Protokols SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivācija ar ultraskaņu

Hielscher VialTweeter ir unikāla ultraskaņas vairāku paraugu sagatavošanas vienība, ko izmanto, lai inaktivētu koronavīrusu SARS-COV-2. VialTweeter ļauj vienlaicīgi sagatavot līdz 10 paraugu flakoniem, un tādējādi tā ir ideāla vienība masveida paraugu apstrādei.

SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācija ar VialTweeter

Pēc fiksācijas noņemšanas monoslānis trīs reizes tika mazgāts ar fosfātbuferētu fizioloģisko šķīdumu (PBS) pirms šūnu nokasīšanas 1 ml MEM/5% FBS un ar ultraskaņu (3 × 10 sekundes, 10 sekundes pie 100% jaudas un amplitūdas), izmantojot Hielscher ultraskaņas procesoru UP200St ar VialTweeter Pielikumu. Centrifugējot ar 3000 × g 10 minūtes. 

Lasīt pilnu protokolu šeit SARS-CoV-2 coronavirus inaktivāciju Welch et al. (2020) zemāk:

Šūnas un vīruss

Vero E6 šūnas (Vero C1008; ATCC CRL- 1586) kultivēja modificētā Eagle minimālajā pamat barotnā (MEM), ko papildināja 10% (v/v) augļa teļu serums (FCS). Izmantotais vīruss bija SARS-CoV-2 celms hCOV-19/England/2/2020, ko PHE izolē no pirmā pacientu grupas Apvienotajā Karalistē 29.01.2020. Šis vīruss tika iegūts 1. pārejas punktā un izmantots inaktivācijas pētījumos 2. vai 3. punktā.
Attiecībā uz reaģentiem un ķīmiskajām vielām, ko izmanto SARS-CoV-2 inaktivācijai, kā arī reaģenta citotoksicitātes noņemšanai, lūdzu, skatiet Welch et al. zinātnisko ziņojumu (2020).

Mazgāšanas līdzekļu inaktivācija pret vīrusiem – SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivation protocol by Welch et al. 2020 SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivation protocol by Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 inaktivācija

Komerciāliem produktiem vīrusu preparāti (audu kultūras šķidrums, titri no 1 × 10⁶ līdz 1 × 10⁸ PFU/ml) tika apstrādāti trīs eksemplāros ar reaģentiem koncentrācijās un kontakta laiku, kas ieteikts ražotāja lietošanas pamācībā, ja iespējams, vai koncentrācijām un laikiem, ko īpaši pieprasa testēšanas laboratorijas. Ja ražotājs ir devis koncentrāciju diapazonu, tika pārbaudīta mazākā produkta un parauga attiecība (t. i., mazākā ieteicamā testējamā produkta koncentrācija). Transporta caurules reaģentu paraugus testēja, izmantojot attiecību no viena tilpuma audu kultūras šķidruma līdz desmit reaģenta tilpumam, ja vien ražotājs nav norādījis parauga šķidruma un reaģenta tilpuma attiecību. Mazgāšanas līdzekļi, fiksācijas līdzekļi un šķīdinātāji norādītajākoncentrācijā tika pārbaudīti norādītajās koncentrācijās norādītajā laikā. Visi inaktivācijas posmi tika veikti istabas temperatūrā (18 – 25°C). Alternatīvu paraugu tipu testēšanai vīruss tika piesātināts norādītajā parauga matricā ar attiecību 1:9, pēc tam apstrādāts ar iepriekš minētajiem testa reaģentiem. Visos eksperimentos bija iekļauti triplicate control mock-apstrādāti paraugi ar līdzvērtīgu PBS tilpumu testa reaģenta vietā. Tūlīt pēc nepieciešamā saskares laika apstrādātā parauga 1 ml tika apstrādāts, izmantojot atbilstoši izvēlēto filtrēšanas matricu. Reaģenta noņemšana inaktivācijas testēšanai tika veikta lielākā spin kolonnas formātā, izmantojot Pierce 4mL mazgāšanas līdzekļu noņemšanas spin kolonnas (Thermo Fisher), vai aizpildot tukšas Pierce 10ml ietilpības centrifūgas kolonnas (Thermo Fisher) ar SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR vai Sephadex LH-20 dot 4ml iepakotas lodītes / sveķus. Attīrīšanai, izmantojot Amicon filtrus, 2 × 500 μl paraugi tika attīrīti, izmantojot divus centrbēdzes filtrus ar iepriekš aprakstīto metodi, pēc tam apvienoti kopā. Formaldehīdam un formaldehīdam ar glutaraldehīda atdalīšanu tika izmantots viens filtrs ar 1× 500 μl parauga tilpuma, pēc apstrādes atkārtoti uzpildīts 500 μl PBS un pievienots 400ul MEM/5% FBS. Inaktivācijai inficēto vienslāņa slānī, 12,5 cm² Vero E6 šūnu kolbas (2,5 × 10⁶ šūnas/kolba 2,5 ml MEM/5% FBS) bija inficētas ar MOI 0,001 un inkubē 37°C/5% CO₂ 24 stundas. Supernatants tika noņemts, un šūnas, kas fiksētas, izmantojot 5 ml formaldehīda, vai formaldehīda un glutaraldehīda istabas temperatūrā 15 vai 60 minūtes. Fiksācijas tika noņemts, un monoslāni tika mazgāti trīs reizes ar PBS pirms nokasot šūnas 1mL MEM/5% FBS un sonicated (3 × 10 sekunžu, 10 sekundes off ar 100% jaudu un amplitūdu), izmantojot UP200St ar VialTweeter arestu (Hielscher Ultrasound Technology). Centrifugējot ar 3000 × g 10 minūtes.

Sīkāka informācija par reaģentu, ko izmanto SARS-CoV-2 koronavīrusa inaktivācijai ar ultraskaņas VialTweeter saskaņā ar Welch et al. 2020 protokolu

Pilns protokols, ieskaitot Hielscher VialTweeter lietošanu, ir atrodams šeit:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Izsmalcināti ultraskaņas dismembratori un šūnu traucētāji

Vairāku paraugu ultrasonators VialTweeter ir tikai viens no daudziem ultraskaņas šķīdumiem paraugu sagatavošanai bioloģiskajās, bioķīmiskajās un klīniskajās laboratorijās. Hielscher Ultrasonics piedāvā ideālu ultraskaņas dismembratoru jūsu pieteikumam, piemēram, šūnu līze, šūnu ekstrakcija, audu homogenizācija, lizāta šķīdība, šķīdināšana, parauga degazēšana utt.
Ļaujiet mums uzzināt, cik daudz paraugu jums ir jāapstrādā stundā un dienā, ja vēlaties tiešu vai netiešu ultraskaņu un kāds ir ultraskaņas paraugu apstrādes mērķis. Mēs ieteiks jums vispiemērotāko ultraskaņas vienību jūsu ikdienas darba rutīnai!
Hielscher Ultrasonics digitālie ultraskaņas procesori ir aprīkoti ar viedo programmatūru, automātisko datu reģistrēšanu, viegliem temperatūras kontroles, ultraskaņas apstrādes, ultraskaņas apstrādes ilguma, cikla/pulsa režīma, kā arī parauga apgaismojuma un pārlūkprogrammas tālvadības pults izmantošanas iespējām. Mēs cenšamies padarīt mūsu ultraskaņas ierīces pēc iespējas gudrākas, lai jūsu pētījumi un darba rutīna kļūtu pēc iespējas ērtāki un veiksmīgāki.
Uzklikšķināt šeit, lai atrastu vairāk pieteikumus, tostarp ultraskaņas paraugu sagatavošanas protokolus ar VialTweeter!