C. elegans, nematodes tārps, ir plaši izmanto modeļa organisms bioloģijā. Paraugu sagatavošana pirms analīzes prasa sabrukšanu, olbaltumvielu un lipīdu ekstrakciju, kā arī RNS sadrumstalotību, ko var droši veikt ar ultraskaņu. Ultraskaņas šūnu disruptori ir uzticamas, sarežģītas un viegli lietojamas ierīces, lai ātri sagatavotu C. elegans paraugus.

C. Elegans paraugu ultraskaņas sagatavošana

C. elegans ir roundworms, kas tiek plaši izmantoti pētniecības laboratorijās, lai izpētītu genomika, attīstības bioloģija, un slimības. Daudzi gēni genomu C. elegans ir funkcionāli kolēģiem cilvēkiem. Tādējādi nematodes tārps ir ļoti noderīgs modelis cilvēku slimībām. Citas priekšrocības plašai C. elegans lietošanai ir tās viegli un lēti audzēšana uz plāksnēm, kas satur baktērijas (piemēram, E. coli), tās pārredzamību, ērtu apstrādi, kā arī iespēju iesaldēt un uzglabāt tārpu ilgāku laiku.
Proteīna un lipīdu analīze ir regulāras procedūras laboratorijās, un ultraskaņas paraugu sagatavošana ir noteiktā metode lyse C. elegans nematodes katrā attīstības stadijā (t. i., embriji, kāpuri L1-L4, pieaugušie). Tā kā C. elegans tiek izmantots arī kā olbaltumvielu ekspresijas sistēma, lai pārmērīgi izteiktu mērķtiecīgus proteīnus, ir nepieciešama uzticama, reproducējama līze un olbaltumvielu ekstrakcijas metode, kas nodrošina augstu olbaltumvielu saturu. Ultraskaņas šūnu darbības traucējumi un ekstrakcijas sistēmas ir pieejamas kā zondes tipa homogenizatori un kā vairāku paraugu ultrasonatori. Ēdināšana ērtai paraugu sagatavošanai un visa veida paraugu lielumiem, Hielscher Ultrasonics ir ideāls ultraskaņas šūnu traucējošais jūsu laboratorijas procedūrai.

Ultraskaņas protokoli C. Elegans traucējumiem un līzei

C. elegans un turpmāko olbaltumvielu un lipīdu ekstrakciju ultraskaņas homogenizāciju un līzi var veikt, izmantojot dažādas procedūras, izmantojot dažādus homogenizācijas un sabrukšanas buferus utt. Visiem līzes protokoliem ir kopīgs, ka paraugi nepārtraukti jātur uz ledus, lai novērstu olbaltumvielu noārdīšanos. Zemāk mēs piedāvājam jums dažus uzticamus un ātrus ultraskaņas līzes un ekstrakcijas protokolus augstas kvalitātes olbaltumvielu vai lipīdu saturošu C. elegans paraugu sagatavošanai.

Ultraskaņas C. elegans līzes priekšrocības

• Uzticamu
• Atkārtojamam
• precīzi kontrolēta ar
• uzticama procesa kontrole
• maiga metode
• viegli lietojams
• Droši

Ultraskaņas proteīna ekstrakcija no C. elegans paraugiem

C. elegans tārpu ultraskaņas līzi un proteīnu ekstrakciju var veikt, izmantojot dažādus protokolus. Zemāk mēs piedāvājam jums dažus uzticamus un ātrus līzes protokolus reproducējamu proteīnu ekstrakcijas rezultātiem.

Citozola ekstrakta ātra preparatācija no C. elegans worms ar ultraskaņu

Ar šādu protokolu jūs varat sagatavot C. elegans lysates mazāk nekā 30 minūtes.
Kolekcija C. elegans
Vēlamos C. elegans tārpus ņem 1,5 ml fosfāta buferšķīdumā (PBS) vai nomazgā no plates ar 1,5 ml PBS. Centrifugē 1min pie 2000rpm uz granulu. Paraugus visu laiku glabā uz ledus.
Pēc tam tārpus divas reizes nomazgā ar PBS.
Pēc tam divreiz nomazgājiet tārpus ar₂O.
Atkārtoti uzpildīt tārpus vismaz 500 ul homogenizācijas buferšķīduma (HB) sastāvā. Tārpu paraugi tagad ir gatavi ultraskaņas analīzei.
Augstākai olbaltumvielu ekstrakta kvalitātei, iespējams, vēlēsities samazināt bakteriālo piesārņojumu, mazgājot tārpus 5min katram PBS un sterilu, ultra-tīru ūdeni (ddH₂O) vai veikt saharozes pludiņu. Tārpu paraugus pastāvīgi turēt uz ledus.

