C. elegans paraugu ultraskaņas sagatavošana

C. elegans, nematodes tārps, ir plaši izmantots modeļa organisms bioloģijā. Paraugu sagatavošanai pirms analīzes nepieciešama līze, olbaltumvielu un lipīdu ekstrakcija, kā arī RNS sadrumstalotība, ko var droši veikt ar ultraskaņu. Ultraskaņas šūnu traucētāji ir uzticamas, sarežģītas un viegli lietojamas ierīces ātrai C. elegans paraugu sagatavošanai.

C. elegans paraugu ultraskaņas sagatavošana

C. elegans ir apaļtārpi, kurus plaši izmanto pētniecības laboratorijās, lai izpētītu genomiku, attīstības bioloģiju un slimības. Daudziem gēniem C. elegans genomā ir funkcionāli līdzinieki cilvēkiem. Tādējādi nematodes tārps ir ļoti noderīgs modelis cilvēku slimībām. Citas priekšrocības C. elegans plašai izmantošanai ir tā viegla un lēta audzēšana uz plāksnēm, kas satur baktērijas (piemēram, E. coli), tā caurspīdīgums, ērta apstrāde, kā arī iespēja tārpus sasaldēt un uzglabāt ilgāku laiku.
Olbaltumvielu un lipīdu analīze ir regulāras procedūras laboratorijās, un ultraskaņas paraugu sagatavošana ir izveidota metode, lai lizētu C. elegans nematodes katrā attīstības stadijā (t.i., embriji, kāpuri L1-L4, pieaugušie). Tā kā C. elegans tiek izmantots arī kā olbaltumvielu ekspresijas sistēma, lai pārmērīgi ekspresētu mērķa proteīnus, ir nepieciešama uzticama, reproducējama līzes un olbaltumvielu ekstrakcijas metode, kas dod augstu olbaltumvielu daudzumu. Ultraskaņas šūnu darbības traucējumi un ekstrakcijas sistēmas ir pieejamas kā zondes tipa homogenizatori un kā vairāku paraugu ultrasonatori. Nodrošinot ērtu paraugu sagatavošanu un visu veidu paraugu lielumu skaitu, Hielscher Ultrasonics ir ideāls ultraskaņas šūnu traucētājs jūsu laboratorijas procedūrai.

Ultraskaņas protokoli C. Elegans traucējumiem un līzei

C. elegans ultraskaņas homogenizāciju un līzi un turpmāko olbaltumvielu un lipīdu ekstrakciju var veikt, izmantojot dažādas procedūras, izmantojot dažādas homogenizācijas un līzes buferus utt. Visiem līzes protokoliem ir kopīgs tas, ka paraugi nepārtraukti jāglabā uz ledus, lai novērstu olbaltumvielu noārdīšanos. Zemāk mēs piedāvājam jums dažus uzticamus un ātrus ultraskaņas līzes un ekstrakcijas protokolus augstas kvalitātes proteīnu vai lipīdu saturošu C. elegans paraugu sagatavošanai.

Ultraskaņas C. elegans Līzes priekšrocības

• Uzticamu
• Atkārtojamam
• precīzi kontrolēta temperatūra
• uzticama procesa kontrole
• maiga metode
• viegli uzklājams
• Drošs

Ultraskaņas proteīnu ekstrakcija no C. elegans paraugiem

C. elegans tārpu ultraskaņas līzi un olbaltumvielu ekstrakciju var veikt, izmantojot dažādus protokolus. Zemāk mēs piedāvājam dažus uzticamus un ātrus līzes protokolus reproducējamu proteīnu ekstrakcijas rezultātiem.

Ātra citozola ekstrakta sagatavošana no C. elegans tārpiem ar ultraskaņu

Ar šādu protokolu jūs varat sagatavot C. elegans lizātus mazāk nekā 30 minūtēs.
C. elegans kolekcija
Izvēlieties vēlamos C. elegans tārpus 1,5 ml mēģenes fosfāta buferšķīdumā (PBS) vai mazgājiet tos no plāksnes ar 1,5ml PBS. Centrifugē 1min pie 2000rpm līdz granulām. Paraugus visu laiku glabā uz ledus.
Pēc tam tārpus divreiz nomazgājiet ar PBS.
Pēc tam tārpus divreiz mazgājiet ar ddH₂O.
Tārpus atkārtoti suspendē vismaz 500ul homogenizācijas buferšķīdumā (HB). Tārpu paraugi tagad ir gatavi ultraskaņas līzei.
Lai iegūtu augstāku olbaltumvielu ekstrakta kvalitāti, jūs varētu vēlēties samazināt baktēriju piesārņojumu, mazgājot tārpus 5 min katru PBS un sterilā, īpaši tīrā ūdenī (ddH₂O) vai veikt saharozes peldēšanu. Tārpu paraugus nepārtraukti glabā uz ledus.

Ultraskaņas C. elegans līzes protokols

• Pārliecinieties, ka jūs sagatavojat ultrasonicator priekšā, lai ultraskaņas homogenizators būtu gatavs lietošanai (zonde uzstādīta, ultraskaņas programma iepriekš iestatīta).

Ja jūsu ultrasonikators ir uzstādīts uz statīva, novietojiet ledus vannu ar parauga caurulēm zem ultraskaņas zondes un ievietojiet ultraskaņas zondi 1,5 ml mēģenē.

• C. elegans līzei ar UP200St vai UP200Ht ultrasonication jāveic, izmantojot mikrotipu (piemēram, 2 mm zonde S26d2; skatīt attēlu pa kreisi) 40% amplitūdā 1sec ar 30sec pauzēm starp tām. 5 ultraskaņas cikli katrai 1 sekundei ar 30sec pauzēm ir ideāli piemēroti C. elegans līzei. Ja līzi veicat pirmo reizi, jūs varat pārbaudīt līzes progresēšanu mazās parauga alikvotās daļās pēc katra impulsa, izmantojot mikroskopu.
• Līze tiek veiksmīgi pabeigta, kad tārpi tiek traucēti. Pārmērīga ultraskaņas apstrāde izraisa kodolu lūzumu un kļūst redzama, kad paraugs kļūst viskozs vai putas. Lai novērstu parauga degradāciju, ja nepieciešams, izmantojiet vairāk impulsu. Nepalieliniet katra ultraskaņas impulsa cikla laiku, lai iegūtu augstas kvalitātes olbaltumvielu ekstraktus.
• Dzidrs šūnu lizāts, centrifugējot ultrasoniski lizētos tārpus pie 14 000rpm 10 min 4 ° C temperatūrā.
• Pēc tam centrifugātu pārnes svaigā mēģenē un sagatavo imunoprecipitācijai vai citām pārbaudēm.

Piezīme homogenizācijas buferim: Sagatavojiet homogenizācijas buferi iepriekš minētajam ultraskaņas līzes protokolam šādi:

C. elegans augstas caurlaidspējas līze 96 urbumu plāksnēs, izmantojot UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Līze (pieaugušo nematodes)
UIP400MTP 80% amplitūda, 20 cikli (katrs ultraskaņas cikls: 30 sek ON, 30 sek OFF)
Līzes buferšķīdums:

• 1. variants) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• 2. variants) koimūnprecipitācijai (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (pilns proteināzes inhibitoru kokteilis)

Augstas caurlaidspējas DNS fragmentācija
C. elegans (pieaugušo nematodes) DNS 200-300bp: UIP400MTP plāksnes sonikators – iestatiet 80% amplitūdu, 30pulsus – katrs 30sec ieslēgts, 30sec off

UIP400MTP Plate Sonicator augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanai vienmērīgi apstrādā paraugus vairāku iedobju, mikrotitrēšanas plāksnēs un 96 urbumu plāksnēs

C. elegans ultraskaņas līze kvantitatīviem afinitātes attīrīšanas testiem

C. elegans embriji (∼2 miljoni uz replikātu) tika svaigi ievākti bioloģiskā triplikātā, balinot jaunus gravīdu hermafrodītus, un apstrādāti ar ultraskaņu uz ledus (cikls: 0,5 s, amplitūda: 40–45%, 5 sitieni / sesija, 5 sesijas, intervāls starp sesijām: 30 s; UP200S ultraskaņas procesors ar mikro-galu S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) līzes buferšķīdumā (kopējais tilpums: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerīns, proteāzes inhibitoru maisījums, 0,1% Nonidet P-40 aizstājējs). Pēc ultraskaņas apstrādes Nonidet P-40 Substitute tika pievienots līdz 1%, un lizāti tika inkubēti ar galvu virs astes rotācijas 4 ° C temperatūrā 30 minūtes, kam sekoja centrifugēšana 20 000 × g 20 min 4 ° C temperatūrā. Pēc tam dzidrināto lizātu ieelpoja, netraucējot augšējo lipīdu slāni, un sadalīja uz pusi vai nu anti-GFP agarozes lodītēs, vai bloķētajās kontroles lodēs (40–50 μl). Pēc galvas virs astes rotācijas 4 ° C temperatūrā 60–90 min, lodītes vienu reizi mazgāja ar līzes buferšķīdumu, kas satur 0,1% Nonidet P-40 aizstājēju, kam sekoja divas mazgāšanas reizes vai nu I buferšķīdumā (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), vai buferī II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) vai abus. GFP:MBK-2 novilkšanai tika veikti divi atsevišķi eksperimenti, izmantojot dažādus mazgāšanas apstākļus. Olbaltumvielas eluēja, orbitāli kratot 50 μl 6 m urīnvielas/2 M tiourīnvielas istabas temperatūrā. MBK-1::GFP novilkšanas eksperimentos olbaltumvielas eluēja divas reizes, kratot 50 μl 8 m guanidīnija hlorīda 90 °C temperatūrā, kam sekoja etanola izgulsnēšana. Pēc tam eluēto olbaltumvielu paraugi tika sašķelti šķīdumā.
(sal. ar Chen et al., 2016)

Ultraskaņas tārpu homogenizācija un līze

C.elegans līzes un olbaltumvielu ekstrakcijas procedūrai vienā paraugā tika savākti 30 000 attiecīgā posma nemotodes un mazgāti ledusaukstā S-bazālā, koncentrēti centrifugējot pie 1500 apgr./min 2 min., sešas reizes mazgāti ar ledusaukstu S-bazālu, lai atdalītu atlikušās baktērijas, un pēc tam uzglabāti uz ledus līdz gatavībai lietošanai. Olbaltumvielu ekstrakcijai gravid-pieaugušajiem tārpiem pēc pēdējās S-bazālās mazgāšanas tika atļauts veidot kompaktu granulu. Pēc tam tārpu granulas tika atkārtoti suspendētas 1 ml ledusaukstā ekstrakcijas buferšķīdumā [20 mM kālija fosfāts, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteāzes inhibitori (Sigma P2714)] un nekavējoties apstrādātas.
∼30 000 gravid-pieaugušo tārpu (kas atbilst ∼100 mg mitra svara) tika apstrādāti ar ultraskaņu uz ledus, izmantojot zondes tipa ultrasonikatoru (piemēram, UP50H ar mikrotipu MS2) 40% amplitūdā 10 cikliem pa 3 sekundēm, 30 sek off, 1 ml ledusaukstā ekstrakcijas bufera. (sal. ar Baskharan et al. 2012)

Ultraskaņas lipīdu ekstrakcija no C. elegans

Lipidomikā, kas ir metabolomikas nozare, tiek raksturots un analizēts bioloģisko sistēmu lipīdu komplements. C. elegans tiek plaši izmantots lipidomikā, lai izpētītu metabolisko lipīdu mijiedarbību un to ietekmi uz veselību un dzīves ilgumu.
Ultraskaņas līze un ekstrakcija tiek izmantota, lai atbrīvotu lipīdus, piemēram, sfingolipīdus no C. elegans embrijiem, kāpuriem un pieaugušajiem tārpiem. Ultrasonication tiek izmantots, lai sagatavotu tārpu homogenātus un pēc tam iegūtu lipīdus no parauga.
Protokols ultraskaņas lipīdu ekstrakcijai no C. elegans
Atkausē C. elegans granulas uz ledus un atkārtoti suspendē ar 0,5 ml ultraūdens. 
Ultraskaņas C. elegans paraugus apstrādā 1,5 ml mēģenēs, nepārtraukti turot paraugus uz ledus.
Sonication var veikt, izmantojot zondes-ultrasonicstor, piemēram, UP200Ht, ultraskaņas paraugu sagatavošanas vienība VialTweeter (vienlaicīga 10 paraugu apstrāde ar ultraskaņu) vai UIP400MTP (vairāku urbumu plākšņu, piemēram, 96 urbumu plākšņu, apstrādei). Ultraskaņas līzei ar UP200Ht izmantojiet mikro-galu S26d2. Iepriekš iestatiet ultraskaņas cikla režīmu digitālajā izvēlnē. Iestatiet amplitūdu uz 10% un ultraskaņas cikla režīmu 2 sek impulsi no 20 cikliem ar pauzi 30 sekundes starp katru ultraskaņas pulsācijas pārrāvumu.
Pārnes centrifugātus stikla caurulēs ar skrūvējamu vāciņu. 
Veic Folch ekstrakciju, katrai stikla mēģenei pievienojot 1 ml ultraūdens, pēc tam katrai stikla mēģenei pievienojot 6 ml hloroforma/metanola (attiecība = 2:1) maisījuma.
Virpiniet katru stikla cauruli 30 sekundes 4 reizes. 
Mēģenes centrifugē 1,258 x g 15 minūtes (Eppendorf, 5810 R), lai vēl vairāk uzlabotu fāzu atdalīšanu. 
Apakšējo hidrofobo frakciju pārnes uz tīru stikla cauruli ar Pastēra stikla pipeti. 
Apakšējo hidrofobo frakciju žāvē slāpekļa plūsmā slāpekļa iztvaicētājā. 
Žāvētās granulas līdz izmantošanai uzglabā -80 °C saldētavā.

Tārpu lizātu ultraskaņas sagatavošana

Tārpu lizāts: L4 stadijas tārpi tika novākti un trīs reizes mazgāti ar M9 buferšķīdumu (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl un 0,87 mM MgSO₄), lai noņemtu visas baktērijas. Pēc pēc iespējas vairāk M9 buferšķīduma noņemšanas tārpi tika atkārtoti suspendēti līzes buferšķīdumā: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfāts β-glicerīns, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM nātrija fluorīds, 1 mM nātrija ortovanadāts, 5 mM nātrija pirofosfāts, 0,2 mM fenilmetānsulfonilfluorīds un proteāzes inhibitors. Tārpi tika sasaldēti šķidrā slāpeklī un trīs reizes atkausēti 37 ° C temperatūrā, pēc tam tārpi tika apstrādāti ar sausu ledu ar ultraskaņas VialTweeter vienību, lai vienlaicīgi sagatavotu 10 paraugu caurules. Ultraskaņas apstrāde tika veikta 50% amplitūdā 10 ciklos pa 2 sekundēm ar 30 sek pauzi starp ultraskaņas pārrāvumiem. Pēc tam paraugus centrifugēja pie 12000 apgriezieniem minūtē 4 °C temperatūrā 15 minūtes. Centrifugātu savāca un uzglabāja -70°C temperatūrā. Alikvotu izmantoja proteīnu kvantitatīvai noteikšanai ar Bredforda testu.
Kopējā glutationa, GSH un GSSG noteikšana: glutationa kvantitatīvai noteikšanai lizāti un noteikšana tika veikta tajā pašā dienā. Ar glikozi baroti un kontroles L4 kāpuri tika novākti un trīs reizes mazgāti ar M9 buferšķīdumu. Pēc pēc iespējas vairāk M9 bufera noņemšanas tārpi tika atkārtoti suspendēti ledus aukstā metafosforskābē (5% w / v), tad tārpi tika apstrādāti ar ultraskaņu VialTweeter ar 50% amplitūdu desmit ultraskaņas ciklos 2 sek. ar 30 sek. pauze starp katru ciklu. Pēc tam centrifugē pie 12000 apgr./min pie 4 ̊C 15 min.
(sk. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Sample Prep pirms imūnprecipitācijas un Western Blotting

Īsāk sakot, embriju ekstraktiem C. elegans L1 kāpuri tika audzēti liela mēroga šķidrās S-vidējās kultūrās līdz pilngadībai. Embriji tika savākti, izmantojot standarta balinātāju metodi, un suspendēti līzes buferšķīdumā (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerīns, 0,05% NP-40, 1percent��� proteāzes inhibitoru kokteilis un 1.), ātri sasaldēti šķidrā slāpeklī un lizēti ar ultraskaņas šūnu traucējumiem, izmantojot ultrasonikatoru ar mikrotipu, piemēram, UP200Ht ar S26d2 10 impulsiem virs 10 s ar 30% amplitūdu. Ja jāsagatavo lielāks paraugu skaits, ultraskaņa VialTweeter vai ieteicams izmantot MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP labām plāksnēm. Pēc ultraskaņas apstrādes ekstrakti tika iepriekš notīrīti, centrifugējot 30 000 g 20 minūtes 4 ° C temperatūrā. Iepriekš attīrīts ekstrakts (300 μg kopējā proteīna) tika inkubēts ar 40 μ0 μ afinitātē attīrītas antivielas (šis pētījums), kas bija savstarpēji saistīta ar proteīnu A-agarozi, vai kā kontrole tika izmantots līdzīgs daudzums trušu imūnglobulīna (Ig)G, kas šķērssaistīts ar proteīnu A-agaroze, kopējā daudzumā 200 μl līzes buferšķīduma, kas satur 1% NP-40, kura iekļaušana samazināja proteīnu nespecifisko saistīšanos ar matricu. Paraugus rotēja uz 1 h 4 °C temperatūrā, lodītes trīs reizes mazgāja ar līzes buferšķīdumu un eluēja ar 30 μl glicīna/HCl un 200 mM NaCl, pH 2,2. Pēc imūnprecipitācijas eluātus atšķaidīja ar 30μ0μ0000 SDS parauga buferšķīduma, 4 minūtes karsēja līdz 95°C, un parasti 3% no kopējā ievades un 30% eluātiem tika uzklāti uz SDS-PAGE, kam sekoja Western blotting ar anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3identifier�� (1:500) vai anti-pārsteidzoši���β-aktīna (1:2000) antivielām. Ja ekstrakti netika pakļauti imūnprecipitācijai, tāds pats kopējais olbaltumvielu daudzums, kas iegūts no šiem ekstraktiem, tika atkārtoti suspendēts SDS parauga buferšķīdumā, uzkarsēts līdz 95 ° C un pēc tam tieši uzklāts uz SDS-PAGE un analizēts ar Western blotēšanu. (sk. Segref et al. 2020)

Ultraskaņas līze prescise temperatūras kontrolē

Precīza un uzticama temperatūras kontrole ir būtiska, rīkojoties ar bioloģiskajiem paraugiem. Augsta temperatūra ierosina termiski izraisītu olbaltumvielu noārdīšanos paraugos.
Tāpat kā visas mehāniskās paraugu sagatavošanas metodes, ultraskaņas apstrāde rada siltumu. Tomēr, lietojot VialTweeter, paraugu temperatūru var labi kontrolēt. Mēs piedāvājam jums dažādas iespējas, kā uzraudzīt un kontrolēt jūsu paraugu temperatūru, vienlaikus sagatavojot tos ar VialTweeter un VialPress analīzei.

1. Parauga temperatūras uzraudzība: Ultraskaņas procesors UP200St, kas vada VialTweeter, ir aprīkots ar inteliģentu programmatūru un pievienojamu temperatūras sensoru. Pievienojiet temperatūras sensoru UP200St un ievietojiet temperatūras sensora galu vienā no parauga mēģenēm. Izmantojot digitālo krāsaino skārienekrānu, UP200St izvēlnē varat iestatīt noteiktu temperatūras diapazonu ultraskaņas paraugam. Ultrasonicator automātiski apstāsies, kad tiks sasniegta maksimālā temperatūra, un pauze, līdz parauga temperatūra ir pazemināta līdz iestatītās temperatūras zemākajai vērtībai ∆. Tad ultraskaņas apstrāde atkal sākas automātiski. Šī viedā funkcija novērš siltuma izraisītu degradāciju.
2. VialTweeter bloku var iepriekš atdzesēt. Ievietojiet VialTweeter bloku (tikai sonotrode bez devēja!) ledusskapī vai saldētavā, lai iepriekš atdzesētu titāna bloku, kas palīdz atlikt temperatūras paaugstināšanos paraugā. Ja iespējams, arī pašu paraugu var iepriekš atdzesēt.
3. Izmantojiet sausu ledu, lai atdzesētu ultraskaņas apstrādes laikā. Izmantojiet seklu paplāti, kas piepildīta ar sausu ledu, un novietojiet VialTweeter uz sausā ledus, lai siltums varētu ātri izkliedēties.

Atrodiet optimālo ultraskaņas šūnu traucētāju jūsu līzes lietojumprogrammai

Hielscher Ultrasonics ir ilgstoši pieredzējis augstas veiktspējas ultraskaņas šūnu traucētāju un homogenizatoru ražotājs laboratorijām, stenda un rūpnieciskā mēroga sistēmām. Jūsu baktēriju šūnu kultūras lielums, jūsu pētniecības vai ražošanas mērķis un apstrādājamās šūnas apjoms stundā vai dienā ir būtiski faktori, lai atrastu pareizo ultraskaņas šūnu traucētāju jūsu lietojumam.
Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus risinājumus vienlaicīgai vairāku paraugu apstrādei ar ultraskaņu (līdz 10 flakoniem), kā arī masas paraugiem (t.i., mikrotitrēšanas plāksnēm / 96 urbumu plāksnēm), klasiskajam zondes tipa laboratorijas ultrasonikatoram ar dažādiem jaudas līmeņiem no 50 līdz 400 vatiem līdz pilnībā rūpnieciskiem ultraskaņas procesoriem ar līdz pat 16 000 vatiem uz vienību komerciālu šūnu darbības traucējumiem un olbaltumvielu ekstrakcijai lielā ražošanā. Visi Hielscher ultrasonikatori ir būvēti 24/7/365 darbībai ar pilnu slodzi. Robustums un uzticamība ir mūsu ultraskaņas ierīču galvenās iezīmes.
Visi digitālie ultraskaņas homogenizatori ir aprīkoti ar gudru programmatūru, krāsainu skārienekrānu un automātisku datu protokolēšanu, kas padara ultraskaņas ierīci par ērtu darba rīku laboratorijā un ražošanas iekārtās.
Paziņojiet mums, kāda veida šūnas, kāds tilpums, ar kādu biežumu un ar kādu mērķi jums ir jāapstrādā jūsu bioloģiskie paraugi. Mēs ieteiksim jums vispiemērotāko ultraskaņas šūnu traucētāju jūsu procesa prasībām.

Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu ultraskaņas sistēmu aptuveno apstrādes jaudu no kompaktiem rokas homogenizatoriem un MultiSample Ultrasonicators līdz rūpnieciskiem ultraskaņas procesoriem komerciāliem lietojumiem: