konstatēta putošana vai baltu nogulšņu veidošanās, intensitāte ir jāsamazina.
    3. Lizēto baktēriju šķīdumu pārnes uz 1,5 ml mikrocentrifūgas mēģenēm un centrifugē 4 °C temperatūrā 16 000 x g 20 minūtes.

     

    Ultraskaņas zondes izmanto akustiskās kavitācijas spēkus, lai izjauktu šūnu un iegūtu molekulas un DNS no E.coli.

    Zondes tipa ultrasonikatori, piemēram, UP400St izmantot akustiskās kavitācijas darba principu efektīvai E.coli līzei.

    Rekombinantā proteīna ekspresijas analīze un attīrīšana, izmantojot ultraskaņu

    E. coli granulas tika apstrādātas ar ultraskaņu ar Hielscher ultrasonicator UP100H. Šim nolūkam šūnu granulas tika atkārtoti suspendētas atdzesētā līzes buferšķīdumā (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) un atdzesētas uz ledus 10 min. Pēc tam šūnu suspensija tika apstrādāta ar ultraskaņu ar 10 īsiem pārrāvumiem 10 s, kam sekoja 30 s intervāls dzesēšanai. Visbeidzot, šūnu atliekas tika noņemtas ar ultracentrifugāciju 4 ° C temperatūrā 15 min pie 14000 apgr./min. Lai apstiprinātu rPR ekspresiju, supernatants tika darbināts ar 12% poliakrilamīda gēlu un analizēts ar SDS-PAGE un Western blotēšanu. rPR attīrīšana tika veikta, izmantojot Ni2+-NTA sveķus (Invitrogen, ASV) saskaņā ar ražotāja rokasgrāmatu. Šajā posmā tika izmantota vietējā attīrīšanas metode. Attīrītā proteīna tīrība tika novērtēta, izmantojot elektroforēzi uz 12% poliakrilamīda gela un tam sekojošo Coomassie zilo krāsošanu. Attīrīta proteīna koncentrācija tika noteikta ar Micro BCA proteīnu testa komplektu (PIERCE, ASV). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Šis video parāda 200 vatu ultraskaņas cuphorn laboratorijas paraugu izkliedēšanai, homogenizēšanai, ekstrakcijai vai degazēšanai.

    Ultraskaņas Cuphorn (200 vati)

    Video sīktēls

    Ultraskaņas homogenizatori E. coli līzei

    Hielscher Ultrasonics projektē, ražo un piegādā augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus uzticamai un efektīvai E. coli baktēriju un citu šūnu tipu, audu un šūnu kultūru līzei.
    Plašais ultraskaņas zondes portfelis, kā arī netiešās ultraskaņas sistēmas ļauj mums piedāvāt jums ideālu ultraskaņas audu homogenizatoru jūsu šūnu darbības traucējumu un ekstrakcijas pielietojumam.

    Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Kvalitāte Ražots Vācijā

    Hielscher ultraskaņas aparātus var attālināti vadīt, izmantojot pārlūkprogrammas vadību. Ultraskaņas parametrus var precīzi uzraudzīt un pielāgot procesa prasībām.Hielscher ultrasonikatori ir labi pazīstami ar saviem augstākajiem kvalitātes un dizaina standartiem. Viedā programmatūra, intuitīva izvēlne, programmējami iestatījumi un automātiska datu protokolēšana ir tikai dažas Hielscher ultrasonikatoru funkcijas. Robustums un viegla darbība ļauj vienmērīgi integrēt mūsu ultrasonikatorus pētniecības un biotehnoloģiju iekārtās. Hielscher ultrasonikatori viegli apstrādā pat neapstrādātus apstākļus un prasīgu vidi.

    Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums un īpašu uzsvaru liek uz augstas veiktspējas ultrasonikatoriem, kas piedāvā vismodernākās tehnoloģijas un lietotājdraudzīgumu. Protams, Hielscher ultrasonikatori ir saderīgi ar CE un atbilst UL, CSA un RoHs prasībām.

