Ultraskaņas proteīnu ekstrakcija no audu un šūnu kultūrām
- Olbaltumvielu ieguve ir būtisks paraugu sagatavošanas solis proteomikā.
- Proteīnus var ekstrahēt no augu un dzīvnieku audiem, raugiem un mikroorganismiem.
- Sonication ir uzticama, efektīva olbaltumvielu ekstrakcijas metode, kas dod augstu olbaltumvielu ražu īsā ekstrakcijas laikā.
Olbaltumvielu ekstrakcija no audiem un šūnām
Olbaltumvielu ieguve no audiem un kultivētām šūnām ir būtisks paraugu sagatavošanas solis, kas tiek veikts daudzu bioķīmisko un analītisko paņēmienu laikā, piemēram, ELISA, PAGE, Rietumu dzēšpapīra, masas spektrometrija vai proteīna attīrīšana. Ultraskaņas šūnu traucējumi, līze un ekstrakciju ir precīzi kontrolējama tehnika, kas nodrošina olbaltumvielu augstu ražību.
Olbaltumvielu ekstrakcija no dzīvnieku audiem
Visa izmēra audu (piemēram, nieru, sirds, plaušu, muskuļu u. c.) sagatavošanai audus sadala ļoti mazos gabaliņos ar tīriem instrumentiem, vēlams, uz ledus, un, cik ātri vien iespējams, lai novērstu degradāciju ar proteāzēm (piemēram, līzes buferšķīdumu, piemēram, Vai hipotoniskās līzes buferšķīdumā, kas satur proteāzes un fosfatāzes inhibitora kokteili). Pēc secēšanas paraugu iegremdē šķidrā slāpeklī snap Freeze. Paraugu var uzglabāt-80 ° c temperatūrā vēlākai izmantošanai vai būt keept uz ledus tūlītējai homogenizācijai. Tieši pirms ultraskaņas ekstrakcijas ir ieteicama ledus aukstā līzes buferšķīduma (ar proteāžu inhibitoriem DTT, leupeptin un aprotinin) mēģenē (par ~ 10 mg audu apm. ~ 600 μL buferšķīduma). Katrā mēģenē ieteicams izmantot aptuveni 20-60mg audu.
Ultraskaņas homogenizācija, līze un ekstrakcija tiek veikta ar ultraskaņas homogenizētāju, piemēram, UP200Ht vai UP200St, kas aprīkots ar mikro-tip sonotrode. Ultraskaņu ilgums ir 60-90 SEK ultraskaņas ciklā režīmā 15 sek. ultraskaņas un 10 sek. atpūtas laiks. Paraugs jāglabā ledus visu laiku.
Pēc ultraskaņas homogenizācijas/ekstrakcijas lizātu centrifugē 27 000 g temperatūrā par aptuveni 20 min. pēc tam tiek savākts centrifugāts, lai olbaltumvielu koncentrāciju varētu noteikt ar olbaltumvielu testu, piemēram, Pierce proteīna testu BCA.
Ultraskaņas olbaltumvielu ekstrakcija no šūnām ar UP200St
Olbaltumvielu ekstrakcija no asins seruma
Homogēna seruma un fosfāta buferšķīduma sajaukumam paraugu pirms ultraskaņas šūnu līzes veic ar virpuzi. Ultraskaņas līzes gadījumā paraugs ir ar ultraskaņu ultraskaņas laboratorijas homogenizators, piemēram, UP100H 8 cikliem pie 20% amplitūdas, ciklos katra 5 sekundes un 15 sekundes off. Sonikāciju veic sonicationg ciklos un ievietojot paraugu uz ledus tā, ka tiek novērsta parauga pārkaršana un termiskā degradācija. Tā kā serums satur lielu daudzumu augstas molekulāras olbaltumvielas (piemēram, albumīns, α1-antitrypsin, transferīns, haptoglobulīns, imūnglobulīns G un imūnglobulīns A), kas traucē nodalīt mazas molekulmasas olbaltumvielas IEF laikā, ir no seruma, izmantojot izsīkšanas kolonnu.
Olbaltumvielu ekstrakcija no augu audiem
Svaigus, mīkstos augu audus, piemēram, sūnas utt., var viegli izjaukt, vienkārši ievietojot sasmalcinātu parauga materiālu sabrukšanas buferšķīdumā apstrādei ar ultraskaņu. Grūts, ligenous augu audu, piemēram, sēklas, egles adatas uc, būtu zemes sausa. Daži cieti koksnes augu materiāli pirms apstrādes ar ultraskaņu ir jāsasaldē un jāsasmalcē šķidrā slāpeklī. Augu šūnu kultūru apturēšanai, ultraskaņas apstrāde no 30 līdz 150 sekundēm līzes buferšķīdumā lielākoties ir pietiekama. Stingrāki materiāli, piemēram, ķirbju sēklas, prasa intensīvāku ultraskaņas apstrādi, kā aprakstīts tālāk.
Protokols ultraskaņas ieguvei albumīnu no ķirbju sēklām
Ar ultraskaņas proteīnu ekstrakciju no smalkās ķirbju sēklu pulvera, 10 g attauvotu ķirbju sēklu pulvera un 100 mL dejonizēta ūdens kā šķīdinātāju pievieno 250 ml stikla vārglāzē. Olbaltumvielu ekstrakcija sastāv no diviem soļiem: pirmkārt, paraugs ir ar ultraskaņu ar zondi UP400St (400W, 24kHz) ar uzstādīts sonotrode S24d7. Stikla vārglāzi ievieto aukstā ūdens vannā ultraskaņas homogenizācijas laikā. Par ultraskaņotājs iestatījums UP400St ar pievienojamo temperatūras sensoru nodrošina, ka parauga temperatūra vienmēr tiek turēta zem 30 ° c. Ar precīzu temperatūras kontroli ultraskaņas apstrādes laikā, tiek novērsta albumīna denaturācija. Otrkārt, ekstrakcija tika veikta ar maisītāju pie 200 rpm ātruma un 30 ° c. Pēc tam vārglāzi pārnes termostatiskā kratītājā. Globulin tiek izvadīts caur dialīzi ar destilētu ūdeni. Pēc globulīna noņemšanas olbaltumvielu ekstraktu var noņemt albumīna profila noteikšanai, un pēc tam to pielāgo pI = 3.0, izmantojot 0,1 M HCl albumīna koagulācijai. Cieto fāzi atdala centrifugēšana 5000g, 20 ° c temperatūrā un no jauna izšķīdina dejonizēta ūdenī. Albumīns koagulācija tiek veikta divreiz, lai palielinātu olbaltumvielu attiecība albumīna koncentrāts.
Ultraskaņas sārmu proteīnu ieguve, lai pagatavotu olbaltumvielu koncentrātu no rīsu klijām, rāda, ka ultraskaņas apstrāde rada augstāku olbaltumvielu ražu ievērojami īsākā ekstrakcijas laikā – tradicionālajām ekstrakcijas metodēm.
VialTweeter netiešai apstrādei ar ultraskaņu.
- Strauju
- augstu ražu
- ļoti efektīvs
- Precīzāka kontrole pār parametriem
- Reproducēt rezultāti
- Lineāra mērogojamība
Paraugu sagatavošanas protokols funkcionāliem iNOS fermentiem
Lai iegūtu pilnībā funkcionālus iNOS fermentus (piemēram, zāļu skrīningu), ieteicama šāda protokola: šūnu suspensija jānovieto uz ledus un ar ultraskaņu UP100H pie 10 μm amplitūdas cikla režīmā 5 sek. ultraskaņu un 25 sek., atpūta uz ledus. Procedūra jāatkārto aptuveni 3 reizes. Atpūtas laiks starp ultraskaņu cikli samazina temperatūras celšanos un tādējādi samazina risku denaturāciju.
Ultraskaņas proteīnu Solubilizācijas
Sonication var paātrināt proteīnu šķīdībaprocess, kas parasti prasa vairākas stundas. Lai nepārsildītu paraugu un nepieļautu olbaltumvielu noārdīšanos un to šķīdumu modifikāciju, kas satur urīnvielu, ultraskaņas pārrāvumi nedrīkst ilgt ilgāk par dažām sekundēm.
Vispārēji norādījumi
Temperatūras kontrole: Lai nodrošinātu augstu olbaltumvielu ražu bez termiskā denaturācijas, ir jākontrolē temperatūra ekstrakcijas laikā. Hielscher mūsdienīgas ultraskaņas homogenizatori – saukts arī par ultraskaņas disintegratoru vai sonificētāju – ir precīzi kontrolējami. Tiem ir pieslēdzams temperatūras sensors. Nosakot ultraskaņas homogenizatora iestatījumu iespējas, var iestatīt maksimālo temperatūru. Ja sasniegta maksimālā temperatūra, ultrasonikators automātiski apstājas, līdz paraugs ir atdzisis.
Buferis: Piemērota buferšķīduma un pareizā tilpuma buferšķīduma tilpums atšķiras no audiem līdz audiem, un tas ir izpētījis, veicot izmēģinājumu un kļūdu testēšanu.
Izolācija/attīrīšana: Olbaltumu sastāvā var būt arī biomolekulu, piemēram, DNS vai ogļhidrātu, pārākums, ko var izvadīt ar proteīnu izgulsnēšanos (dezoksiholāts-trihloretiķskābe) vai buferapmaiņa.
Chittapalo un Noomhorm (2009) ziņoja, ka olbaltumvielu raža pieauga, izmantojot ultraskaņas un ka ultraskaņas audu homogenizācijas un sabrukšanas process var uzlabot esošos ekstrakcijas procesus ievērojami – iespēju izmantot jaunas komerciālas ieguves iespējas.
Ultraskaņas audu homogenizators UP200St efektīvu olbaltumvielu ieguvi
Pārlūkprogrammas kontrole, lai precīzi darbotos un uzraudzītu ultraskaņas procesu
Ultraskaņas iekārtas olbaltumvielu ekstrakcijai
Hielscher Ultrasonics piedāvā plašu ultraskaņas homogenizētāju klāstu šūnu, audu, baktēriju, mikroorganismu, rauga un sporu sairšanai.
Hielscher laboratorijas ultraskaņas aparāti ir jaudīgi un viegli lietojami. Būvēts priekš 24/7 operācijām, tie ir veidoti kā robustas un efektīvas laboratorijas un solu-top ierīces. Visām ierīcēm var precīzi kontrolēt enerģijas izvadi un amplitūdu. Plaša spektra Piederumi atver turpmākas iestatīšanas opcijas. Digitālās ierīces, piemēram, VialTweeter, UP200Ht, UP200St, un UP400St ir integrēta temperatūras kontrole un iebūvēta SD karte automātiskai datu ierakstīšanai.
Attiecībā uz netiešu, krusteniskā piesārņojuma un vienlaicīgu vairāku paraugu ultraskaņu, mēs piedāvājam VialTweeter vai Ultraskaņas CupHorn.
Atkarībā no jūsu pieteikumu, materiālu un parauga apjomu, mēs iesakām vispiemērotāko setup jūsu parauga ieplūdes. Sazinies ar mums jau šodien!
Literatūra / Literatūras saraksts
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): ar ultraskaņas palīdzību sārmzemju ekstrakcija no attautētām rīsu klijām un olbaltumvielu koncentrātu īpašības. Int J pārtikas Sci Technol 44:1843-1849.
- Simões, André E. S:; ..., Diane M.; Leina, Aīda. Nunes, ana F.; E.; , Z. Sveiki, Adrian C.; D ' Hooge, rudi; , A., Klford J. Guna, Gunte. Borja, M. Rodrigues, Cecília M.P. (2013): efektīva proteīnu atgūšana no vairākiem avota paraugiem pēc trizol vai trizol LS RNS ekstrakcijas un ilgstošas uzglabāšanas. BMC Genomics 2013, 14:181.
Fakti ir vērts zināt
Proteomika
Proteomics ir pētniecības jomā, kas izmeklē olbaltumvielas un proteome. Proteīni fullfil plašs vitālo funkciju ietvaros organismiem. Proteoms ir viss proteīnu komplekts, ko noteiktā laikā izsaka genomu, šūnu, audu vai organismu. Proteoms atšķiras ar laiku un atšķirīgām prasībām, vai uzsver, ka šūna vai organisms iziet. Konkrētāk, tā ir izteikta olbaltumvielu kopa konkrētā tipa šūnā vai organismā noteiktā laikā noteiktos apstākļos. Termins ir maisījums olbaltumvielu un genomu. Proteomika ir pētījums par proteomu.
Olbaltumvielu
Olbaltumvielas ir lielas biomolekulas, tā sauktās makromolekulas – kas sastāv no vienas vai vairākām garām aminoskābju atlikumu ķēdēm. Proteīni atrodas visos augu un dzīvnieku izcelsmes organismu organismos, un tiem ir izšķiroša nozīme lielākajā daļā bioloģisko funkciju. Tā kā olbaltumvielas satur daudz bioloģisko informāciju, tās tiek iegūtas analītiskiem mērķiem, piemēram, proteomisko pētniecību. Svarīgākā funkcija, ko veic olbaltumvielas, ir vielmaiņas reakciju katalīze, DNS replikācija, reakcija uz stimuliem un molekulu transportēšana no vienas vietas uz citu. Olbaltumvielas atšķiras viens no otra galvenokārt to secību aminoskābēm, ko diktē nukleotīdu secība to gēnu, un kas parasti izraisa olbaltumvielu locīšana vērā īpašu trīsdimensiju struktūra, kas nosaka tās darbību. Proteīni ir – bez peptīdiem – viens no galvenajiem pārtikas komponentiem. Tādēļ proteomika ir spēcīgs instruments pārtikas zinātnē, lai optimizētu procesus, pārtikas nekaitīgumu un uztura novērtējumu.
Gela elektroforēzes
Gela elektroforēze ir galvenā makromolekulu, piemēram, DNS, RNS un proteīnu, atdalīšanas un analīzes metode, kā arī to fragmenti atkarībā no to lieluma un uzlādes līmeņa. To lieto klīniskos ķīmijā, lai atdalītu olbaltumvielas un/vai lielumu (IEF agradās, būtībā neatkarīga) un bioķīmijas, molekulārās bioloģijas un proteomikas, lai atdalītu jauktas populācijas DNS un RNS fragmentos pēc garuma, lai aplēstu lielumu No DNS un RNS fragmentiem vai ar uzlādētu proteīnu atdalīšanai.
Šūnu kultūras
Šūnu kultūra ir kontrolēts audzēšanas process, kurā šūnas tiek kultivētas kontrolētos apstākļos. Šūnu kultūras apstākļi katram šūnas veidam atšķiras. Parasti šūnu kultūras vide sastāv no piemērota trauka (piemēram, Petri trauciņā) ar substrātu vai nesēju, kas piegādā būtiskās uzturvielas (aminoskābes, ogļhidrātus, vitamīnus, minerālvielas), augšanas faktorus, hormonus un gāzes (CO2O2), kā arī regulē Physio ķīmisko vidi (pH buferšķīdums, osmotiskais spiediens, temperatūra). Lielākajai daļai šūnu ir vajadzīga virsma vai mākslīgais substrāts, kamēr citas šūnu kultūras var audzēt brīvi peldošu kultūras vidē (suspensija kultūra, šūnu suspensija).
Dzīvnieku šūnu līniju masu kultūras izmanto vīrusu vakcīnu un citu biotehnoloģiski iegūtu produktu rūpnieciskai ražošanai. Cilvēka cilmes šūnas tiek kultivētas, lai paplašinātu šūnu skaitu un diferencētu šūnas dažādos somatisko šūnu tipos transplantācijas nolūkā.
Audu paraugi
Termins Audi apraksta šūnu starpproduktu, kur šūnu materiāls ir par organizatorisko līmeni starp šūnām un pilnu orgānu. Audos, līdzīgās šūnās, no vienas izcelsmes, kas kopā veic īpašu funkciju, ir samontēti. Ar funkcionālo grupu vairāku audu, sarežģītas struktūras orgāniem veidojas.
Audos ņem paraugus bioloģijas, histoloģijas/histopatoloģijas, parazitoloģijas, bioķīmijas, imūnhistoķīmijas, kā arī, lai kultivētu un ekstrahētu DNS izpētei. To var atšķirt no dzīvnieka (apakšiedaļa: zīdītāju Audi) un augu audiem. Dzīvnieku Audi ir sagrupēti četrās pamatveidos saistaudu, muskuļu, nervu un epitēlija audu. Augu Audi ir sīkāk iedalīts šādās trīs audu sistēmās: epidermā, zemes audos un asinsvadu audos.
Audu paraugus var pagatavot no dzīvnieku vai augu daļām, piemēram, kaula, muskuļiem, lapām u. tml.
Ķermeņa šķidrumi
Asinis, seruma, plazmas, cerebrospinālā šķidruma, siekalu un sinoviālā šķidruma ir ķermeņa šķidrumiem, kas piedāvā lielisku avotu diagnostiski būtisku informāciju. Tāpēc, sarežģītu sagatavošanu ķermeņa šķidrumu paraugus analīzei ir svarīga. Pirmā problēma ir saistīta ar plašu dinamisko komponentu klāstu, kas atrodas ķermeņa šķidrumos.
Olbaltumvielu koncentrācijas noteikšana
Bradford testā, Lowry pārbaude un bicinchoninic Acid (BCA) pārbaude ir kopīgas testos, lai noteiktu koncentrāciju proteīniem. Liellopu seruma albumīns (ĶVL) ir viens no visbiežāk izmantotajiem olbaltumvielu standartiem.
Līzes buferis
Līzes buferšķīdums jāizvēlas saskaņā ar šūnu materiālu vai audiem (audu kultūru, augiem, baktērijām, sēnītēm utt.), un vai šūnām ir struktūra un struktūras tips. Proteīnu, membrānu un organelles ekstraktiem tiek izmantots plašs līzes buferi, kas satur vienu vai vairākus mazgāšanas līdzekļus. Mazgāšanas līdzekli parasti izvēlas, izmantojot izmēģinājumu un kļūdu testus vai – Ja tas ir pieejams – saskaņā ar esošo proteīnu ekstrakcijas protokolu. Mazgāšanas līdzekļiem jābūt saderīgiem ar audu avotu un proteīniem. Lai uzturētu ekstrakta maksimālo funkcionalitāti, parasti izvēlas mildest mazgāšanas līdzekli, kas iedarbojas uz specifisku audu/olbaltumvielu. Turklāt, ja membrānu un organelles ekstrakciju, maigs mazgāšanas līdzeklis notur membrānu neskartu. Līzes buferos izmantotie mazgāšanas līdzekļi lielākoties ir nejonu vai zwitterjonu, piemēram, CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40 un Tween 20.
Piemēram, tādus audus kā smadzenes, aknas, zarnas, nieres, liesa u.c. var vienkārši buferēts ar RIPA – Tomēr būtu jāiekļauj proteāzes inhibitori un DTT (piemēram, gēla elektroforēzes procedūra).
Līzes buferšķīdums skeleta muskuļu audiem (ledus auksts): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (m/v) glicerīnam, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitola, ko papildina ar proteāzes un fosfatāzes inhibitoru kokteili
Kopējo buferu tabula un to pH diapazons. Parasti šie buferi tiek izmantoti koncentrācijā 20-50 mM.
| Buferis | pH diapazons |
|---|---|
| Citronskābes – Naoh | 2,2. – 6,5. |
| Nātrija citrāts – Citronskābes | 3,0. – 6,2. |
| Nātrija acetāts – Etiķskābes | 3,6. – 5,6. |
| Nātrija sāls cacodkarbonskābes – Hcl | 5,0. – 7,4. |
| Tes – Naoh | 5,6. – 6,8. |
| Nātrija dihidrogēnfosfāts – dinātrija hidrogēnfosfāts | 5,8. – 8,0. |
| Imidazola – Hcl | 6,2. – 7,8. |
| MOPS – Koh | 6,6. – 7,8. |
| Trietanolamīna hidrohlorīds – Naoh | 6,8. – 8,8. |
| Tris – Hcl | 7,0. – 9,0. |
| HEPES – Naoh | 7,2. – 8,2. |
| Tricīns – Naoh | 7,6. – 8,6. |
| Nātrija tetraborāts – borskābe | 7,6. – 9,2. |
| Bicīns – Naoh | 7,7. – 8,9. |
| Glicīns – Naoh | 8,6. – 10,6. |
Lielākā daļa buferi rāda pH atkarību ar temperatūru. Tas jo īpaši attiecas uz tris buferiem. PKa izmaiņas no 8,06 pie 25 ° c līdz 8,85 pie 0 ° c.
(pH un pKa buferšķīdumā: pH mēra ūdeņraža jonu koncentrāciju ūdens šķīdumā. pKa (= skābju disociācijas konstante) ir saistīts, bet konkrētāku pasākumu, jo tas palīdz prognozēt, kā molekula rīkosies ar konkrētu pH vērtību.)
Triizols
TRIzol ir ķīmiskais šķīdums, ko izmanto, lai iegūtu RNS/DNS/proteīnu guanidīnija tiocianāta-fenola-hloroforma ekstrakcijas laikā. Izmantojot ultraskaņas palīdz trizol ekstrakcijas rezultātā augstu DNS, RNS un olbaltumvielu ražu no viena parauga un izceļas tādējādi citas ekstrakcijas metodes.