Drosophila melanogaster paraugu līze ar ultraskaņu

Drosophila melanogaster laboratorijās plaši izmanto kā modeļorganismu. Tādēļ bieži jāveic tādi Drosophila melanogaster paraugu pirmsanalītiskās sagatavošanas posmi kā līze, šūnu sagraušana, olbaltumvielu ekstrakcija un DNS fragmentēšana ar bīdes spēkiem. Ultraskaņas dezintegratori ir uzticami un efektīvi, un ar tiem var viegli veikt dažādus uzdevumus, piemēram, līzi, olbaltumvielu ekstrakciju vai DNS fragmentēšanu, tikai pielāgojot ultraskaņas procesa parametrus. Tādējādi ultraskaņas homogenizatori ir daudzpusīgi instrumenti ar plašu pielietojumu klāstu.

Līze un olbaltumvielu ekstrakcija ar ultraskaņu

Līze, šūnu solubilizācija, audu homogenizācija un olbaltumvielu ekstrakcija ir tipiski ultraskaņas dezintegratoru uzdevumi bioloģijas laboratorijās. Ultraskaņas dezintegratori un šūnu sagraušanas ierīces ir labi piemērotas dzīvnieku audu, kukaiņu (piemēram, Drosophila melanogaster, C. elegans) vai augu paraugu homogenizēšanai. Turpmākie ultraskaņas apstrādes pielietojumi ir šūnu suspensiju un nogulšņu līze, kā arī intracelulāro olbaltumvielu ekstrakcija.
Līze un olbaltumvielu ekstrakcija ar ultraskaņu ir ļoti uzticami un reproducējami procesi, kurus var veikt, pamatojoties uz izstrādātiem protokoliem. Tā kā ultraskaņas procesa intensitāti var precīzi regulēt ar tādiem apstrādes ar ultraskaņu parametriem kā amplitūda, ciklu / impulsu režīms, temperatūra un parauga tilpums, vienreiz pārbaudītus protokolus var atkārtot atkal un atkal, iegūstot tādu pašu rezultātu.

DNS un RNS fragmentēšana ar ultraskaņu

Pēc šūnu līzes un olbaltumvielu ekstrakcijas paraugu sagatavošanā bieži nepieciešams DNS, RNS un hromatīna apstrādes posms – fragmentēšana ar bīdes spēkiem, piemēram, pirms hromatīna imūnprecipitācijas (ChIP). DNS un RNS fragmentēšanu var uzticami panākt, ar fizikāliem spēkiem pārraujot kovalentās saites, kas satur DNS kopā. Izmantojot fizikālu bīdes iedarbību, piemēram, apstrādi ar ultraskaņu, vispirms tiek pārrautas DNS ķēdes, pēc tam DNS tiek sadalīta mazākos fragmentos.
DNS fragmentēšana ar ultraskaņu ir uzticama un efektīva metode DNS sadalīšanai ar bīdes spēkiem līdz noteiktam garumam, piemēram, 500bp (bāzu pāri). Galvenās DNS fragmentēšanas ar ultraskaņu priekšrocības ietver precīzu ultraskaņas procesa parametru un intensitātes kontroli. Ultraskaņas procesa parametrus var pielāgot, precīzi regulējot apstrādes ar ultraskaņu intensitāti, ciklus un ilgumu. Tas ļauj iegūt vēlamā izmēra DNS fragmentus, un noteikto DNS garumu var uzticami iegūt arī atkārtoti. DNS fragmentēšana ar ultraskaņas radītiem bīdes spēkiem ir ideāli piemērota arī DNS fragmentu ar lielu molekulmasu iegūšanai.

Drosophila melanogaster līzes ar ultraskaņu protokoli

Tālāk ir pieejami dažādi protokoli Drosophila paraugu līzei, olbaltumvielu ekstrakcijai un DNS vai hromatīna fragmentēšanai ar ultraskaņas palīdzību.

