Drosophila Melanogaster paraugu ultraskaņas līze

Drosophila melanogaster tiek plaši izmantots laboratorijās kā modeļa organisms. Tāpēc bieži jāveic drosophila melanogaster paraugu pirmsanalīzes sagatavošanas posmi, piemēram, līze, šūnu darbības traucējumi, olbaltumvielu ekstrakcija un DNS nobīde. Ultraskaņas dismembrators ir uzticams un efektīvs, un to var izmantot, lai veiktu dažādus uzdevumus, piemēram, līzi, olbaltumvielu ekstrakciju vai DNS sadrumstalotību, tikai pielāgojot ultraskaņas procesa parametrus. Ultraskaņas homogenizatori tādējādi ir elastīgi instrumenti ar plašu lietojumu klāstu.

Ultraskaņas līze un olbaltumvielu ekstrakcija

Līze, šūnu šķīdināšana, audu homogenizācija un olbaltumvielu ekstrakcija ir tipiski uzdevumi ultraskaņas dismembrators bioloģiskajās laboratorijās. Ultraskaņas dismembrators un šūnu traucētāji ir labi piemēroti, lai homogenizētu dzīvnieku audus, kukaiņus (piemēram, Drosophila melanogaster, C. elegans) vai augu paraugus. Turpmākie ultrasonication pielietojumi ir šūnu suspensiju un granulu līze, kā arī intracelulāro proteīnu ekstrakcija.
Ultraskaņas līze un olbaltumvielu ekstrakcija ir ļoti uzticami un reproducējami procesi, kurus var veikt, pamatojoties uz izveidotiem protokoliem. Tā kā ultraskaņas procesa intensitāti var precīzi pielāgot, izmantojot ultraskaņas parametrus, piemēram, amplitūdu, cikla / impulsa režīmu, temperatūru un parauga tilpumu, kad pierādītos protokolus var atkārtot ar tādu pašu iznākumu atkal un atkal.

Ultraskaņas DNS un RNS sadrumstalotība

Pēc šūnu līzes un olbaltumvielu ekstrakcijas kopīgs nepieciešamais solis parauga sagatavošanā ir DNS, RNS un hromatīna nobīde un fragmentācija, piemēram, pirms hromatīna imūnprecipitācijas (ChIP). DNS un RNS fragmentāciju var droši panākt, pārraujot kovalentās saites, kas satur DNS kopā ar fiziskiem spēkiem. Izmantojot fizisku bīdīšanu, piemēram, ultraskaņu, vispirms DNS dzīslas tiek sadalītas, tad DNS tiek sadalīta mazākos gabalos.
Ultraskaņas DNS fragmentācija ir uzticama un efektīva DNS nobīdē līdz noteiktam garumam, piemēram, 500bp (bāzes pāri). Ultraskaņas DNS sadrumstalotības galvenās priekšrocības ietver precīzu ultraskaņas procesa parametru un intensitātes kontroli. Ultraskaņas procesa parametrus var pielāgot, precīzi noregulējot ultraskaņas intensitāti, ciklus un laiku. Tas ļauj izveidot vēlamos DNS izmērus, un mērķa DNS garumu var droši iegūt, kā arī reproducēt. Ultraskaņas DNS nobīde ir arī ideāla, lai radītu augstas molekulmasas DNS fragmentus.

Drosophila melanogaster ultraskaņas līzes protokoli

Zemāk jūs varat atrast dažādus protokolus Drosophila paraugu ultrasoniski atbalstītai līzei, olbaltumvielu ekstrakcijai un DNS vai hromatīna sadrumstalotībai.

Ultraskaņas līze šķērssaistīšanas imūnprecipitācijām (CLIP) Tests

CLIP tests tika veikts, kā iepriekš ziņots, ar dažām izmaiņām. Aptuveni 20 mg olnīcu no 0 līdz 1 dienu vecām savvaļas tipa mātītēm bija UV šķērssaistītas (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizētas uz ledus 1 ml RCB buferšķīdumā (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoze, 1 mM DTT, 1× EDTA nesaturoši pilnīgie proteāzes inhibitori, 1 mM PMSF), kas papildināti ar 300 U RNAseOUT un novietoti uz ledus 30 min. Homogenāts tika apstrādāts ar ultraskaņu uz ledus, ar 80% jaudu, piecas reizes 20 s pārrāvumos ar 60 s atpūtu, izmantojot Hielscher ultraskaņas procesoru UP100H (100 W, 30 kHz) un centrifugē (16000 × g 5 minūtes 4 °C temperatūrā). Šķīstošais ekstrakts tika iepriekš attīrīts ar 20 μl Protein-G dynabeads 20 minūtes 4 °C temperatūrā. Pēc paraugu noņemšanas imunoblotingam un RNS ievades kvantitatīvai noteikšanai (1%), HP1 tika imūnprecipitēts ar anti-HP1 9A9 antivielu no 450 μl iepriekš attīrīta ekstrakta, inkubējot 4 stundas ar 50 μl Protein-G dynabeads. Imūnprecipitāti tika mazgāti 4 reizes ar RCB. Lai eluētu imūnprecipitētās RNS, granulētās lodītes vārīja 100 μL ar UltraPure DEPC apstrādāta ūdens 5 min. 900 μL Qiazol reaģenta tika pievienots supernatantam, kas atgūts RNS preparāta iegūšanai. Attīrītā RNS tika izmantota kā veidne, lai sintezētu cDNS, izmantojot oligo dT, nejaušus heksamērus un SuperScript reverso transkriptāzi III saskaņā ar ražotāja protokolu.
(Cassale et al. 2019)