Ultraskaņas C. elegans līzes protokols

• Pārliecinieties, ka jūs sagatavojat ultrasonatoru sākumā, lai ultraskaņas homogenizators būtu gatavs lietošanai (zonde uzstādīta, ultraskaņas programmas iepriekš iestatītā).

Ja jūsu ultrasonicator ir stand-mounted, ievietojiet ledus vannu ar savu paraugu mēģenes zem ultraskaņas zondes un ievietojiet ultraskaņas zondi 1,5 ml mēģenē.

• C. elegans līze ar UP200St vai UP200Ht, ultrasonication jāveic, izmantojot mikrotipu (piemēram, 2mm zonde S26d2; skatīt attēlu pa kreisi) ar 40% amplitūdu 1sec ar 30sec pauzes starp. 5 ultraskaņas cikli katrai 1 sekundei ar 30sec pauzēm ir ideāli piemēroti C. elegans līzei. Ja pirmo reizi veicat līzi, izmantojot mikroskopu, varat pārbaudīt parauga nelielu alikvotu attīstību nelielās alikvotās daļās.
• Līze ir veiksmīgi pabeigta, kad tārpi tiek traucēta. Pārmērīga ultraskaņas apstrāde izraisa kodolu salūšanu un kļūst redzama, kad paraugs kļūst viskozs vai putas. Lai novērstu parauga noārdīšanos, ja nepieciešams, izmantojiet vairāk impulsu. Nepalieliniet katra ultraskaņas impulsa cikla laiku, lai iegūtu augstas kvalitātes olbaltumvielu ekstraktus.
• Notīrīt šūnu reizes, centrifugējot ultraskaņas lysed tārpi pie 14,000rpm 10min pie 4ēC.
• Tad pārnes centrifugātu uz svaigu caurulīti un sagatavojas imūnprecipācijai vai citiem testiem.

Piezīme par homogenizācijas buferi: Sagatavojiet homogenizācijas buferi ultraskaņas līzes protokolam šādi:

C. elegans ultraskaņas līze kvantitatīviem afinitātes attīrīšanas testiem

C. elegans embriji (∼2 miljoni uz atkārtojumu) tika svaigi novākti bioloģisko trīsreizes mēnesī, balinot jauniešu gravid hermafrodīti un sonicated uz ledus (cikls: 0,5 s, amplitūda: 40-45%, 5 insultu / sesijas, 5 sesijas, intervāls starp sesijām: 30 s; UP200S ultraskaņas procesors ar mikrogalu S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) līzes buferšķīdumā (kopējais tilpums: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerīna, proteāzes inhibitoru maisījums, 0. 1% Nonidet P- 40 aizvietotājs). Pēc ultraskaņas apstrādes Nonidet P-40 Substitute tika pievienots līdz 1% un lysates tika inkubēts ar galvu virs astes rotācijas 4 °C temperatūrā 30 minūtes, kam sekoja centrifugēšana pie 20 000 × g 20 min 4 °C temperatūrā. Notīrītais lysate pēc tam tika aspirēts, netraucējot augšējo lipīdu slāni un sadalījis uz pusi vai nu anti-GFP agarozes lodītes vai bloķētas kontroles lodītes (40–50 μl). Pēc galvas pāri astes rotācijai 4°C temperatūrā 60–90 minūtes lodītes vienreiz tika mazgātas ar sabrukšanas buferšķīdumu, kas satur 0,1% Nonidet P-40 Aizvietotāju, pēc tam divas reizes mazgāšanas reizes I buferšķīdumā (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) vai II buferšķīdumā (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) vai abos buferšķīdumā. GFP:MBK-2 vilkšanai tika veikti divi atsevišķi eksperimenti, izmantojot dažādus mazgāšanas apstākļus. Olbaltumvielas eluēja orbītas kratot 50 μl 6 m urīnvielas/2 M tiourīnvielas istabas temperatūrā. MBK-1:GFP lejuplādēšanas eksperimentiem olbaltumvielas eluēja divreiz, sakratot 50 μl 8 m guanidīnija hlorīda 90 °C temperatūrā, kam seko etanola nogulsnēšanās. Pēc tam eluēto proteīnu paraugi tika sagremoti šķīdumā.
(sk. Chen et al., 2016)

Ultraskaņas tārpu homogenizācija un līze

C.elegans līzes un proteīnu ekstrakcijas procedūrai vienā paraugā savāca 30 000 nemoīdu un mazgā ledus aukstajā S-bazālā, koncentrēta centrifugējot ar 1500 apgr./min. Olbaltumvielu ekstrakcijai gravīdam pieaugušam tārpiem pēc pēdējās S-bazālās mazgāšanas tika atļauts veidot kompaktu granulu. Pēc tam tārpu granulas tika atkārtoti uzpildītas 1 ml ledus aukstas ekstrakcijas buferšķīduma [20 mM kālija fosfāta, pH 7, 4, 2mM EDTA, 1% Triton- X- 100, proteāzes inhibitoru (Sigma P2714)] un nekavējoties jāapstrādā.
∼30 000 gravīdu-pieaugušus tārpus (kas atbilst ∼100 mg mitrajam svaram) ar ultraskaņu tika apstrādātas ar ultraskaņu, izmantojot zondes tipa ultrasonatoru (piemēram, UP50H ar mikrotipu MS2) ar 40% amplitūdu 10 cikliem 3 sek, 30 sek. (sal. ar Baskharan et al. 2012)

Ultraskaņas lipīdu ekstrakcija no C. elegans

Lipidommiem, filiāle metabolomikas, lipīdu papildinājums bioloģisko sistēmu raksturo un analizē. C. elegans plaši izmanto lipidomicīmu, lai izpētītu mijiedarbību vielmaiņas lipīdu un to ietekmi uz veselību un mūžu.
Ultraskaņas līze un ekstrakcija tiek izmantota, lai atbrīvotu lipīdus, piemēram, sphingolipids no C. elegans embrijiem, kāpuriem un pieaugušiem tārpiem. Ultrasonication izmanto, lai sagatavotu tārpu homogenātus un pēc tam iegūtu lipīdus no parauga.
Protokols ultraskaņas lipīdu ekstrakcijai no C. elegans
Atkausēt C. elegans granulu uz ledus un atkārtoti piestāj ar 0,5 ml ultraūdens. 
Ar ultraskaņu kārto C. elegans paraugus 1,5 ml mēģenēs, pastāvīgi turot paraugus uz ledus.
Ultraskaņu var veikt, izmantojot zondes-ultrasonicstor, piemēram, UP200Ht, ultraskaņas parauga sagatavošanas ierīce VialTweeter (vienlaicīga apstrāde ar ultraskaņu pa 10 paraugiem) vai UIP400MTP UIP400MTP (daudzaktīvu plākšņu, piemēram, 96 ied urbumu plākšņu, apstrādei ar UP200Ht izmantojiet mikrogalu S26d2. Iepriekš iestatiet ultraskaņas cikla režīmu digitālajā izvēlnē. Iestatiet amplitūdu uz 10% un ultraskaņas cikla režīmu ar 20 cikliem ar 30 sek.
Pārnesiet centrifugātus uz stikla caurulēm ar skrūvējamu vāciņu. 
Veic Folch ekstrakciju, pievienojot 1 ml ultraūdens katrai stikla caurulei, pēc tam pievienojot 6 ml hloroforma/metanola (attiecība = 2:1) maisījuma katrai stikla caurulei.
Katra stikla caurule 30 sekundes 4 reizes. 
Centrifugē mēģenes ar 1,258 x g 15 min (Eppendorf, 5810 R), lai vēl vairāk uzlabotu fāzu atdalīšanu. 
Apakšējo hidrofobās frakciju pārnes tīrā stikla caurulē ar stikla pasteur pipeti. 
Slāpekļa iztvaicētājā sausālfofola frakciju ar slāpekļa plūsmu žāvē. 
Uzglabāt žāvēto granulu -80 °C saldētavā līdz lietošanai.

Worm Lysates ultraskaņas sagatavošana

Tārps lysate: L4 pakāpju tārpi tika novākti un trīs reizes mazgāti ar M9 buferšķīdumu (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂Po₄, 85,56 mM NaCl un 0,87 mM MgSO₄), lai likvidētu visas baktērijas. Pēc M9 buferšķīduma izņemšanas tārpi tika atkārtoti suspēta līzes buferšķīdumā: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfāta β- glicerīns, 0, 1% (v/ v) Triton X- 100, 50 mM nātrija fluorīds, 1 mM nātrija ortodoksāts, 5 M nātrija pirofosfāts, 0, 2 m fenilmetānamulfotilfluorīds un proteāzes inhibitors. Tārpi tika sasaldēti šķidrā slāpeklī un trīs reizes atkausēti 37°C temperatūrā, tad tārpi tika ar ultraskaņu apstrādāti uz sausa ledus ar ultraskaņas VialTweeter vienību vienlaicīgai 10 paraugu cauruļu sagatavošanai. Sonication tika veikta ar 50% amplitūdu 10 ciklos 2 sek. Pēc tam paraugus centrifugēja ar 12000 apgriezieniem minūtē 4°C temperatūrā 15 minūtes. Supernatants tika savākts un uzglabāts -70°C temperatūrā. Alikvotu izmantoja olbaltumvielu kvantitatīvai noteikšanai ar Bradford testā.
Kopējā glutotona, GSH un GSSG noteikšana: tajā pašā dienā tika veikta glutonona kvantitatīvā noteikšana, lizāti un noteikšana. Glikozes padevi un kontroli L4 kāpurus novāca un mazgā ar M9 buferšķīdumu trīs reizes. Pēc M9 bufera noņemšanas tārpi tika atkārtoti uzpildīti ledus aukstajā metafosforskābē (5% w / v), tad tārpi tika apstrādāti ar ultraskaņu ar ultraskaņas VialTweeter 50% amplitūdu desmit 2 sek. Pēc tam centrifugē pie 12000 apgr./min. 4 ̊C temperatūrā 15 minūtes.
(sal. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Sample Prep pirms imūnprecipitācijas un Western Blotting

Īsumā, embrionālie ekstrakti, C. elegans L1 kāpuri tika audzēti liela mēroga šķidrās S-vidējas kultūras līdz pieauguša cilvēka vecumam. Embriji ir iegūti, izmantojot standarta balinātāju metodi, un suspendēti līzes buferšķīdumā (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerīns, 0,05% NP-40, 1􏰅 proteāzes inhibitoru kokteilis un 1􏰅 fosfatāzes inhibitoru kokteilis I un II), ātri sasaldēts šķidrajā slāpeklī un lysed ar ultraskaņas šūnu traucējumiem, izmantojot ultraskaņas mikroshēmu ar mikrotipu, piemēram, fosfatāzes inhibitoru kokteilis I un II UP200Ht ar S26d2 10 impulsiem virs 10 s pie 30% amplitūdas. Ja jāsagatavo lielāks skaits paraugu, ultraskaņas VialTweeter vai MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP labi platēm ir ieteicama. Pēc ultraskaņas apstrādes ekstrakti tika iepriekš notīrīti, centrifugējot 20 minūtes 4°C temperatūrā 30 000 g. Iepriekš attīrītais ekstrakts (300 μg kopējā proteīna) tika inkubēts ar 40 μ􏰂g anti-CDC-25.1 afinitātei attīrītas antivielas (šis pētījums), kas ir savstarpēji saistīts ar A-agarozu, vai kā kontroli līdzīgs truša imūnglobulīna (Ig)G daudzums, kas krusteniski saistīts ar A- agarozu, tika izmantots kopējā 200 μl līzes buferšķīduma tilpumā, kas satur 1% NP- 40, kura iekļaušana matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricā matricinā matricinā. Paraugi tika pagriezti 1 stundu 4°C temperatūrā, krelles trīs reizes tika mazgātas ar līzes buferšķīdumu un eluētas ar 30 μl glicīna/HCl un 200 mM NaCl, pH 2,2. Pēc imūnprecipācijas eluāti tika atšķaidīti ar 30 􏰂l SDS parauga buferšķīduma, karsējot līdz 95°C 4 minūtes, un parasti 3% no kopējā ievades un 30% eluātiem tika piemēroti SDS-PAGE, kam sekoja Western blotting ar anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1 :750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500), vai anti-􏰁β-actin (1:2000) antivielas. Ja ekstrakti netika pakļauti imūnprecipitācijai, dDL parauga buferšķīdumā atkārtoti tika atkārtoti izmantots tāds pats no šiem ekstraktiem iegūtais kopējais olbaltumvielu daudzums, kas karsēts līdz 95°C, un pēc tam tieši piemērots SDS-PAGE un analizēts ar Western blotting. (sal. ar Segref et al. 2020)

Ultraskaņas līze zem prezcise temperatūras kontroles

Precīza un uzticama temperatūras kontrole ir būtiska, apstrādājot bioloģiskos paraugus. Augsta temperatūra iniciē termiski izraisītu olbaltumvielu noārdīšanos paraugos.
Tā kā visas mehāniskās paraugu sagatavošanas metodes, ultraskaņas apstrāde rada siltumu. Tomēr, izmantojot VialTweeter, paraugu temperatūru var labi kontrolēt. Mēs piedāvājam jums dažādas iespējas, lai uzraudzītu un kontrolētu temperatūru jūsu paraugus, vienlaikus sagatavojot tos ar VialTweeter un VialPress analīzei.

1. Parauga temperatūras uzraudzība: Ultraskaņas procesors UP200St, kas vada VialTweeter, ir aprīkots ar inteliģentu programmatūru un iespraudējamu temperatūras sensoru. Iespraudiet temperatūras sensoru UP200St un ievietojiet temperatūras sensora galu vienā no paraugu caurulēm. Izmantojot digitālu skārienatstāvu, UP200St izvēlnē varat iestatīt īpašu temperatūras diapazonu jūsu parauga ultraskaņas apstrādei. Ultrasonicator automātiski apstāsies, kad maksimālā temperatūra ir sasniegta, un pauze, līdz parauga temperatūra ir uz leju līdz iestatītās temperatūras zemāko vērtību, kas ∆. Tad ultraskaņas apstrāde atkal sākas automātiski. Šī viedā funkcija novērš karstuma izraisītu noārdīšanos.
2. VialTweeter bloku var iepriekš atdzesēt. Ievietojiet VialTweeter bloku (tikai sonotrodu bez zondi!) ledusskapī vai saldētavā, lai iepriekš atdzesētu titāna bloku, palīdz atlikt temperatūras paaugstināšanos paraugā. Ja iespējams, paraugu var iepriekš atdzesēt too.
3. Izmanto sausu ledu, lai atdzesētu ultraskaņas apstrādes laikā. Izmantojiet seklu paplāti, kas piepildīta ar sausu ledu, un novietojiet VialTweeter uz sausā ledus, lai karstums varētu ātri izkliedēties.

Atrodiet optimālo ultraskaņas šūnu traucētāju jūsu līzes lietojumprogrammai

Hielscher Ultrasonics ir sen pieredzējis augstas veiktspējas ultraskaņas šūnu traucētāju un homogenizatoru ražotājs laboratorijām, galda un rūpnieciskās mēroga sistēmām. Jūsu baktēriju šūnu kultūras lielums, jūsu pētniecības vai ražošanas mērķis un šūnas apjoms, kas jāapstrādā stundā vai dienā, ir būtiski faktori, lai atrastu pareizo ultraskaņas šūnu traucētāju jūsu pieteikumam.
Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus risinājumus vienlaicīgai daudzo paraugu ultraskaņas apstrādei (līdz 10 flakoniem), kā arī masas paraugus (t.i., mikrotitrēšanas plāksnes / 96 iedžas plāksnes), klasisko zondes tipa lab ultrasonicator ar dažādiem jaudas līmeņiem no 50 līdz 400 vatiem līdz pilnībā rūpnieciskiem ultraskaņas procesoriem ar līdz pat 16 000 vatiem uz vienu vienību komerciālajam šūnam un ekstrakcijas proteīnu lielā ražošanā. Visi Hielscher ultrasonicators ir būvēti 24/7/365 darbībai pilnā slodzē. Robustums un uzticamība ir mūsu ultraskaņas ierīču galvenās iezīmes.
Visi digitālie ultraskaņas homogenizatori ir aprīkoti ar viedo programmatūru, krāsainu skārienjutīgu displeju un automātisko datu fiksēšanu, kas padara ultraskaņas ierīci par ērtu darba rīku laboratorijā un ražošanas iekārtās.
Ļaujiet mums zināt, kāda veida šūnas, kādā tilpumā, ar kādu frekvenci un ar kādu mērķi jums ir apstrādāt jūsu bioloģisko paraugus. Mēs iesakām jums vispiemērotāko ultraskaņas šūnu traucētāju jūsu procesa prasībām.

Zemāk esošajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu ultraskaņas sistēmu aptuveno apstrādes jaudu no kompaktajiem rokas homogenizatoriem un MultiSample Ultrasonicators līdz rūpnieciskiem ultraskaņas procesoriem komerciāliem lietojumiem: