BL21 šūnu līze ar ultraskaņu

BL21 šūnas ir E. coli celms, ko plaši izmanto pētniecības laboratorijās, biotehnoloģijā un rūpnieciskajā ražošanā, jo šīs šūnas spēj ļoti efektīvi ekspresēt olbaltumvielas. Šūnu sagraušana ar ultraskaņu, līze un olbaltumvielu ekstrakcija ir izplatīta metode mērķa olbaltumvielu izolēšanai un iegūšanai no BL21 šūnu iekšienes. Apstrāde ar ultraskaņu pilnībā sagrauj šūnu un atbrīvo visas tajā ieslēgtās olbaltumvielas, padarot pieejamus 100% olbaltumvielu.

BL21 šūnas olbaltumvielu ekspresijai

BL21 ir ķīmiski kompetents E. coli baktēriju celms, kas piemērots transformācijai un augsta līmeņa olbaltumvielu ekspresijai, izmantojot T7 RNS polimerāzes-IPTG indukcijas sistēmu. BL21 šūnas nodrošina ļoti efektīvu olbaltumvielu ekspresiju no jebkura gēna, kas atrodas T7 promotera kontrolē. E. coli celms BL21(DE3) ir uz T7 RNS polimerāzi balstīts olbaltumvielu ražošanas celms, ko kombinācijā ar ekspresijas vektoriem, kuru pamatā ir T7 promoters, plaši izmanto laboratorijās un rūpniecībā rekombinanto olbaltumvielu ražošanai. BL21(DE3) šūnās rekombinanto olbaltumvielu kodējošo gēnu transkribē hromosomā kodētā T7 RNS polimerāze (T7 RNAP), kas veic transkripciju astoņas reizes ātrāk nekā parastā E. coli RNAP. Tas padara celmu BL21(DE3) ļoti efektīvu un par vienu no visbiežāk izvēlētajām šūnu sistēmām olbaltumvielu ekspresijai.

Protokols BL21 šūnu līzei ar ultraskaņu un olbaltumvielu ekstrakcijai

BL21 šūnu līzi lielākoties veic ar ultraskaņu kombinācijā ar nātrija lauroilsarkozinātu (pazīstams arī kā sarkozils), ko izmanto kā līzes buferšķīdumu. Šūnu sagraušanas ar ultraskaņu un olbaltumvielu ekstrakcijas priekšrocības ir uzticamība, reproducējamība, kā arī vienkārša, droša un ātra ultraskaņas ierīču darbība. Tālāk sniegtajā protokolā soli pa solim aprakstīta BL21 šūnu līze ar ultraskaņu:

• Lai atdalītu šaperonu olbaltumvielas, BL21 baktēriju nogulsnes tika resuspendētas 50 ml ledusauksta nātrija Tris-EDTA (STE) buferšķīduma (kas satur 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl un ir papildināts ar 100 mM PMSF).
• Pēc tam pievieno 500 ul lizocīma (10 mg/ ml) un šūnas inkubē uz ledus 15 min.
• Pēc tam pievieno 500 ul DTT un 7 ml sarkozila (10% (w/v) šķīdums, kas pagatavots STE buferšķīdumā).
• Visiem attīrīšanas buferšķīdumiem obligāti jābūt ledusaukstiem, un paraugi visu laiku jāuztur uz ledus. Visi attīrīšanas posmi pēc iespējas jāveic aukstuma telpā.



• Līzei ar ultraskaņu un olbaltumvielu ekstrakcijai paraugus apstrādā ar ultraskaņu, izmantojot VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 sec ar 100% amplitūdu un 2 min intervālu starp katru apstrādi ar ultraskaņu. Alternatīvi var izmantot zondes tipa ultraskaņas homogenizatoru ar mikrouzgali, piemēram, UP200Ht ar S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. pauze starp ultraskaņas cikliem, 80% amplitūda).
• Turpmākajiem attīrīšanas posmiem paraugi jāuztur uz ledus vai arī jāuzglabā -80°C temperatūrā līdz turpmākai apstrādei.

Līze ar ultraskaņu precīzi kontrolētā temperatūrā

Strādājot ar bioloģiskiem paraugiem, izšķiroša nozīme ir precīzai un uzticamai temperatūras kontrolei. Augsta temperatūra paraugos izraisa termiski inducētu olbaltumvielu noārdīšanos.
Tāpat kā visas mehāniskās paraugu sagatavošanas metodes, arī apstrāde ar ultraskaņu rada siltumu. Tomēr, izmantojot VialTweeter, paraugu temperatūru var labi kontrolēt. Piedāvājam dažādas iespējas uzraudzīt un kontrolēt paraugu temperatūru, sagatavojot tos analīzei ar VialTweeter un VialPress.

1. Parauga temperatūras uzraudzība: ultraskaņas procesors UP200St, kas darbina VialTweeter, ir aprīkots ar viedu programmatūru un pievienojamu temperatūras sensoru. Pievienojiet temperatūras sensoru UP200St un ievietojiet temperatūras sensora galu vienā no paraugu mēģenēm. Izmantojot digitālo krāsu skārienekrānu, UP200St izvēlnē varat iestatīt konkrētu temperatūras diapazonu parauga apstrādei ar ultraskaņu. Ultraskaņas aparāts automātiski pārtrauks darbību, kad būs sasniegta maksimālā temperatūra, un ieturēs pauzi, līdz parauga temperatūra pazemināsies līdz iestatītā temperatūras diapazona ∆ apakšējai robežai. Pēc tam apstrāde ar ultraskaņu automātiski atsāksies. Šī viedā funkcija novērš siltuma izraisītu noārdīšanos.
2. VialTweeter bloku var iepriekš atdzesēt. Ievietojiet VialTweeter bloku (tikai sonotrodi bez pārveidotāja!) ledusskapī vai saldētavā, lai iepriekš atdzesētu titāna bloku – tas palīdz aizkavēt temperatūras paaugstināšanos paraugā. Ja iespējams, arī pašu paraugu var iepriekš atdzesēt.
3. Dzesēšanai apstrādes ar ultraskaņu laikā izmantojiet sauso ledu. Izmantojiet seklu paplāti, kas piepildīta ar sauso ledu, un novietojiet VialTweeter uz ledus, lai siltums varētu ātri izkliedēties.

Klienti visā pasaulē izmanto VialTweeter un VialPress ikdienas paraugu sagatavošanai bioloģijas, bioķīmijas, medicīnas un klīniskajās laboratorijās. UP200St procesora viedā programmatūra un temperatūras kontroles funkcija nodrošina uzticamu temperatūras kontroli un novērš siltuma izraisītu paraugu noārdīšanos. Paraugu sagatavošana ar ultraskaņu, izmantojot VialTweeter un VialPress, nodrošina ļoti uzticamus un reproducējamus rezultātus!
 

Atrodiet optimālo ultraskaņas šūnu sagrāvēju savam līzes pielietojumam

Hielscher Ultrasonics ir ražotājs ar ilggadēju pieredzi augstas veiktspējas ultraskaņas šūnu sagrāvēju un homogenizatoru ražošanā laboratorijām, galda un rūpnieciska mēroga sistēmām. Jūsu baktēriju šūnu kultūras lielums, pētniecības vai ražošanas mērķis un stundā vai dienā apstrādājamo šūnu tilpums ir būtiski faktori, lai izvēlētos jūsu pielietojumam piemērotu ultraskaņas šūnu sagrāvēju.
Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus risinājumus vairāku paraugu vienlaicīgai apstrādei ar ultraskaņu (līdz 10 flakoniem ar VialTweeter) un liela paraugu skaita apstrādei (t. i., mikrotitrēšanas platēm / ELISA platēm ar UIP400MTP), kā arī klasiskus zondes tipa laboratorijas ultraskaņas aparātus ar dažādiem jaudas līmeņiem no 50 līdz 400 vatiem un pilnībā rūpnieciskus ultraskaņas procesorus ar jaudu līdz 16 000 vatiem uz vienu ierīci komerciālai šūnu sagraušanai un proteīnu ekstrakcijai lielapjoma ražošanā. Visi Hielscher ultraskaņas aparāti ir paredzēti darbībai 24/7/365 ar pilnu slodzi. Izturība un uzticamība ir mūsu ultraskaņas ierīču pamatīpašības.
Visi digitālie ultraskaņas homogenizatori ir aprīkoti ar viedu programmatūru, krāsu skārienekrānu un automātisku datu reģistrēšanu, kas padara ultraskaņas ierīci par ērtu darba rīku laboratorijās un ražotnēs.
Informējiet mūs, kāda veida šūnas, kādā tilpumā, cik bieži un ar kādu mērķi jums jāapstrādā savos bioloģiskajos paraugos. Mēs ieteiksim jūsu procesa prasībām vispiemērotāko ultraskaņas šūnu sagrāvēju.

Tālāk redzamā tabula sniedz priekšstatu par mūsu ultraskaņas sistēmu aptuveno apstrādes jaudu – no kompaktiem rokas homogenizatoriem un vairāku paraugu ultraskaņas aparātiem līdz rūpnieciskiem ultraskaņas procesoriem komerciāliem pielietojumiem:

Literatūra / Atsauces

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.