Ultraskaņas līze hromatīna imūnprecipitācijas testam

Hromatīna imūnprecipitācija tika veikta saskaņā ar Menet aprakstīto metodi ar nelielām izmaiņām. Aptuveni 20 mg olnīcu no 0 līdz 1 dienu vecām savvaļas tipa mātītēm tika homogenizētas 1 ml NEB buferšķīduma (10 mM HEPES-Na pie pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pie pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pie pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidīna, 0,15 mM spermīna, 1× EDTA nesaturošiem pilnīgiem proteāzes inhibitoriem) ar homogenizatoru / iegremdēšanas izkliedētāju 1 min (pie 3000 apgr./min). Homogenāts tika pārnests uz iepriekš atdzesētu stikla dounce, un 15 pilni sitieni tika uzklāti ar stingru piestu. Pēc tam brīvos kodolus centrifugēja 6000xg temperatūrā 10 minūtes 4 ° C temperatūrā. Kodolus saturošas granulas atkārtoti suspendēja 1 ml NEB un centrifugēja 20000 × g 20 minūtes saharozes gradientā (0,65 ml 1,6 M saharozes NEB gadījumā, 0,35 ml 0,8 M saharozes NEB gadījumā). Granulveida nogulšņu atkārtota suspendēšana 1 ml NEB un formaldehīda līdz galīgajai koncentrācijai 1%. Kodoli tika savstarpēji saistīti 10 min istabas temperatūrā un dzesēti, pievienojot 1/10 vol 1,375 M glicīna. Kodolus savāca, centrifugējot 6000 × g 5 min. Kodoli tika mazgāti divas reizes 1 ml NEB un atkārtoti suspendēti 1 ml līzes buferšķīduma (15 mM HEPES-Na pie pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pie pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na dezoksiholāta, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarcosine un 1× EDTA nesaturoši pilnīgie proteāzes inhibitori). Kodoli tika apstrādāti ar ultraskaņu, izmantojot Hielscher ultraskaņas procesoru UP100H (100 W, 30 kHz) sešas reizes 20 s uz ledus un 1 min uz ledus. Ultraskaņas kodolus centrifugēja 13000 × g 4 min 4 °C temperatūrā. Lielākā daļa ultraskaņas hromatīna bija 500 līdz 1000 bāzu pāru (bp) garumā. Katrai imūnprecipitācijai 15 μg hromatīna inkubēja 10 μg HP1 9A9 monoklonālās antivielas klātbūtnē (3 stundas 4°C temperatūrā rotējošā ritenī). Pēc tam pievienoja 50 μl dynabeads proteīna G un turpināja inkubāciju pa nakti 4°C temperatūrā. Centrifugātus izmeta un paraugus divas reizes mazgāja līzes buferšķīdumā (katra mazgāšana 15 minūtes 4 °C temperatūrā) un divas reizes TE buferšķīdumā (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pie pH 8). Hromatīns tika eluēts no pērlītēm divos posmos; vispirms uz 100 μl eluīcijas buferšķīduma 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pie pH 8) 65 °C temperatūrā 15 minūtes, kam seko centrifugēšana un centrifugāta atgūšana. Pērlīšu materiāls tika atkārtoti ekstrahēts 100 μl TE + 0,67% SDS. Kombinēto eluātu (200 μl) inkubēja pa nakti 65 °C temperatūrā, lai mainītu šķērssaites, un apstrādāja ar 50 μg/ml RNaseA 15 minūtes 65 °C temperatūrā un ar 500 μg/ml proteināzes K 3 stundas 65 °C temperatūrā. Paraugi tika ekstrahēti ar fenola–hloroformu un izgulsnēti etanols. DNS tika atkārtoti suspendēta 25 μl ūdens. Lai maksimāli palielinātu molekulārās analīzes ar DNS imūnprecipitētu, kandidātgēni tika pastiprināti pa pāriem, izmantojot optimizētu duplekso-PCR protokolu, izmantojot divus dažādus praimeru komplektus ar līdzīgu kušanas temperatūru vienā reakcijā.
(Casale et al. 2019)
 

Augstas veiktspējas ultraskaņas šūnu traucētāji bioloģiskiem paraugiem

Hielscher Ultrasonics ir jūsu ilgi pieredzējis partneris, kad runa ir par augstas veiktspējas ultrasonikatoriem šūnu darbības traucējumiem, līzei, olbaltumvielu ekstrakcijai, DNS, RNS un hromatīna sadrumstalotībai, kā arī citiem pirmsanalīzes paraugu sagatavošanas soļiem. Piedāvājot visaptverošu ultraskaņas laboratorijas homogenizatoru un paraugu sagatavošanas vienību portfeli, Hielscher ir ideāla ultraskaņas ierīce jūsu bioloģiskajam pielietojumam un prasībām.
Klasisks zondes tipa ultrasonicator ar mikro-galu, piemēram, UP200St (200W; skatīt attēlu pa kreisi) vai kādu no ultraskaņas paraugu sagatavošanas vienībām VialTweeter vai UP200St_TD_CupHorn ar VialHolder ir iecienītākie modeļi pētniecības un analītiskajās laboratorijās. Klasiskā ultraskaņas zonde ir ideāla, sagatavojot mazāk paraugu, tie ir jālizē, ekstrahēti vai sadrumstaloti. Paraugu sagatavošanas vienības VialTweeter un UP200St_TD_CupHorn ļauj vienlaicīgi apstrādāt ar ultraskaņu attiecīgi līdz 10 vai 5 flakoniem.
Ja jāapstrādā liels paraugu skaits (piemēram, 96 iedobju plates, mikrotitrēšanas plates utt.), UIP400MTP ir ideāls ultraskaņas iestatījums. UIP400MTP darbojas kā lielāks cuphorn, kas ir piepildīts ar ūdeni un kam ir pietiekami daudz vietas, lai turētu mikro urbumu plāksnes. Darbojas ar 400 vatu jaudīgu ultraskaņas procesoru, UIP400MTP nodrošina ļoti vienmērīgu un intensīvu vairāku urbumu plākšņu ultraskaņu, lai izjauktu šūnas, lizētu paraugus, izšķīdinātu granulas, ekstraktu proteīnus vai bīdes DNS.

Precīza vadība, izmantojot viedo programmatūru

Visi Hielscher ultraskaņas apstrādes risinājumi no 200 vatiem uz augšu ir aprīkoti ar digitālo krāsu skārienekrānu un inteliģentu programmatūru. Izmantojot viedo datu protokolu, visi ultraskaņas procesa parametri tiek automātiski saglabāti kā CSV fails iebūvētajā SD kartē, tiklīdz tiek sākta ultrasonicator. Tas padara izpēti un protokolēšanu daudz ērtāku. Pēc ultraskaņas apstrādes izmēģinājumiem vai paraugu sagatavošanas jūs varat vienkārši pārskatīt katras ultraskaņas apstrādes parametrus un salīdzināt tos.
Izmantojot intuitīvo izvēlni, daudzus parametrus var iepriekš iestatīt pirms ultraskaņas apstrādes: Piemēram, lai kontrolētu temperatūru paraugā un novērstu tā termisko noārdīšanos, var iestatīt parauga temperatūras augšējo robežu. Pievienojams temperatūras sensors, kas nāk ar ultraskaņas bloku, dod ultraskaņas procesora atgriezenisko saiti par faktisko ultraskaņas temperatūru. Kad ir sasniegta augšējā temperatūras robeža, ultraskaņas ierīce apstājas, līdz tiek sasniegta iestatītā ∆T apakšējā robeža, un sāk pēc tam atkal automātiski apstrādāt ar ultraskaņu.
Ja ir nepieciešama ultraskaņas apstrāde ar konkrētu enerģijas ievadi, jūs varat iepriekš iestatīt ultraskaņas ultraskaņas galīgo ultraskaņas enerģiju. Protams, arī ultraskaņas pulsāciju un cikla režīmu var iestatīt individuāli.
Lai atkārtoti izmantotu veiksmīgākos ultraskaņas apstrādes parametrus, jūs varat saglabāt dažādus ultraskaņas režīmus (piemēram, ultraskaņas apstrādes laiku, intensitāti, cikla režīmu utt.) kā iepriekš iestatītus režīmus, lai tos varētu viegli un ātri sākt no jauna.
Lai nodrošinātu operatīvāku ērtību, visas digitālās ultraskaņas vienības var darbināt, izmantojot pārlūka tālvadības pulti jebkurā kopējā pārlūkprogrammā (piemēram, InternetExplorer, Safari, Chrome utt.). LAN savienojums ir vienkāršs plug-n-play iestatījums, un tam nav nepieciešama papildu programmatūras instalēšana.
Mēs Hielscher zinām, ka veiksmīgai bioloģisko paraugu apstrādei ar ultraskaņu ir nepieciešama precizitāte un atkārtojamība. Tāpēc mēs izstrādājām mūsu ultrasonikatorus kā viedierīces ar visām funkcijām, kas nodrošina efektīvu, uzticamu, reproducējamu un ērtu paraugu sagatavošanu.

Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu ultraskaņas sistēmu aptuveno apstrādes jaudu no ultraskaņas mikro-padomiem un klasiskajiem ultraskaņas homogenizatoriem līdz MultiSample ultrasonikatoriem, lai ērti, droši sagatavotu daudzus paraugus: