Olbaltumvielu ekstrakcija ar ultraskaņu no audiem un šūnu kultūrām
- Olbaltumvielu ekstrakcija ir būtisks paraugu sagatavošanas posms proteomikā.
- Olbaltumvielas var ekstrahēt no augu un dzīvnieku audiem, raugiem un mikroorganismiem.
- Apstrāde ar ultraskaņu ir uzticama un efektīva olbaltumvielu ekstrakcijas metode, kas nodrošina augstu olbaltumvielu iznākumu īsā ekstrakcijas laikā.
Olbaltumvielu ekstrakcija no audiem un šūnām
Olbaltumvielu ekstrakcija no audiem un kultivētām šūnām ir būtisks paraugu sagatavošanas posms daudzās bioķīmiskās un analītiskās metodēs, piemēram, ELISA, PAGE, Vesternblotā, masspektrometrijā vai olbaltumvielu attīrīšanā. Šūnu sagraušana, līze un ekstrakcija ar ultraskaņu ir precīzi kontrolējama, netermiska metode augsta olbaltumvielu iznākuma nodrošināšanai.
Olbaltumvielu ekstrakcija no šūnām ar ultraskaņas zondi UP200St
- Ātra
- Augsts iznākums
- Ļoti efektīva
- Precīza parametru kontrole
- Reproducējami rezultāti
- Lineāra mērogojamība
Vispārīgi norādījumi līzei un olbaltumvielu ekstrakcijai ar ultraskaņu
- Temperatūras kontrole: Lai nodrošinātu augstu olbaltumvielu iznākumu bez termiskas denaturācijas, ekstrakcijas laikā jākontrolē temperatūra. Hielscher vismodernākie ultraskaņas homogenizatori – saukti arī par ultraskaņas dezintegratoriem vai ultraskaņas apstrādes ierīcēm – ir precīzi kontrolējami. Tie ir aprīkoti ar pieslēdzamu temperatūras sensoru. Ultraskaņas homogenizatora iestatījumos var iestatīt maksimālo temperatūru. Kad šī maksimālā temperatūra ir sasniegta, ultraskaņas apstrādes ierīce automātiski pārtrauc darbību, līdz paraugs ir atdzisis.
- Buferšķīdums: Piemērota buferšķīduma un pareizā buferšķīduma tilpuma izvēle atšķiras atkarībā no audu veida, un tā jānosaka ar izmēģinājumu un kļūdu metodi.
- Izolēšana / attīrīšana: Olbaltumvielu lizāti var saturēt pārmērīgu daudzumu biomolekulu, piemēram, DNS vai ogļhidrātu, kuras var atdalīt, izgulsnējot olbaltumvielas (deoksiholāts–trihloretiķskābe) vai nomainot buferšķīdumu.
Chittapalo un Noomhorm (2009) savā pētījumā ziņoja, ka apstrāde ar ultraskaņu palielināja olbaltumvielu iznākumu un ka audu homogenizācija un līze ar ultraskaņu var ievērojami uzlabot esošos ekstrakcijas procesus – paverot jaunas komerciālas ekstrakcijas iespējas.
Ultraskaņas CupHorn vairāku paraugu vienlaicīgai, ļoti efektīvai sagatavošanai vienādos apstākļos olbaltumvielu izolēšanai un DNS fragmentēšanai.
Olbaltumvielu ekstrakcija no dzīvnieku audiem
Lai sagatavotu veselus audu paraugus (piemēram, nieres, sirdi, plaušas, muskuļus u. c.), audi ar tīriem instrumentiem jāsadala ļoti mazos gabaliņos, vēlams uz ledus, un pēc iespējas ātrāk, lai novērstu noārdīšanos proteāžu iedarbībā (piemēram, līzes buferšķīdums, tāds kā RIPA vai hipotonisks līzes buferšķīdums, kas satur proteāžu un fosfatāžu inhibitoru maisījumu). Pēc sadalīšanas paraugu iegremdē šķidrā slāpeklī straujai sasaldēšanai. Paraugu var uzglabāt -80°C temperatūrā vēlākai lietošanai vai turēt uz ledus tūlītējai homogenizācijai. Tieši pirms ekstrakcijas ar ultraskaņu parauga mēģenē strauji pievieno ledusaukstu līzes buferšķīdumu (ar proteāžu inhibitoriem DTT, leipeptīnu un aprotinīnu) (uz ~10 mg audu ieteicami aptuveni ~600 μL buferšķīduma). Katrā parauga mēģenē ieteicams ievietot aptuveni 20–60mg audu.
Homogenizāciju, līzi un ekstrakciju ar ultraskaņu veic ar ultraskaņas homogenizatoru, piemēram, UP100H vai UP200Ht, kas aprīkots ar sonotrodi ar mikrouzgali. Apstrādes ar ultraskaņu ilgums ir 60–90 sek. ultraskaņas ciklu režīmā ar 15 sek. apstrādi ar ultraskaņu un 10 sek. pārtraukumu. Paraugs visu laiku jātur ledū.
Pēc homogenizācijas / ekstrakcijas ar ultraskaņu lizātu centrifugē pie 27 000g aptuveni 20 min. Pēc tam savāc supernatantu, lai olbaltumvielu koncentrāciju varētu noteikt ar olbaltumvielu noteikšanas testu, piemēram, Pierce BCA olbaltumvielu noteikšanas testu.
Olbaltumvielu ekstrakcija no asins seruma
Lai iegūtu viendabīgu seruma un fosfātu buferšķīduma maisījumu, pirms šūnu ultraskaņas līzes paraugu vispirms sajauc virpuļmaisītājā. Ultraskaņas līzei paraugu apstrādā ar ultraskaņas laboratorijas homogenizatoru, piemēram, UP100H, 8 ciklus ar 20% amplitūdu; katrā ciklā apstrāde ilgst 5 sekundes, bet pārtraukums – 15 sekundes. Olbaltumvielu ekstrakciju veic, apstrādājot paraugu ar ultraskaņu cikliski (pulsācijas režīmā) un novietojot to uz ledus, lai novērstu parauga pārkaršanu un termisko noārdīšanos. Tā kā serums satur lielu daudzumu olbaltumvielu ar lielu molekulmasu (piemēram, albumīnu, α1-antitripsīnu, transferīnu, haptoglobulīnu, imūnglobulīnu G un imūnglobulīnu A), kas IEF laikā traucē atdalīt olbaltumvielas ar mazu molekulmasu, tās ieteicams izņemt no seruma, izmantojot deplecijas kolonnu.
Olbaltumvielu ekstrakcija no augu audiem
Svaigus, mīkstus augu audus, piemēram, sūnas u. c., var viegli sagraut, vienkārši ievietojot sasmalcināto parauga materiālu līzes buferšķīdumā apstrādei ar ultraskaņu. Sīksti, pārkoksnējušies augu audi, piemēram, sēklas, baltegļu skujas u. c., jāsamaļ sausā veidā. Daži cieti, koksnaini augu materiāli pirms ekstrakcijas ar ultraskaņu jāsasaldē un jāsamaļ šķidrā slāpeklī. Augu šūnu kultūru suspensijām lielākoties pietiek ar 30 līdz 150 sekunžu ilgu apstrādi ar ultraskaņu līzes buferšķīdumā. Sīkstākiem materiāliem, piemēram, ķirbju sēklām, nepieciešama intensīvāka apstrāde ar ultraskaņu, kā aprakstīts tālāk.
Protokols albumīna ekstrakcijai no ķirbju sēklām ar ultraskaņu
Lai ar ultraskaņu ekstrahētu olbaltumvielu albumīnu no smalki samalta ķirbju sēklu pulvera, 250mL stikla vārglāzē pievieno 10 g attaukota ķirbju sēklu pulvera un 100 mL dejonizēta ūdens kā šķīdinātāju. Olbaltumvielu ekstrakcija sastāv no diviem posmiem: vispirms paraugu apstrādā ar zondes tipa ultrasonikatoru UP400St (400W, 24kHz), kas aprīkots ar sonotrodi S24d7. Ultraskaņas homogenizācijas laikā stikla vārglāzi ievieto auksta ūdens vannā. Ultrasonikatora UP400St pievienojamais temperatūras sensors un temperatūras kontroles iestatījumi nodrošina, ka parauga temperatūra vienmēr tiek uzturēta zem 30°C. Precīza temperatūras kontrole apstrādes ar ultraskaņu laikā novērš albumīna denaturāciju. Otrajā posmā ekstrakcija tika veikta ar maisītāju pie ātruma 200 rpm un 30°C temperatūrā. Pēc tam vārglāzi pārvieto uz termostatētu kratītāju. Globulīnu atdala, veicot dialīzi ar destilētu ūdeni. Pēc globulīna atdalīšanas var paņemt olbaltumvielu ekstrakta paraugu albumīna profila noteikšanai, un pēc tam ekstraktu noregulē līdz pI=3,0, izmantojot 0,1 M HCl albumīna koagulācijai. Cieto fāzi atdala, centrifugējot pie 5000g un 20°C, un atkārtoti izšķīdina dejonizētā ūdenī. Albumīna koagulāciju veic divreiz, lai palielinātu olbaltumvielu īpatsvaru albumīna koncentrātā.
Sārmainā olbaltumvielu ekstrakcija ar ultraskaņu olbaltumvielu koncentrāta iegūšanai no rīsu klijām liecina, ka apstrāde ar ultraskaņu nodrošina lielāku olbaltumvielu iznākumu ievērojami īsākā ekstrakcijas laikā – salīdzinājumā ar tradicionālajām ekstrakcijas metodēm.
Parauga sagatavošanas protokols funkcionālam iNOS enzīmam
Lai iegūtu pilnībā funkcionālu iNOS enzīmu (piemēram, zāļu skrīningam), ieteicams šāds protokols: šūnu suspensija jānovieto uz ledus un jāapstrādā ar ultraskaņu, izmantojot UP100H ar 10µm amplitūdu cikliskā režīmā, kurā apstrāde ar ultraskaņu ilgst 5 sek., bet pārtraukums uz ledus – 25 sek. Procedūra jāatkārto aptuveni 3 reizes. Pārtraukumi starp apstrādes ar ultraskaņu cikliem mazina temperatūras paaugstināšanos un tādējādi samazinās denaturācijas risku.
Olbaltumvielu solubilizācija ar ultraskaņu
Apstrāde ar ultraskaņu var paātrināt olbaltumvielu solubilizācijas procesu, kas parasti prasa vairākas stundas. Lai nepārkarsētu paraugu un novērstu olbaltumvielu noārdīšanos un modifikācijas urīnvielu saturošos šķīdumos, ultraskaņas impulsiem nevajadzētu ilgt vairāk par dažām sekundēm.
Ultrasonikators UP200Ht ar 2mm mikrouzgali S26d2 mazu paraugu apstrādei ar ultraskaņu.
Ultraskaņas iekārtas olbaltumvielu ekstrakcijai
Hielscher Ultrasonics piedāvā plašu ultraskaņas homogenizatoru klāstu šūnu, audu, baktēriju, mikroorganismu, rauga un sporu sagraušanai.
Hielscher laboratorijas ultraskaņas ierīces ir jaudīgas un viegli lietojamas. Tās ir paredzētas darbībai 24/7 un izstrādātas kā izturīgas un efektīvas laboratorijas un galda ierīces. Visām ierīcēm var precīzi kontrolēt izvadīto enerģiju un amplitūdu. Plašais piederumu klāsts nodrošina papildu konfigurācijas iespējas. Digitālajās ultraskaņas ierīcēs, piemēram, VialTweeter, UP200Ht, UP200St un UP400St, ir integrēta temperatūras kontrole un iebūvēta SD karte automātiskai datu reģistrēšanai.
Vairāku paraugu netiešai un vienlaicīgai apstrādei ar ultraskaņu bez savstarpējas kontaminācijas mēs piedāvājam VialTweeter vai ultraskaņas CupHorn.
Tālāk redzamajā tabulā ir sniegts pārskats par mūsu ultraskaņas ierīcēm paraugu sagatavošanai, šūnu sagraušanai un ekstrakcijai. Noklikšķiniet uz ierīces tipa, lai iegūtu vairāk informācijas par katru ultraskaņas homogenizatoru. Mūsu labi apmācītie tehniskie speciālisti ar ilggadēju pieredzi labprāt palīdzēs jums izvēlēties vispiemērotāko ultraskaņas ierīci jūsu paraugu sagatavošanai!
| Partijas tilpums | Plūsmas ātrums | Ieteicamās ierīces |
|---|---|---|
| līdz 10 flakoniem vai mēģenēm | nav attiecināms | VialTweeter |
| daudziedobju / mikrotitrēšanas plates | nav attiecināms | UIP400MTP |
| vairākas mēģenes / trauki | nav attiecināms | CupHorn |
| 1 līdz 500mL | 10 līdz 200mL/min | UP100H |
| 10 līdz 1000mL | 20 līdz 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 līdz 2000mL | 20 līdz 400mL/min | UP400St |
Atkarībā no jūsu lietojuma, materiāla un parauga tilpuma mēs ieteiksim vispiemērotāko konfigurāciju jūsu paraugu sagatavošanai. Sazinieties ar mums jau šodien!
Sazinieties ar mums! / Jautājiet mums!
Hielscher digitālās ultraskaņas ierīces ir aprīkotas ar attālinātu vadību pārlūkprogrammā un automātisku datu reģistrēšanu integrētā SD kartē.
VialTweeter netiešai apstrādei ar ultraskaņu.
Noderīgi fakti
Proteomika
Proteomika ir pētniecības nozare, kas pēta olbaltumvielas un proteomu. Olbaltumvielas organismos veic ļoti daudz dažādu dzīvībai svarīgu funkciju. Proteoms ir visu olbaltumvielu kopums, ko noteiktā laikā ekspresē genoms, šūna, audi vai organisms. Proteoms mainās laika gaitā un atkarībā no konkrētām prasībām vai stresa, kam pakļauta šūna vai organisms. Precīzāk, tas ir noteikta tipa šūnā vai organismā noteiktā laikā un noteiktos apstākļos ekspresēto olbaltumvielu kopums. Termins ir veidots, apvienojot vārdus «proteīni» un «genoms». Proteomika ir proteoma izpēte.
Olbaltumvielas
Olbaltumvielas ir lielas biomolekulas, tā sauktās makromolekulas – tās sastāv no vienas vai vairākām garām aminoskābju atlikumu ķēdēm. Olbaltumvielas ir sastopamas visos gan augu, gan dzīvnieku izcelsmes organismos, un tām ir izšķiroša nozīme lielākajā daļā bioloģisko funkciju. Tā kā olbaltumvielas satur daudz bioloģiskās informācijas, tās ekstrahē analītiskiem mērķiem, piemēram, proteomikas pētījumiem. Svarīgākās olbaltumvielu veiktās funkcijas ietver vielmaiņas reakciju katalīzi, DNS replikāciju, reakciju uz stimuliem un molekulu transportu no vienas vietas uz citu. Olbaltumvielas cita no citas atšķiras galvenokārt ar aminoskābju secību, ko nosaka to gēnu nukleotīdu secība un kuras rezultātā olbaltumviela parasti salokās specifiskā trīsdimensiju struktūrā, kas nosaka tās aktivitāti. Olbaltumvielas līdzās peptīdiem ir viena no galvenajām pārtikas sastāvdaļām. Tāpēc proteomika ir spēcīgs instruments pārtikas zinātnē procesu, pārtikas drošuma un uzturvērtības novērtēšanas optimizēšanai.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction ir pirmsanalīzes procedūra analītu atdalīšanai un iepriekšējai koncentrēšanai. Kombinācijā ar apstrādi ar ultraskaņu ekstrakciju duļķošanās punktā var intensificēt, padarot procesu efektīvāku, ātrāku un videi draudzīgāku. Izmantojot apstrādi ar ultraskaņu, ekstrakcija duļķošanās punktā ir ievērojami efektīvāka analītu sagatavošanas metode. Lasiet vairāk par ultraskaņas veicinātu ekstrakciju duļķošanās punktā!
Gela elektroforēze
Gela elektroforēze ir galvenā metode makromolekulu, piemēram, DNS, RNS un olbaltumvielu, kā arī to fragmentu atdalīšanai un analīzei pēc to izmēra un lādiņa. Klīniskajā ķīmijā to izmanto olbaltumvielu atdalīšanai pēc lādiņa un/vai izmēra (IEF agarozē, būtībā neatkarīgi no izmēra), bet bioķīmijā, molekulārajā bioloģijā un proteomikā – DNS un RNS fragmentu maisījuma atdalīšanai pēc garuma, DNS un RNS fragmentu izmēra novērtēšanai vai olbaltumvielu atdalīšanai pēc lādiņa.
Šūnu kultūras
Šūnu kultivēšana ir kontrolēts audzēšanas process, kurā šūnas audzē kontrolētos apstākļos. Kultivēšanas apstākļi katram šūnu tipam atšķiras. Kopumā šūnu kultūras vidi veido piemērots trauks (piemēram, Petri trauks) ar substrātu vai barotni, kas nodrošina nepieciešamās barības vielas (aminoskābes, ogļhidrātus, vitamīnus, minerālvielas), augšanas faktorus, hormonus un gāzes (CO2, O2) un regulē fizikāli ķīmisko vidi (pH buferis, osmotiskais spiediens, temperatūra). Lielākajai daļai šūnu ir nepieciešama virsma vai mākslīgs substrāts, savukārt citas šūnu kultūras var audzēt, tām brīvi peldot barotnē (suspensijas kultūra, šūnu suspensija).
Dzīvnieku šūnu līniju masu kultūras izmanto vīrusu vakcīnu un citu biotehnoloģiski iegūtu produktu rūpnieciskajā ražošanā. Cilvēka cilmes šūnas kultivē, lai palielinātu šūnu skaitu un diferencētu tās dažādos somatisko šūnu tipos transplantācijas vajadzībām.
Audu paraugi
Termins «audi» apzīmē šūnu materiāla organizācijas starplīmeni starp šūnām un veselu orgānu. Audos ir apvienotas līdzīgas šūnas ar vienādu izcelsmi, kas kopīgi veic noteiktu funkciju. Vairākiem audiem funkcionāli apvienojoties, veidojas sarežģītas orgānu struktūras.
Audu paraugus ņem pētījumiem bioloģijā, histoloģijā/histopatoloģijā, parazitoloģijā, bioķīmijā un imūnhistoķīmijā, kā arī kultivēšanai un DNS ekstrakcijai. Izšķir dzīvnieku audus (apakšgrupa: zīdītāju audi) un augu audus. Dzīvnieku audus iedala četros pamatveidos: saistaudos, muskuļaudos, nervaudos un epitēlijaudos. Augu audus iedala šādās trīs audu sistēmās: epiderma, pamataudi un vadaudi.
Audu paraugus var sagatavot no dzīvnieku vai augu daļām, piemēram, kauliem, muskuļiem, lapām utt.
Organisma šķidrumi
Asinis, serums, plazma, cerebrospinālais šķidrums, siekalas un sinoviālais šķidrums ir organisma šķidrumi, kas ir bagātīgs diagnostiski nozīmīgas informācijas avots. Tādēļ ir svarīga rūpīga organisma šķidrumu paraugu sagatavošana analīzei. Pirmā grūtība ir saistīta ar organisma šķidrumos esošo komponentu plašo dinamisko diapazonu.
Olbaltumvielu koncentrācijas noteikšana
Bredforda metode, Lourija metode un bicinhonīnskābes (BCA) metode ir plaši izmantotas olbaltumvielu koncentrācijas noteikšanas metodes. Liellopu seruma albumīns (BSA) ir viens no visbiežāk izmantotajiem olbaltumvielu standartiem.
Līzes buferis
Līzes buferis jāizvēlas atbilstoši šūnu materiālam vai audiem (audu kultūra, augs, baktērijas, sēnes utt.), kā arī tam, vai šūnas ir apvienotas struktūrā un kāds ir šīs struktūras veids. Dažādu līzes buferu sastāvā olbaltumvielu, membrānu un organoīdu ekstrakcijai ir viens vai vairāki detergenti. Detergentu parasti izvēlas izmēģinājumu un kļūdu ceļā vai – ja pieejams – saskaņā ar esošu olbaltumvielu ekstrakcijas protokolu. Detergentam jābūt saderīgam ar audu izcelsmi un olbaltumvielām. Parasti izvēlas saudzīgāko detergentu, kas ir efektīvs konkrētajiem audiem / olbaltumvielai, lai saglabātu ekstrakta maksimālo funkcionalitāti. Turklāt membrānu un organoīdu ekstrakcijas gadījumā saudzīgs detergents saglabā membrānu neskartu. Līzes buferos bieži izmantotie detergenti lielākoties ir nejonu vai cviterjonu detergenti, piemēram, CHAPS, deoksiholāts, Triton™ X-100, NP40 un Tween 20.
Piemēram, tādus audus kā smadzeņu, aknu, zarnu, nieru, liesas u. c. audus var vienkārši buferēt ar RIPA – tomēr jāpievieno proteāžu inhibitori un DTT (piemēram, gela elektroforēzei).
Līzes buferis skeleta muskuļu audiem (ledusauksts): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerīna, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitola, papildināts ar proteāžu un fosfatāžu inhibitoru kokteili
Bieži izmantoto buferu un to pH diapazonu tabula. Parasti šos buferus izmanto 20–50 mM koncentrācijā.
| Buferis | pH diapazons |
|---|---|
| Citronskābe – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Nātrija citrāts – citronskābe | 3,0 – 6,2 |
| Nātrija acetāts – etiķskābe | 3,6 – 5,6 |
| Kakodilskābes nātrija sāls – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Nātrija dihidrogēnfosfāts – dinātrija hidrogēnfosfāts | 5,8 – 8,0 |
| Imidazols – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolamīna hidrohlorīds – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricīns – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Nātrija tetraborāts – borskābe | 7,6 – 9,2 |
| Bicīns – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glicīns – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Lielākajai daļai buferu pH ir atkarīgs no temperatūras. Tas īpaši attiecas uz Tris buferiem. pKa mainās no 8,06 pie 25°C līdz 8,85 pie 0°C.
(Bufera pH un pKa: pH raksturo ūdeņraža jonu koncentrāciju ūdens šķīdumā. pKa (= skābes disociācijas konstante) ir saistīts, bet specifiskāks rādītājs, jo tas palīdz prognozēt molekulas uzvedību pie noteiktas pH vērtības.)
TRIzol
TRIzol ir ķīmisks šķīdums, ko izmanto RNS/DNS/olbaltumvielu ekstrakcijai, veicot ekstrakciju ar guanidīnija tiocianātu, fenolu un hloroformu. Izmantojot TRIzol ekstrakciju ar ultraskaņas palīdzību, no viena un tā paša parauga iegūst augstu DNS, RNS un olbaltumvielu iznākumu, tādējādi pārspējot citas ekstrakcijas metodes.
Literatūra/atsauces
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.