Protokols SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācijai ar ultraskaņu

Hielscher VialTweeter ir unikāla ultraskaņas vairāku paraugu sagatavošanas vienība, ko izmanto, lai inaktivētu koronavīrusu SARS-COV-2. VialTweeter ļauj vienlaicīgi sagatavot līdz 10 paraugu flakoniem un tādējādi ir ideāla vienība masas paraugu apstrādei.

SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācija ar VialTweeter

Pēc fiksatora noņemšanas monoslāņi trīs reizes tika mazgāti ar fosfātu buferšķīdumu (PBS) pirms šūnu nokasīšanas 1 ml MEM / 5% FBS un apstrādāti ar ultraskaņu (3 × 10 sekundes ieslēgtas, 10 sekundes izslēgtas ar 100% jaudu un amplitūdu), izmantojot Hielscher ultraskaņas procesoru UP200St ar VialTweeter Pielikumu. Supernatantus dzidrināja, centrifugējot ar 3000 × g 10 min. 

Lasiet pilnu protokolu par SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivāciju, ko veica Welch et al. (2020) zemāk:

Šūnas un vīruss

Vero E6 šūnas (Vero C1008; ATCC CRL-1586) tika kultivētas modificētā Eagle minimālajā būtiskajā barotnē (MEM), kas papildināta ar 10% (v/v) augļa teļa serumu (FCS). Izmantotais vīruss bija SARS-CoV-2 celms hCOV-19/England/2/2020, ko PHE izolēja no pirmā pacientu klastera Apvienotajā Karalistē 29.01.2020. Šis vīruss tika iegūts 1. fragmentā un izmantots inaktivācijas pētījumos 2. vai 3. fragmentā.
Attiecībā uz reaģentiem un ķīmiskajām vielām, ko izmanto SARS-CoV-2 inaktivācijai, kā arī reaģenta citotoksicitātes likvidēšanai, lūdzu, skatīt Welch et al. (2020) zinātnisko ziņojumu.

Vīrusu inaktivācija ar mazgāšanas līdzekļiem – SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācijas protokols by Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 inaktivācija