    Zemāk redzamā tabula sniedz norādes par mūsu ultraskaņas aparātu aptuveno apstrādes jaudu:

    partijas apjoms Plūsmas ātrums Ieteicamie ierīces
    vairāku urbumu / mikrotitru plāksnes nav | UIP400MTP UIP400MTP
    CupHorn flakoniem vai vārglāzei nav | Ultraskaņas CupHorn
    Ultraskaņas mikroplūsmas reaktors nav | GDmini2
    līdz 10 flakoniem ar 0,5 līdz 1,5 ml nav | VialTweeter
    0.5 līdz 1.5mL nav | VialTweeter
    1 līdz 500mL 10 līdz 200 ml / min UP100H
    10 līdz 2000mL 20 līdz 400 ml / min UP200Ht, UP400St
    0.1 līdz 20L 0.2 līdz 4 l / min UIP2000hdT
    10 līdz 100 l 2 līdz 10 l / min UIP4000
    nav | 10 līdz 100 l / min UIP16000
    nav | lielāks klasteris UIP16000

    Sazinies ar mums! / Uzdot mums!

    Lūgt vairāk informācijas

    Lūdzu, izmantojiet zemāk esošo veidlapu, lai pieprasītu papildu informāciju par ultraskaņas audu homogenizatoriem un šūnu drupinātājiem, līzes lietojumiem un cenām. Mēs ar prieku apspriedīsim jūsu procesu ar jums un piedāvāsim jums ultraskaņas homogenizatoru, kas atbilst jūsu prasībām!









    Lūdzu, ņemiet vērā mūsu Privātuma politika.


    Video parāda ultraskaņas paraugu sagatavošanas sistēmu UIP400MTP, kas ļauj droši sagatavot jebkuru standarta daudzaku plākšņu paraugu, izmantojot augstas intensitātes ultraskaņu. Tipiski UIP400MTP lietojumi ietver šūnu līzi, DNS, RNS un hromatīna bīdes, kā arī olbaltumvielu ekstrakciju.

    Ultrasonicator UIP400MTP daudzdiesmu plākšņu apstrādei ar ultraskaņu

    Video sīktēls

    Papildu protokoli ultraskaņas E. coli līzei

    Allicīna modificēti proteīni E. coli, izmantojot ultraskaņas VialTweeter

    VialTweeter pie ultraskaņas procesora UP200STSulfhidrila satura noteikšana par 5,5 ′-Ditiobis (2-nitrobenzoskābe) (DTNB) tests
    Lai inokulētu MOPS minimālo barotni (1:100), tika izmantota E. coli MG1655 nakts kultūra. Kultūra tika audzēta aerobi, līdz tika sasniegts A600 0,4. Kultūra tika sadalīta trīs 15 ml kultūrās stresa ārstēšanai. Neapstrādāta kultūra kalpoja kā negatīva kontrole. 0,79 mM allicīns (128 μg ml-1) vai 1 mM diamīds tika pievienots vienai no atlikušajām divām kultūrām katrā. Kultūras inkubēja 15 min. 5 ml no katras kultūras ievāca centrifugējot (8,525 × g, 4°C, 10 min). Šūnas divas reizes mazgāja ar 1 ml fosfātu buferšķīduma (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, pirms lietošanas anaerobi uzglabāja) un centrifugēja (13 000 × g, 4 °C, 10 min). Šūnas tika atkārtoti suspendētas līzes buferšķīdumā (PBS ar 6 mM guanidīnija HCl, pH 7,4) pirms traucējumiem 4 ° C temperatūrā ar ultrasonikāciju (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Vācija) (3 × 1 min). Šūnu atliekas granulēja centrifugējot (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Centrifugātu pārnesa uz 3,5 ml QS-makro kiveti (10 mm) ar magnētisko maisīšanas stieni un sajauca ar 1 ml līzes buferšķīduma. Paraugu izzušana tika uzraudzīta pie 412 nm ar Jasco V-650 spektrofotometru, kas aprīkots ar PSC-718 temperatūras kontrolētu šūnu turētāju istabas temperatūrā. Pievienoja 100 μl 3 mM ditiobis(2-nitrobenzoskābes) šķīduma. Izzušana tika uzraudzīta, līdz tā sasniedza piesātinājumu. Tiola koncentrācijas aprēķins tika veikts, izmantojot ekstinkcijas koeficientu ε412. = 13 700 M-1 Cm-1 par thio-2-nitrobenzoskābi (TNB). Šūnu tiola koncentrācija tika aprēķināta, pamatojoties uz tilpumu E. coli šūnu 6,7 × 10-15 litru un šūnu blīvums A600 = 0,5 (ekvivalents 1 × 108 šūnu skaits ml-1 kultūras jomā). (Müller et al. 2016)
     

    In vivo glutationa noteikšana, izmantojot ultraskaņas šūnu drupinātāju

    E.coli MG1655 tika audzēts MOPS minimālā barotnē ar kopējo tilpumu 200ml, līdz tika sasniegts A600 0,5. Kultūra tika sadalīta 50 ml kultūrās stresa ārstēšanai. Pēc 15 min inkubācijas ar 0,79 mM allicīnu, 1 mM diamīdu vai dimetilsulfoksīdu (kontrole) šūnas tika ievāktas 4,000 g 4 °C temperatūrā 10 minūtes. Šūnas divas reizes tika mazgātas ar KPE buferšķīdumu, pirms granulu atkārtotas saskalošanas 700 μl KPE buferšķīduma. Deproteinācijai pirms šūnu darbības pārtraukšanas ar ultrasonikāciju tika pievienoti 300l 10% (m/V) sulfosalicilskābes (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants tika savākts pēc centrifugēšanas (30 min, 13, 000G, 4 ° c). Sulfosalicilskābes koncentrācija samazinājās līdz 1%, pievienojot 3 tilpumus KPE buferšķīdumā. Kopējās glutationa un GSSG mērījumi tika veikti, kā aprakstīts iepriekš. Celulāro glutationa koncentrāciju aprēķināja, pamatojoties uz tilpumu E. coli šūnu 6,7×10-15 litru un šūnu blīvums A600 0,5 (ekvivalents 1×108 šūnu skaits ml-1 kultūras jomā). GSH koncentrācijas aprēķināja, no kopējās glutationa atņemot 2 [GSSG]. (Müller et al. 2016)

    Cilvēka mAspAT ekspresija E. coli, izmantojot ultraskaņas homogenizatoru

    Ultraskaņas šūnu disruptors UP400St (400W) intracelulārās vielas iegūšanai (piemēram, proteīni, organelles, DNS, RNS utt.)Viena kolonija E. coli BL21 (DE3), kas ietver ekspresijas vektora 30 mL Luria-Bertani (LB) barotni, kas satur 100μg/mL ampicilīna, un pēc tam audzē 37 ° C temperatūrā, līdz optiskais blīvums (OB600.) sasniedza 0,6. Šūnas tika novāktas, centrifugējot 10 minūtes ar 4 000 × g, un atkārtoti suspendē 3L svaiga LB vidē, kas satur 100 μg/mL ampicilīna.
    Pēc tam olbaltumvielu ekspresiju inducēja ar 1 mM izopropil-β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozīdu (IPTG) 20 stundas 16 °C temperatūrā. Šūnas ievāca, centrifugējot 8 000 × g 15 minūtes, un mazgāja ar A buferšķīdumu (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). No 3 L kultūras tika iegūtas aptuveni 45 g (mitra svara) šūnas. Pēc centrifugēšanas šūnu granulas tika atkārtoti suspendētas 40 ml (1 L kultūrai) ledusaukstā ekstrakcijas buferī A un lizētas ar ultrasonikāciju ledus aukstā temperatūrā, izmantojot Hielscher ultraskaņas šūnu drupinātāju UP400St. Šūnu līzi centrifugēja pie 12 000 apgriezieniem minūtē 15 minūtes, lai atdalītu šķīstošās (centrifugāta) un nogulsnētās (granulu) frakcijas. (Jiang et al. 2015)
     



    Fakti ir vērts zināt

    E. coli

    Escherichia coli (E. coli) ir Gram-negatīvs, facultatively anaerobās, stieņa formas, koliformas baktērija no Escherichia ģints, kas parasti atrodas siltām zarnām organismiem (endotermiem). Ir liels skaits E. coli celmu (vai apakštipu) ar atšķirīgām īpašībām. Lielākā daļa E. coli celmu ir nekaitīgi cilvēkiem, piemēram, B un K-12 celmiem, ko parasti izmanto pētnieciskiem pielietojumiem laboratorijās. Tomēr daži celmi ir kaitīgi un var izraisīt nopietnu saslimšanu.
    E. coli ir liela nozīme mūsdienu bioloģiskajās inženierzinātnēs un industriālajā mikrobioloģijā, jo baktērijas ir viegli manipulēt. Bieži lietota laboratorijas lietojumprogramma, kas bieži ietver E. coli izmantošanu, piemēram, lai izveidotu rekombinanto dezokribonukleīnskābi (DNS) vai darbotos kā modeļa organisms.
    E. coli ir ļoti daudzpusīga heterologu proteīnu ražošanas saimniekviela, un kolektora proteīnu ekspresijas sistēmas ir pieejamas rekombinanto proteīnu E. coli ražošanai. Izmantojot plazmīdas, kas pieļauj augsta līmeņa olbaltumvielu ekspresiju, baktērijas var ievest baktērijās, kas ļauj ražot šādus proteīnus lielā daudzumā rūpnieciskās fermentācijas procesos.
    E.coli izmanto kā šūnu rūpnīcas insulīna ražošanai. Citi pielietojumi ietver modificētu E. coli šūnu izmantošanu vakcīnu un imobilizētu fermentu izstrādē un ražošanā, biodegvielas ražošanā, kā arī bioremediācijā.
    Celms K-12 ir mutants forma E. coli, ka pārāk izsaka enzīmu sārmainās fosfatāzes (ALP). Šī mutācija rodas sakarā ar gēnu, kas pastāvīgi kodē enzīmu, defektu. Ja gēns ražo produktu bez kavēšanas, to dēvē par Konstitutīvo aktivitāti. Šī īpašā mutantu forma tiek izmantota izolācijai un attīrīšanas ALP fermentu.
    E. coli baktērijas tiek plaši izmantotas arī kā šūnu rūpnīcas. Inženierijas mikrobus (piemēram, baktērijas) un augu šūnas var izmantot kā tā sauktās šūnu rūpnīcas. Šīs ģenētiski modificētās šūnas ražo molekulas, ķīmiskas vielas, polimērus, olbaltumvielas un citas vielas, ko izmanto, piemēram, farmācijas, pārtikas un ķīmiskajā rūpniecībā. Lai atbrīvotu molekulas, kas ražotas šādu bioinženieriju šūnu interjerā, ultraskaņas līze ir izplatīta metode, lai izjauktu šūnu sienas un pārnestu mērķa vielas apkārtējā šķidrumā. Lasiet vairāk par bioinženieriju šūnu līzes!

    Ultraskaņas DNA Nobīdes

    Ultraskaņas bīdes spēki ir parasti izmantota metode, lai atbrīvotu molekulas, organellus un proteīnus no šūnu iekšpuses, kā arī sadalītu DNS dzīslas gabalos. Akustiskā kavitācija pārtrauc šūnu sienas un membrānas, lai iegūtu DNS no šūnām un radītu aptuveni 600 fragmentus – 800 BP garumā, kas ir ideāli piemērots analīzei.
    Spiediet šeit, lai uzzinātu vairāk par ultraskaņas homogenizētājiem DNS sadrumstalotībai!

    Literatūra/atsauces


    Augstas veiktspējas ultrasonics! Hielscher produktu klāsts aptver visu spektru no kompaktā laboratorijas ultrasonikatora virs stenda augšējām vienībām līdz pilnībā rūpnieciskām ultraskaņas sistēmām.

    Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no Laboratorija lai rūpnieciskais izmērs.


    Mēs priecāsimies apspriest jūsu procesu.

    Sazināsimies.