BL21 šūnu līze ar ultrasonikāciju
BL21 šūnas ir E. coli celms, ko plaši izmanto pētniecības laboratorijās, biotehnoloģijā un rūpnieciskajā ražošanā, jo tās spēj ļoti efektīvi ekspresēt proteīnus. Ultraskaņas šūnu darbības traucējumi, līze un olbaltumvielu ekstrakcija ir izplatīta metode, lai izolētu un savāktu mērķa proteīnus no BL21 šūnu iekšpuses. Ultrasonication pilnībā traucē šūnu un atbrīvo visus iekļuvušos proteīnus, padarot 100% proteīna pieejamu.
BL21 šūnas proteīnu ekspresijai
BL21 šūna ir ķīmiski kompetents E. coli baktēriju celms, kas piemērots transformācijai un augsta līmeņa olbaltumvielu ekspresijai, izmantojot T7 RNS polimerāzes-IPTG indukcijas sistēmu. BL21 šūnas nodrošina augstas efektivitātes proteīna ekspresiju jebkuram gēnam, kas atrodas T7 promotora kontrolē. E. coli celms BL21(DE3) ir T7 RNS polimerāzes bāzes proteīnu ražošanas celms, kas apvienots ar T7 promotora ekspresijas vektoriem un tiek plaši izmantots laboratorijās un rūpniecībā, lai ražotu rekombinantus proteīnus. BL21(DE3) gēna, kas kodē rekombinanto proteīnu, ekspresiju transkribē hromosomāli kodētā T7 RNS polimerāze (T7 RNAP), kas transkribē astoņas reizes ātrāk nekā parastā E. coli RNAP. Tas padara celmu BL21(DE3) ļoti efektīvu un pārvērš to par vienu no vēlamākajām olbaltumvielu ekspresijas šūnu sistēmām.
Protokols ultraskaņas līzei un proteīnu ekstrakcijai no BL21 šūnām
BL21 šūnu līze galvenokārt tiek veikta, izmantojot ultrasonication kombinācijā ar nātrija lauroila sarkosinātu (pazīstams arī kā sarkosyl) kā līzes buferšķīdumu. Ultraskaņas šūnu darbības traucējumu un olbaltumvielu ekstrakcijas priekšrocības ir ultraskaņas aparātu uzticamība, reproducējamība, kā arī vienkārša, droša un ātra darbība. Zemāk redzamais protokols sniedz soli pa solim virzienu ultraskaņas BL21 šūnu līzei:
- Lai atdalītu haperona proteīnus, BL21 baktēriju granulas tika atkārtoti suspendētas 50 ml ledus aukstā nātrija Tris-EDTA (STE) buferšķīdumā (kas sastāv no 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, kas papildināts ar 100 mM PMSF).
- Pievieno 500 ul lizocīma (10 mg/ ml) un šūnas inkubē uz ledus 15 min.
- Pēc tam pievieno 500 ul DTT un 7 ml sarkosila (10% (m/V), kas pagatavoti STE buferšķīdumā).
- Ir svarīgi, lai visi attīrīšanas buferi būtu ledusauksti un lai paraugi vienmēr būtu uz ledus. Ja iespējams, visi attīrīšanas soļi jāveic aukstā telpā.
- Ultraskaņas līzei un olbaltumvielu ekstrakcijai paraugi tiek apstrādāti ar ultraskaņu VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 sekundes ar 100% amplitūdu ar 2 minūšu intervālu starp katru ultraskaņu. Alternatīvi, zondes tipa ultraskaņas homogenizators ar mikro-galu, piemēram, UP200Ht ar S26d2 (3 x 30 sek., 2 min. pauze starp ultraskaņas cikliem, 80% amplitūda).
- Turpmākiem attīrīšanas posmiem paraugi jāuzglabā uz ledus vai alternatīvi jāuzglabā -80 °C temperatūrā līdz turpmākai apstrādei.
Ultraskaņas šūnu traucētājs UP200St ar mikro-galu S26d2 līzei un olbaltumvielu ekstrakcijai
Ultraskaņas līze prescise temperatūras kontrolē
Precīza un uzticama temperatūras kontrole ir būtiska, rīkojoties ar bioloģiskajiem paraugiem. Augsta temperatūra ierosina termiski izraisītu olbaltumvielu noārdīšanos paraugos.
Tāpat kā visas mehāniskās paraugu sagatavošanas metodes, ultraskaņas apstrāde rada siltumu. Tomēr, lietojot VialTweeter, paraugu temperatūru var labi kontrolēt. Mēs piedāvājam jums dažādas iespējas, kā uzraudzīt un kontrolēt jūsu paraugu temperatūru, vienlaikus sagatavojot tos ar VialTweeter un VialPress analīzei.