Līze ar ultraskaņu šķērssaistīšanas un imūnprecipitācijas (CLIP) analīzei

CLIP analīze tika veikta, kā aprakstīts iepriekš, ar dažām modifikācijām. Aptuveni 20 mg olnīcu no 0–1 dienu vecām savvaļas tipa mātītēm tika pakļautas šķērssaistīšanai ar UV starojumu (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizētas uz ledus 1 mL RCB buferšķīduma (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharozes, 1 mM DTT, 1× EDTA nesaturošu Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF), kam pievienotas 300 U RNAseOUT, un novietotas uz ledus uz 30 min. Homogenāts tika apstrādāts ar ultraskaņu uz ledus ar 80% jaudu piecas reizes pa 20 s ar 60 s pārtraukumu starp apstrādes reizēm, izmantojot Hielscher ultraskaņas procesoru UP100H (100 W, 30 kHz), un centrifugēts (16 000 × g 5 min 4°C temperatūrā). Šķīstošo ekstraktu iepriekš attīrīja ar 20 μl Protein-G Dynabeads lodīšu 20 min 4°C temperatūrā. Pēc paraugu paņemšanas imūnblotēšanai un sākotnējā RNS daudzuma noteikšanai (1%) HP1 imūnprecipitēja no 450 μl iepriekš attīrīta ekstrakta ar anti-HP1 9A9 antivielu, inkubējot 4 h ar 50 μl Protein-G Dynabeads lodīšu. Imūnprecipitātus 4 reizes mazgāja ar RCB. Lai eluētu imūnprecipitētās RNS, nogulsnētās lodītes 5 min vārīja 100 μL UltraPure DEPC-treated Water. RNS sagatavošanai iegūtajam supernatantam pievienoja 900 μL Qiazol Reagent. Attīrīto RNS izmantoja kā matricu cDNS sintēzei, izmantojot oligo dT, nejaušus heksamērus un SuperScript reverso transkriptāzi III saskaņā ar ražotāja protokolu.
(Cassale et al. 2019)

Ultraskaņas līze hromatīna imūnprecipitācijas analīzei

Hromatīna imūnprecipitāciju veica saskaņā ar Menet aprakstīto metodi ar nelielām izmaiņām. Aptuveni 20 mg olnīcu no 0–1 dienu vecām savvaļas tipa mātītēm homogenizēja 1 mL NEB buferšķīduma (10 mM HEPES-Na pie pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pie pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pie pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidīna, 0,15 mM spermīna, 1× Complete proteāžu inhibitori bez EDTA) ar homogenizatoru / iegremdējamu disperģētāju 1 min (pie 3000 rpm). Homogenātu pārnesa uz iepriekš atdzesētu stikla Dounce homogenizatoru un veica 15 pilnus gājienus ar cieši piegulošu piestu. Pēc tam brīvos kodolus centrifugēja pie 6000xg 10 min 4°C temperatūrā. Kodolus saturošās nogulsnes resuspendēja 1 mL NEB un centrifugēja pie 20 000 × g 20 min saharozes gradientā (0,65 mL 1,6 M saharozes NEB šķīdumā, 0,35 mL 0,8 M saharozes NEB šķīdumā). Nogulsnes resuspendēja 1 mL NEB un formaldehīdā līdz galīgajai koncentrācijai 1%. Kodolos veidoja šķērssaites 10 min istabas temperatūrā un reakciju apturēja, pievienojot 1/10 tilpuma 1,375 M glicīna. Kodolus savāca, centrifugējot pie 6000 × g 5 min. Kodolus divreiz mazgāja 1 mL NEB un resuspendēja 1 mL līzes buferšķīduma (15 mM HEPES-Na pie pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pie pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% nātrija deoksiholāta, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozīna un 1× Complete proteāžu inhibitori bez EDTA). Kodolus apstrādāja ar ultraskaņu, izmantojot Hielscher ultraskaņas procesoru UP100H (100 W, 30 kHz), sešas reizes pa 20 s ar ieslēgtu ultraskaņu un 1 min uz ledus. Ar ultraskaņu apstrādātos kodolus centrifugēja pie 13 000 × g 4 min 4°C temperatūrā. Lielākās daļas ar ultraskaņu apstrādātā hromatīna garums bija 500–1000 bāzu pāru (bp). Katrai imūnprecipitācijai 15 μg hromatīna inkubēja 10 μg HP1 9A9 monoklonālās antivielas klātbūtnē (3 h 4°C temperatūrā rotējošā ritenī). Pēc tam pievienoja 50 μl Dynabeads protein G lodīšu un inkubāciju turpināja visu nakti 4°C temperatūrā. Supernatantus izmeta un paraugus divreiz mazgāja līzes buferšķīdumā (katru mazgāšanu 15 min 4 °C temperatūrā) un divreiz TE buferšķīdumā (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pie pH 8). Hromatīnu eluēja no lodītēm divos posmos; vispirms 100 μl eluēšanas buferšķīduma 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pie pH 8) 65°C temperatūrā 15 min, pēc tam centrifugēja un savāca supernatantu. Lodīšu materiālu atkārtoti ekstrahēja 100 μl TE + 0,67% SDS. Apvienoto eluātu (200 μl) inkubēja visu nakti 65°C temperatūrā, lai pārrautu šķērssaites, un apstrādāja ar 50 μg/ml RNaseA 15 min 65°C temperatūrā un ar 500 μg/ml proteināzes K 3 h 65°C temperatūrā. Paraugus ekstrahēja ar fenolu–hloroformu un izgulsnēja ar etanolu. DNS resuspendēja 25 μl ūdens. Lai maksimāli paplašinātu molekulārās analīzes ar imūnprecipitēto DNS, kandidātgēnus amplificēja pa pāriem, izmantojot optimizētu dupleksās PCR protokolu ar diviem dažādiem praimeru komplektiem ar līdzīgām kušanas temperatūrām vienā reakcijā.
(Casale et al. 2019)
 

Augstas veiktspējas ultraskaņas šūnu sagrāvēji bioloģiskajiem paraugiem

Hielscher Ultrasonics ir jūsu partneris ar ilggadēju pieredzi augstas veiktspējas ultraskaņas aparātu jomā, kurus izmanto šūnu sagraušanai, līzei, olbaltumvielu ekstrakcijai, DNS, RNS un hromatīna fragmentēšanai, kā arī citiem paraugu sagatavošanas posmiem pirms analīzes. Piedāvājot plašu laboratorijas ultraskaņas homogenizatoru un paraugu sagatavošanas iekārtu klāstu, Hielscher nodrošina ideālu ultraskaņas ierīci jūsu bioloģiskajam lietojumam un prasībām.
Klasisks zondes tipa ultraskaņas aparāts ar mikrouzgali, piemēram, UP200St (200W; skatīt attēlu pa kreisi), vai kāda no ultraskaņas paraugu sagatavošanas iekārtām VialTweeter vai UP200ST_TD_CupHorn ar VialHolder ir iecienīti modeļi pētniecības un analītiskajās laboratorijās. Klasiskā ultraskaņas zonde ir ideāli piemērota gadījumiem, kad nepieciešams veikt līzi, ekstrakciju vai fragmentēšanu mazākam paraugu skaitam. Paraugu sagatavošanas iekārtas VialTweeter un UP200St_TD_CupHorn ļauj vienlaikus apstrādāt ar ultraskaņu attiecīgi līdz 10 vai 5 flakoniem.
Ja jāapstrādā liels paraugu skaits (piemēram, 96 iedobju plates, mikrotitrēšanas plates u. c.), UIP400MTP ir ideāla iekārta apstrādei ar ultraskaņu. UIP400MTP darbojas kā lielāks kausveida ultraskaņas rezonators, kas ir piepildīts ar ūdeni un kurā ir pietiekami daudz vietas mikroiedobju plašu ievietošanai. UIP400MTP darbību nodrošina jaudīgs 400 vatu ultraskaņas procesors, kas nodrošina ļoti vienmērīgu un intensīvu daudzu iedobju plašu apstrādi ar ultraskaņu, lai sagrautu šūnas, veiktu paraugu līzi, šķīdinātu nogulsnes, ekstrahētu olbaltumvielas vai fragmentētu DNS ar bīdes spēkiem.

