SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācijas protokols, izmantojot apstrādi ar ultraskaņu

Hielscher VialTweeter ir unikāla ultraskaņas iekārta vairāku paraugu sagatavošanai, ko izmanto koronavīrusa SARS-COV-2 inaktivācijai. VialTweeter ļauj vienlaikus sagatavot līdz 10 paraugu flakoniem, tādēļ tā ir ideāla iekārta paraugu masveida apstrādei.

SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācija ar VialTweeter

Pēc fiksatora noņemšanas monoslāņus trīs reizes mazgāja ar fosfātu buferšķīdumu (PBS), pēc tam šūnas nokasīja un pārnesa uz 1mL MEM/5% FBS un apstrādāja ar ultraskaņu (3 × 10 sekundes ieslēgts, 10 sekundes izslēgts, ar 100% jaudu un amplitūdu), izmantojot Hielscher ultraskaņas procesoru UP200St ar VialTweeter papildierīci. Supernatantus dzidrināja, centrifugējot ar 3000 × g 10 minūtes. Pilnu Welch et al. (2020) protokolu SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācijai lasiet tālāk:

Šūnas un vīruss

Vero E6 šūnas (Vero C1008; ATCC CRL-1586) kultivēja modificētā Īgla minimālajā nepieciešamajā barotnē (MEM), kas papildināta ar 10% (v/v) teļa augļa seruma (FCS). Izmantotais vīruss bija SARS-CoV-2 celms hCOV-19/England/2/2020, ko PHE izolēja no pirmās pacientu kopas Apvienotajā Karalistē 29/01/2020. Šis vīruss tika iegūts 1. pasāžā un inaktivācijas pētījumos izmantots 2. vai 3. pasāžā.
Informāciju par SARS-CoV-2 inaktivācijai izmantotajiem reaģentiem un ķīmiskajām vielām, kā arī reaģentu citotoksicitātes novēršanu skatiet Welch et al. (2020) zinātniskajā ziņojumā.

Vīrusa inaktivācija ar detergentiem – SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācijas protokols, Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 inaktivācija


Pārbaudot komerciālos produktus, vīrusa preparātus (audu kultūras šķidrumu ar titriem diapazonā no 1 × 10⁶ līdz 1 × 10⁸ PFU/ml) trijos atkārtojumos apstrādāja ar reaģentiem ražotāja lietošanas instrukcijās ieteiktajās koncentrācijās un norādītajos kontakta laikos, ja šāda informācija bija pieejama, vai izmantoja testēšanas laboratoriju īpaši pieprasītās koncentrācijas un laikus. Ja ražotājs bija norādījis koncentrāciju diapazonu, pārbaudīja zemāko produkta un parauga attiecību (t. i., zemāko ieteikto pārbaudāmā produkta koncentrāciju). Paraugu transportēšanas stobriņu reaģentus pārbaudīja, izmantojot attiecību viens audu kultūras šķidruma tilpums pret desmit reaģenta tilpumiem, ja vien ražotājs nebija norādījis parauga šķidruma un reaģenta tilpumu attiecību. Detergentus, fiksatorus un šķīdinātājus pārbaudīja norādītajās koncentrācijās un norādītajos laikos. Visus inaktivācijas posmus veica apkārtējās vides istabas temperatūrā (18 – 25°C). Lai pārbaudītu alternatīvus paraugu veidus, norādītajai parauga matricai pievienoja vīrusu attiecībā 1:9 un pēc tam apstrādāja ar pārbaudāmajiem reaģentiem, kā aprakstīts iepriekš. Visos eksperimentos iekļāva kontroles paraugus trijos atkārtojumos, kuriem veica imitētu apstrādi, pārbaudāmā reaģenta vietā izmantojot ekvivalentu PBS tilpumu. Tūlīt pēc nepieciešamā kontakta laika beigām 1mL apstrādātā parauga apstrādāja, izmantojot atbilstoši izvēlētu filtrācijas matricu. Reaģentu atdalīšanu inaktivācijas pārbaudēm veica lielāka izmēra centrifugēšanas kolonnās, izmantojot Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) vai piepildot tukšas Pierce centrifugēšanas kolonnas ar 10mL ietilpību (Thermo Fisher) ar SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR vai Sephadex LH-20, lai iegūtu 4mL sablīvētu lodīšu/sveķu. Attīrīšanai ar Amicon filtriem 2 × 500μl paraugus attīrīja divos centrifugēšanas filtros ar iepriekš aprakstīto metodi un pēc tam apvienoja. Formaldehīda un formaldehīda ar glutaraldehīdu atdalīšanai izmantoja vienu filtru ar 1× 500μl parauga tilpumu; pēc apstrādes paraugu atkārtoti suspendēja 500μl PBS un pievienoja 400ul MEM/5% FBS. Inficēto monoslāņu inaktivācijai 12,5 cm² kolbās esošās Vero E6 šūnas (2,5 × 10⁶ šūnas/kolbā 2,5mL MEM/5% FBS) inficēja ar MOI 0,001 un inkubēja 37°C/5% CO₂ 24 stundas. Supernatantu noņēma, un šūnas fiksēja, izmantojot 5mL formaldehīda vai formaldehīda un glutaraldehīda maisījuma istabas temperatūrā 15 vai 60 minūtes. Fiksatoru noņēma, un monoslāņus trīs reizes mazgāja ar PBS, pēc tam šūnas nokasīja un pārnesa uz 1mL MEM/5% FBS un apstrādāja ar ultraskaņu (3 × 10 sekundes ieslēgts, 10 sekundes izslēgts, ar 100% jaudu un amplitūdu), izmantojot UP200St ar VialTweeter papildierīci (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatantus dzidrināja, centrifugējot ar 3000 × g 10 minūtes.


Informācija par reaģentu, kas izmantots SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācijai ar ultraskaņas iekārtu VialTweeter saskaņā ar Welch et al. 2020 protokolu

Pilns protokols, kurā aprakstīta arī Hielscher VialTweeter izmantošana, atrodams šeit:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Modernas ultraskaņas dezintegrācijas un šūnu sagraušanas iekārtas

Vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes iekārta VialTweeter ir tikai viens no daudzajiem ultraskaņas risinājumiem paraugu sagatavošanai bioloģiskajās, bioķīmiskajās un klīniskajās laboratorijās. Hielscher Ultrasonics piedāvā ideālu ultraskaņas dezintegratoru jūsu lietojumam, piemēram, šūnu līzei, šūnu ekstrakcijai, audu homogenizācijai, lizāta solubilizācijai, šķīdināšanai, paraugu degazēšanai utt.
Pastāstiet mums, cik paraugu jums jāapstrādā stundā un dienā, vai dodat priekšroku tiešai vai netiešai apstrādei ar ultraskaņu un kāds ir paraugu apstrādes ar ultraskaņu mērķis. Mēs ieteiksim jūsu ikdienas darbam vispiemērotāko ultraskaņas iekārtu!
Hielscher Ultrasonics digitālie ultraskaņas procesori ir aprīkoti ar viedu programmatūru, automātisku datu reģistrēšanu, ērti lietojamām temperatūras kontroles, apstrādes ar ultraskaņu ilguma un cikla/impulsu režīma priekšiestatīšanas iespējām, kā arī paraugu apgaismojumu un tālvadību pārlūkā. Mēs cenšamies padarīt savas ultraskaņas iekārtas pēc iespējas viedākas, lai jūsu pētniecība un ikdienas darbs būtu pēc iespējas ērtāks un veiksmīgāks.
Noklikšķiniet šeit, lai atrastu citus lietojumus, tostarp protokolus paraugu sagatavošanai ar ultraskaņu, izmantojot VialTweeter!