Komercproduktiem, vīrusu preparātiem (audu kultūru šķidrums, titri no 1 × 10⁶ līdz 1 × 10⁸ PFU/ml) tika apstrādātas trijos eksemplāros ar reaģentiem tādās koncentrācijās un saskares laikos, kas ieteikti ražotāja lietošanas pamācībā, ja tāda ir pieejama, vai tādās koncentrācijās un laikos, kā to īpaši pieprasījušas testēšanas laboratorijas. Ja ražotājs ir norādījis koncentrāciju diapazonu, tika testēta mazākā biocīda attiecība pret paraugu (t. i., testējamā produkta zemākā ieteicamā koncentrācija). Paraugu transporta cauruļu reaģentus testēja, izmantojot attiecību starp vienu tilpumu audu kultūras šķidruma un desmit tilpumiem reaģenta, ja vien ražotājs nav norādījis parauga šķidruma un reaģenta tilpuma attiecību. Mazgāšanas līdzekļi, fiksatori un šķīdinātāji tika pārbaudīti norādītajās koncentrācijās norādītajos laikos. Visas inaktivācijas darbības tika veiktas istabas temperatūrā (18 – 25°C). Lai pārbaudītu alternatīvus paraugu veidus, vīruss tika ievadīts norādītajā parauga matricā attiecībā 1:9, pēc tam apstrādāts ar testa reaģentiem, kā norādīts iepriekš. Visos eksperimentos testa reaģenta vietā tika iekļauti paraugi, kas apstrādāti ar trijiem kontroles maketiem, ar līdzvērtīgu PBS tilpumu. Tūlīt pēc vajadzīgā saskares laika tika apstrādāts 1 ml apstrādātā parauga, izmantojot atbilstoši izvēlētu filtrēšanas matricu. Reaģenta noņemšana inaktivācijas testēšanai tika veikta lielākā centrifūgas kolonnas formātā, izmantojot Pierce 4mL mazgāšanas līdzekļa noņemšanas centrifūgas kolonnas (Thermo Fisher) vai piepildot tukšas Pierce 10mL ietilpības centrifūgas kolonnas (Thermo Fisher) ar SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR vai Sephadex LH-20, lai iegūtu 4 ml iepakotas lodītes / sveķus. Attīrīšanai, izmantojot Amicon filtrus, 2 × 500μl paraugus attīrīja, izmantojot divus centrbēdzes filtrus ar iepriekš aprakstīto metodi, un pēc tam apvienoja. Formaldehīdam un formaldehīdam ar glutaraldehīda noņemšanu tika izmantots viens filtrs ar 1× 500μl parauga tilpumu, atkārtoti suspendēts pēc apstrādes 500μl PBS un pievienots 400ul MEM/5% FBS. Inficēto inaktivācijai monoslāņi, 12,5 cm² Vero E6 šūnu kolbas (2.5. × 10⁶ šūnas/kolba 2,5 ml MEM/5% FBS) tika inficētas ar MOI 0,001 un inkubētas 37 °C/5% CO temperatūrā₂ 24 stundas. Supernatants tika noņemts, un šūnas tika fiksētas, izmantojot 5 ml formaldehīda vai formaldehīda un glutaraldehīda istabas temperatūrā 15 vai 60 minūtes. Fiksators tika noņemts, un monoslāņi trīs reizes mazgāti ar PBS pirms šūnu nokasīšanas 1 ml MEM / 5% FBS un apstrādāti ar ultraskaņu (3 × 10 sekundes ieslēgtas, 10 sekundes izslēgtas pie 100% jaudas un amplitūdas), izmantojot UP200St ar VialTweeter pielikumu (Hielscher ultraskaņas tehnoloģija). Supernatantus dzidrināja, centrifugējot ar 3000 × g 10 min.

Sīkāka informācija par reaģentu, ko izmanto SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācijai ar ultraskaņas VialTweeter saskaņā ar Welch et al. 2020 protokolu

Pilns protokols, ieskaitot Hielscher VialTweeter izmantošanu, ir atrodams šeit:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Izsmalcināti ultraskaņas dismembrators un šūnu traucētāji

Vairāku paraugu ultrasonicator VialTweeter ir tikai viens no daudziem ultraskaņas risinājumiem paraugu sagatavošanai bioloģiskajās, bioķīmiskajās un klīniskajās laboratorijās. Hielscher Ultrasonics piedāvā ideālu ultraskaņas dismembratoru jūsu lietojumam, piemēram, šūnu līze, šūnu ekstrakcija, audu homogenizācija, lizāta šķīdināšana, izšķīdināšana, paraugu degazēšana utt.
Paziņojiet mums, cik daudz paraugu jums ir jāapstrādā stundā un dienā, ja vēlaties tiešu vai netiešu ultraskaņu un kāds ir ultraskaņas paraugu apstrādes mērķis. Mēs jums ieteiksim vispiemērotāko ultraskaņas ierīci jūsu ikdienas darba rutīnai!
Hielscher Ultrasonics' digitālie ultraskaņas procesori ir aprīkoti ar gudru programmatūru, automātisku datu ierakstīšanu, vieglām temperatūras kontroles iespējām, ultraskaņas ilgumu, cikla / impulsa režīmu, kā arī parauga apgaismojumu un pārlūka tālvadības pulti. Mēs cenšamies padarīt mūsu ultraskaņas ierīces pēc iespējas gudrākas, lai jūsu pētniecības un darba rutīna kļūtu pēc iespējas ērtāka un veiksmīgāka.
Noklikšķiniet šeit, lai atrastu vairāk lietojumprogrammu, tostarp ultraskaņas paraugu sagatavošanas protokolus ar VialTweeter!