- Parauga temperatūras uzraudzība: Ultraskaņas procesors UP200St, kas vada VialTweeter, ir aprīkots ar inteliģentu programmatūru un pievienojamu temperatūras sensoru. Pievienojiet temperatūras sensoru UP200St un ievietojiet temperatūras sensora galu vienā no parauga mēģenēm. Izmantojot digitālo krāsaino skārienekrānu, UP200St izvēlnē varat iestatīt noteiktu temperatūras diapazonu ultraskaņas paraugam. Ultrasonicator automātiski apstāsies, kad tiks sasniegta maksimālā temperatūra, un pauze, līdz parauga temperatūra ir pazemināta līdz iestatītās temperatūras zemākajai vērtībai ∆. Tad ultraskaņas apstrāde atkal sākas automātiski. Šī viedā funkcija novērš siltuma izraisītu degradāciju.
- VialTweeter bloku var iepriekš atdzesēt. Ievietojiet VialTweeter bloku (tikai sonotrode bez devēja!) ledusskapī vai saldētavā, lai iepriekš atdzesētu titāna bloku, kas palīdz atlikt temperatūras paaugstināšanos paraugā. Ja iespējams, arī pašu paraugu var iepriekš atdzesēt.
- Izmantojiet sausu ledu, lai atdzesētu ultraskaņas apstrādes laikā. Izmantojiet seklu paplāti, kas piepildīta ar sausu ledu, un novietojiet VialTweeter uz ledus, lai siltums varētu ātri izkliedēties.
Klienti visā pasaulē izmanto VialTweeter un VialPress ikdienas paraugu sagatavošanas darbam bioloģiskajās, bioķīmiskajās, medicīniskajās un klīniskajās laboratorijās. UP200St procesora inteliģentā programmatūra un temperatūras kontrole, temperatūra tiek droši kontrolēta un tiek novērsta siltuma izraisīta paraugu degradācija. Ultraskaņas paraugu sagatavošana ar VialTweeter un VialPress nodrošina ļoti ticamus un reproducējamus rezultātus!
Atrodiet optimālo ultraskaņas traucētāju jūsu līzes lietojumprogrammai
Hielscher Ultrasonics ir ilgstoši pieredzējis augstas veiktspējas ultraskaņas šūnu traucētāju un homogenizatoru ražotājs laboratorijām, stenda un rūpnieciskā mēroga sistēmām. Jūsu baktēriju šūnu kultūras lielums, jūsu pētniecības vai ražošanas mērķis un apstrādājamās šūnas apjoms stundā vai dienā ir būtiski faktori, lai atrastu pareizo ultraskaņas šūnu traucētāju jūsu lietojumam.
Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus risinājumus vienlaicīgai vairāku paraugu apstrādei ar ultraskaņu (līdz 10 flakoniem ar VialTweeter) un masas paraugiem (t.i., mikrotitrēšanas plāksnes / ELISA plāksnes ar UIP400MTP), kā arī klasisko zondes tipa laboratorijas ultrasonikatoru ar dažādiem jaudas līmeņiem no 50 līdz 400 vatiem līdz pilnībā rūpnieciskiem ultraskaņas procesoriem ar līdz pat 16 000 vatiem uz vienību komerciālu šūnu darbības traucējumiem un olbaltumvielu ekstrakcijai lielā ražošanā. Visi Hielscher ultrasonikatori ir būvēti 24/7/365 darbībai ar pilnu slodzi. Robustums un uzticamība ir mūsu ultraskaņas ierīču galvenās iezīmes.
Visi digitālie ultraskaņas homogenizatori ir aprīkoti ar gudru programmatūru, krāsainu skārienekrānu un automātisku datu protokolēšanu, kas padara ultraskaņas ierīci par ērtu darba rīku laboratorijā un ražošanas iekārtās.
Paziņojiet mums, kāda veida šūnas, kāds tilpums, ar kādu biežumu un ar kādu mērķi jums ir jāapstrādā jūsu bioloģiskie paraugi. Mēs ieteiksim jums vispiemērotāko ultraskaņas šūnu traucētāju jūsu procesa prasībām.
Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu ultraskaņas sistēmu aptuveno apstrādes jaudu no kompaktiem rokas homogenizatoriem un MultiSample Ultrasonicators līdz rūpnieciskiem ultraskaņas procesoriem komerciāliem lietojumiem:
| Partijas apjoms | Plūsmas ātrums | Ieteicamās ierīces |
|---|---|---|
| 96 urbumu / mikrotitru plāksnes | n.p. | UIP400MTP |
| 10 flakoni à 0,5 līdz 1,5 ml | n.p. | VialTweeter pie UP200St |
| 0.01 līdz 250 ml | 5 līdz 100 ml/min | UP50H |
| 0.01 līdz 500 ml | 10 līdz 200 ml/min | UP100H |
| 10 līdz 2000 ml | 20 līdz 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 līdz 20L | 02 līdz 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 līdz 100L | 2 līdz 10L/min | UIP4000hdT |
| n.p. | 10 līdz 100L/min | UIP16000 |
| n.p. | Lielāku | kopa UIP16000 |
Sazinieties ar mums! / Jautājiet mums!
UIP400MTP plāksnes sonikators augstas caurlaidspējas šūnu darbības traucējumiem 96 iedobju platēs
Ultrasonicator UP200Ht ar 2 mm mikrotipu S26d2 mazu paraugu apstrādei ar ultraskaņu
Lasiet vairāk par to, kā jūs varat izmantot savu ultraskaņas audu homogenizatoru, lai efektīvi un droši sagatavotu bufera šķīdumus!
Fakti, kurus ir vērts zināt
Escherichia Coli baktērijas
Escherichia coli ir baktēriju veids, kas nav sporu veidošanās, gramnegatīvs, un to raksturo taisna stieņa forma. E.coli baktērijas atrodas cilvēku un dzīvnieku vidē, pārtikā un zarnās. E. coli parasti ir kustīgs, izmantojot peritrichous flagella, bet ir arī nemotile veidi. E.coli ir tā sauktie fakultatīvi anaerobie ķīmorganotrofie organismi, kas nozīmē, ka tie spēj gan elpošanas, gan fermentatīvo metabolismu. Lielākā daļa E.coli tipu ir labdabīgi un pilda noderīgas funkcijas organismā, piemēram, nomāc kaitīgo baktēriju sugu augšanu, sintezē vitamīnus u.c.
Tā sauktā B tipa Escherichia coli baktēriju šūnas ir īpaša E.coli celmu kategorija, ko plaši izmanto pētījumos, lai izpētītu tādus mehānismus kā bakteriofāgu jutība vai ierobežošanas modifikācijas sistēmas. Turklāt E.coli baktērijas tiek vērtētas kā uzticams darbarīks olbaltumvielu ekspresijai biotehnoloģiju un dzīvības zinātņu laboratorijās. Piemēram, E.coli izmanto, lai rūpnieciskā mērogā sintezētu tādus savienojumus kā olbaltumvielas un oligosaharīdus. Sakarā ar īpašām iezīmēm, piemēram, proteāzes deficītu, zemu acetāta veidošanos ar augstu glikozes līmeni un uzlabotu caurlaidību, E. coli B šūnas ir visbiežāk izmantotās saimniekšūnas ģenētiski modificētu proteīnu ražošanai.
Rekombinantais proteīns
Rekombinantie proteīni (rProt) iegūst ievērojamu nozīmi daudzveidīgās nozarēs, tostarp ķīmiskās ražošanas, farmācijas, kosmētikas, cilvēku un dzīvnieku medicīnas, lauksaimniecības, pārtikas, kā arī atkritumu apstrādes nozarēs.
Rekombinantā proteīna ražošanai nepieciešams izmantot izteiksmes sistēmu. Kā ekspresijas šūnu sistēmas rekombinantās DNS ražošanai var izmantot gan prokariotu, gan eikariotu šūnas. Lai gan baktēriju šūnas visplašāk tiek izmantotas olbaltumvielu ekspresijai tādu faktoru dēļ kā zemas izmaksas, viegla mērogojamība un vienkārši vides apstākļi, zīdītāju, rauga, aļģu, kukaiņu un bezšūnu sistēmas ir izveidotas alternatīvas. Olbaltumvielu veids, funkcionālā aktivitāte, kā arī nepieciešamais izteiktā proteīna daudzums ietekmē olbaltumvielu ekspresijai izmantotās šūnu sistēmas izvēli.
Lai izteiktu rekombinanto proteīnu, konkrētai šūnai jābūt transficētai ar DNS vektoru, kas satur rekombinantās DNS veidni. Pēc tam šūnas, kas transficētas ar veidni, tiek kultivētas. Šūnu mehānisma rezultātā šūnas pārraksta un tulko interesējošo proteīnu, tādējādi radot mērķa proteīnu.
Tā kā ekspresētie proteīni ir iekļuvuši šūnu matricā, šūnai jābūt lizētai (izjauktai un salauztai), lai atbrīvotu proteīnus. Nākamajā attīrīšanas posmā proteīns tiek atdalīts un attīrīts.
Pirmais ārstēšanā izmantotais rekombinantais proteīns bija rekombinantais cilvēka insulīns 1982. gadā. Šodien visā pasaulē tiek ražoti vairāk nekā 170 rekombinanto olbaltumvielu veidi medicīniskai ārstēšanai. Parasti medicīnā izmantotie rekombinantie proteīni ir, piemēram, rekombinantie hormoni, interferoni, interleikīni, augšanas faktori, audzēja nekrozes faktori, asins recēšanas faktori, trombolītiskie līdzekļi un fermenti tādu smagu slimību ārstēšanai kā diabēts, dwarfism, miokarda infarkts, sastrēguma sirds mazspēja, smadzeņu apopleksija, multiplā skleroze, neitropēnija, trombocitopēnija, anēmija, hepatīts, reimatoīdais artrīts, astma, Krona slimība un vēža terapija. (sk. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatūra / Atsauces
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonikators vienlaicīgai 10 paraugu apstrādei ar ultraskaņu, piemēram, lai izjauktu BL21 šūnas
Augstas veiktspējas ultrasonogrāfija! Hielscher produktu klāsts aptver pilnu spektru no kompakta laboratorijas ultrasonikatora virs galda vienībām līdz pilnām rūpnieciskām ultraskaņas sistēmām.