Precīza vadība ar viedu programmatūru

Visi Hielscher risinājumi apstrādei ar ultraskaņu, sākot no 200 vatiem, ir aprīkoti ar digitālu krāsu skārienekrānu un viedu programmatūru. Viedā datu reģistrēšana nodrošina, ka visi ultraskaņas procesa parametri tiek automātiski saglabāti CSV failā iebūvētajā SD kartē, tiklīdz tiek iedarbināts ultraskaņas aparāts. Tas padara pētniecību un protokolēšanu daudz ērtāku. Pēc apstrādes ar ultraskaņu izmēģinājumiem vai paraugu sagatavošanas varat ērti pārskatīt un salīdzināt katra apstrādes cikla parametrus.
Intuitīvajā izvēlnē pirms apstrādes ar ultraskaņu var iepriekš iestatīt daudzus parametrus. Piemēram, lai kontrolētu parauga temperatūru un novērstu tā termisko noārdīšanos, var iestatīt parauga temperatūras augšējo robežu. Pievienojams temperatūras sensors, kas ir iekļauts ultraskaņas iekārtas komplektācijā, sniedz ultraskaņas procesoram atgriezenisko saiti par faktisko temperatūru apstrādes laikā. Kad tiek sasniegta temperatūras augšējā robeža, ultraskaņas ierīce pārtrauc darbību, līdz tiek sasniegta iestatītā ∆T apakšējā robeža, un tad automātiski atsāk apstrādi ar ultraskaņu.
Ja nepieciešama apstrāde ar ultraskaņu ar noteiktu ievadītās enerģijas daudzumu, varat iepriekš iestatīt apstrādes beigās sasniedzamo ultraskaņas enerģijas daudzumu. Protams, arī ultraskaņas pulsāciju un cikla režīmu var iestatīt individuāli.
Lai atkārtoti izmantotu visveiksmīgākos apstrādes ar ultraskaņu parametrus, varat saglabāt dažādus apstrādes režīmus (piemēram, apstrādes laiku, intensitāti, cikla režīmu u. c.) kā iepriekš iestatītus režīmus, lai tos varētu viegli un ātri palaist atkārtoti.
Lielākai lietošanas ērtībai visas digitālās ultraskaņas iekārtas var attālināti vadīt jebkurā izplatītā pārlūkprogrammā (piemēram, InternetExplorer, Safari, Chrome u. c.). LAN savienojumu var vienkārši izveidot pēc pieslēgšanas un tūlītējas lietošanas principa, un tam nav nepieciešama papildu programmatūras instalēšana.
Mēs Hielscher zinām, ka veiksmīgai bioloģisko paraugu apstrādei ar ultraskaņu nepieciešama precizitāte un atkārtojamība. Tāpēc esam izstrādājuši savus ultraskaņas aparātus kā viedas ierīces ar visām funkcijām, kas ļauj efektīvi, uzticami, reproducējami un ērti sagatavot paraugus.

Tālāk redzamā tabula sniedz priekšstatu par mūsu ultraskaņas sistēmu aptuveno apstrādes jaudu – no ultraskaņas mikrouzgaļiem un klasiskajiem ultraskaņas homogenizatoriem līdz MultiSample ultraskaņas aparātiem ērtai un uzticamai daudzu paraugu sagatavošanai: