Ultraskaņas proteīnu ekstrakcija no audu un šūnu kultūrām
- Olbaltumvielu ekstrakcija ir būtisks parauga sagatavošanas posms proteomikā.
- Olbaltumvielas var iegūt no augu un dzīvnieku audiem, raugiem un mikroorganismiem.
- Ultraskaņas apstrāde ir uzticama, efektīva olbaltumvielu ekstrakcijas metode, kas īsā ekstrakcijas laikā nodrošina augstu olbaltumvielu daudzumu.
Olbaltumvielu ekstrakcija no audiem un šūnām
Olbaltumvielu ekstrakcija no audiem un kultivētām šūnām ir būtisks paraugu sagatavošanas posms, kas tiek veikts daudzu bioķīmisko un analītisko metožu laikā, piemēram, ELISA, PAGE, Western blotting, masas spektrometrijā vai olbaltumvielu attīrīšanā. Ultraskaņas šūnu darbības traucējumi, līze un ekstrakcija ir precīzi kontrolējama, ne-termiska tehnika, lai nodrošinātu augstu proteīnu ražu.
Olbaltumvielu ekstrakcija no šūnām ar ultraskaņas zonde UP200St
- Strauju
- augstas ražas
- Ļoti efektīvs
- Precīza parametru kontrole
- reproducējami rezultāti
- lineārā mērogojamība
Vispārīgi norādījumi ultraskaņas līzei un proteīnu ekstrakcijai
- Temperatūras kontrole: Lai nodrošinātu augstu olbaltumvielu daudzumu bez termiskās denaturācijas, ekstrakcijas laikā ir jākontrolē temperatūra. Hielscher modernākie ultraskaņas homogenizatori – To sauc arī par ultraskaņas dezintegratoru vai ultrasonifikatoru – ir precīzi kontrolējami. Tie ir aprīkoti ar pievienojamu temperatūras sensoru. Ultraskaņas homogenizatora iestatīšanas opcijās var iestatīt maksimālo temperatūru. Kad šī temperatūra ir sasniegta, ultrasonikators automātiski apstājas, līdz paraugs ir atdzisis.
- Buferis: Piemērota buferšķīduma izvēle un pareizais buferšķīduma tilpums dažādiem audiem ir atšķirīgs, un tas jānoskaidro, veicot izmēģinājumu un kļūdu testus.
- Izolācija / attīrīšana: Olbaltumvielu lizāti var saturēt pārāk daudz biomolekulu, piemēram, DNS vai ogļhidrātus, ko var atdalīt ar olbaltumvielu izgulsnēšanu (dezoksiholātu-trihloretiķskābi) vai bufera apmaiņu.
Chittapalo un Noomhorm (2009) savā pētījumā ziņoja, ka olbaltumvielu raža palielinājās, izmantojot ultraskaņu, un ka ultraskaņas audu homogenizācijas un līzes process var ievērojami uzlabot esošos ekstrakcijas procesus – radot jaunas komerciālas ieguves iespējas.
Ultraskaņas CupHorn vienlaicīgai, ļoti iedarbīgai vairāku paraugu sagatavošanai vienādos apstākļos olbaltumvielu izolēšanai un DNS fragmentācijai.
Olbaltumvielu ekstrakcija no dzīvnieku audiem
Lai sagatavotu veselus audus (piemēram, nieres, sirdi, plaušas, muskuļus utt.), audi ar tīriem instrumentiem jāsadala ļoti mazos gabaliņos, vēlams uz ledus un pēc iespējas ātrāk, lai novērstu noārdīšanos ar proteāzēm (piemēram, līzes buferšķīdums, piemēram, RIPA vai hipotoniskās līzes buferšķīdums, kas satur proteāzi un fosfatāzes inhibitoru kokteili). Pēc sadalīšanas paraugu iegremdē šķidrā slāpeklī, lai to sasaldētu. Paraugu var uzglabāt -80 °C temperatūrā vēlākai izmantošanai vai uzglabāt uz ledus tūlītējai homogenizācijai. Tieši pirms ultraskaņas ekstrakcijas parauga mēģenē ātri pievieno ledus aukstās līzes buferšķīdumu (ar proteāzes inhibitoriem DTT, leipeptīnu un aprotinīnu) (uz ~ 10 mg audu ieteicams aptuveni ~ 600 μL bufera). Vienā parauga mēģenē ieteicams lietot aptuveni 20-60mg audu.
Ultraskaņas homogenizācija, līze un ekstrakcija tiek veikta ar ultraskaņas homogenizatoru, piemēram, UP100H vai UP200Ht, kas aprīkots ar mikro-tip sonotrode. Ultraskaņas apstrādes ilgums ir 60-90 sek. pie ultraskaņas cikla režīma 15 sek. Paraugs visu laiku jātur ledū.
Pēc ultraskaņas homogenizācijas / ekstrakcijas lizātu centrifugē pie 27 000 g apmēram 20 minūtes. Pēc tam centrifugātu savāc, lai olbaltumvielu koncentrāciju varētu noteikt ar proteīna testu, piemēram, Pierce proteīna testu BCA.
Olbaltumvielu ekstrakcija no asins seruma
Homogēnam seruma un fosfāta bufera maisījumam paraugs vispirms tiek virpulis pirms ultraskaņas šūnu līzes. Ultraskaņas līzei paraugs tiek apstrādāts ar ultraskaņas laboratorijas homogenizatoru, piemēram, UP100H 8 cikliem ar 20% amplitūdu, cikliem ik pēc 5 sekundēm un 15 sekundēm. Olbaltumvielu ekstrakciju veic, apstrādājot ar ultraskaņu ciklos (pulsācijas režīmā) un novietojot paraugu uz ledus, lai izvairītos no parauga pārkaršanas un termiskās degradācijas. Tā kā serums satur lielu daudzumu augstas molekulmasas olbaltumvielu (piemēram, albumīnu, α1-antitripsīnu, transferīnu, haptoglobulīnu, imūnglobulīnu G un imūnglobulīnu A), kas traucē zemas molekulmasas proteīnu atdalīšanu IEF laikā, ieteicams tos noārdīt no seruma, izmantojot izsīkuma kolonnu.
Olbaltumvielu ekstrakcija no augu audiem
Svaigus, mīkstus augu audus, piemēram, sūnas utt., Var viegli izjaukt, vienkārši ievietojot sasmalcinātu parauga materiālu līzes buferī ultraskaņas apstrādei. Izturīgie, ligenous augu audi, piemēram, sēklas, egļu skujas utt., Ir jāsasmalcina. Daži cietie, koksnes augu materiāli ir jāiesaldē un jāsasmalcina šķidrā slāpeklī, pirms tos ekstrahē ar ultraskaņu. Augu šūnu kultūru suspensijām galvenokārt pietiek ar ultraskaņas apstrādi no 30 līdz 150 sekundēm līzes buferī. Stingrākam materiālam, piemēram, ķirbju sēklām, nepieciešama intensīvāka ultraskaņas apstrāde, kā aprakstīts turpmāk.
Protokols albumīna ultraskaņas ekstrakcijai no ķirbju sēklām
Albumīna ultraskaņas olbaltumvielu ekstrakcijai no smalki malta ķirbju sēklu pulvera 250 ml stikla vārglāzē pievieno 10 g attaukota ķirbju sēklu pulvera un 100 ml dejonizēta ūdens kā šķīdinātāju. Olbaltumvielu ekstrakcija sastāv no diviem posmiem: Pirmkārt, paraugs tiek apstrādāts ar ultraskaņu ar zondes tipa ultrasonikators UP400St (400W, 24kHz), kas aprīkots ar sonotrode S24d7. Stikla vārglāze tiek ievietota aukstā ūdens vannā ultraskaņas homogenizācijas laikā. Ultrasonicator UP400St pievienojams temperatūras sensors un temperatūras kontroles iestatījumi nodrošina, ka parauga temperatūra vienmēr tiek uzturēta zem 30 ° C. Ar precīzu temperatūras kontroli ultraskaņas apstrādes laikā tiek novērsta albumīna denaturācija. Otrkārt, ekstrakcija tika veikta ar maisītāju ar ātrumu 200 apgr./min un 30°C. Pēc tam vārglāzi pārnes termostata kratītājā. Globulīns tiek atdalīts dialīzes ceļā ar destilētu ūdeni. Pēc globulīna atdalīšanas olbaltumvielu ekstraktu var ņemt paraugus albumīna profila noteikšanai, un pēc tam to pielāgo pI=3,0, izmantojot 0,1 M HCl albumīna koagulācijai. Cieto fāzi atdala centrifugējot 5000 g, 20 °C temperatūrā un atkārtoti izšķīdina dejonizētā ūdenī. Albumīna koagulācija tiek veikta divas reizes, lai palielinātu olbaltumvielu attiecību albumīna koncentrātā.
Ultraskaņas sārmainā proteīna ekstrakcija olbaltumvielu koncentrāta pagatavošanai no rīsu klijām parāda, ka ultraskaņas apstrāde rada lielāku olbaltumvielu ražu ievērojami īsākā ekstrakcijas laikā – salīdzinot ar parastajām ekstrakcijas metodēm.
Funkcionālā iNOS enzīma parauga sagatavošanas protokols
Lai iegūtu pilnībā funkcionējošu iNOS enzīmu (piemēram, zāļu skrīningam), ieteicams izmantot šādu protokolu: Šūnu suspensija jānovieto uz ledus un tiek apstrādāta ar UP100H pie 10 μm amplitūdas cikla režīmā 5 sek. Procedūra jāatkārto aptuveni 3 reizes. Atpūtas laiks starp ultraskaņas cikliem samazina temperatūras paaugstināšanos un tādējādi samazinās denaturācijas risku.
Ultraskaņas proteīnu šķīdināšana
Ultraskaņas apstrāde var paātrināt olbaltumvielu šķīdināšanas procesu, kas parasti prasa vairākas stundas. Lai nepārkarsētu paraugu un novērstu olbaltumvielu noārdīšanos un modifikācijas šķīdumos, kas satur urīnvielu, ultraskaņas pārrāvumi nedrīkst ilgt ilgāk par dažām sekundēm.
Ultrasonicator UP200Ht ar 2 mm mikrotipu S26d2 mazu paraugu apstrādei ar ultraskaņu.
Ultraskaņas iekārtas olbaltumvielu ekstrakcijai
Hielscher Ultrasonics piedāvā plašu ultraskaņas homogenizatoru klāstu šūnu, audu, baktēriju, mikroorganismu, rauga un sporu sadalīšanai.
Hielscher laboratorijas ultrasonikatori ir spēcīgi un viegli darbināmi. Radīti 24/7 darbībai, tie ir izstrādāti kā izturīgas un efektīvas laboratorijas un stenda ierīces. Visām ierīcēm enerģijas izvadi un amplitūdu var precīzi kontrolēt. Plašais piederumu klāsts paver papildu iestatīšanas iespējas. Digitālajiem ultrasonatoriem, piemēram, VialTweeter, UP200Ht, UP200St un UP400St, ir integrēta temperatūras kontrole un iebūvēta SD karte automātiskai datu ierakstīšanai.
Vairāku paraugu netiešai, bez savstarpējas piesārņošanas un vienlaicīgai ultraskaņas apstrādei mēs piedāvājam VialTweeter vai ultraskaņas CupHorn.
Zemāk redzamajā tabulā ir sniegts pārskats par mūsu ultrasonikatoriem paraugu sagatavošanai, šūnu darbības traucējumiem un ekstrakcijai. Noklikšķiniet uz ierīces veida, lai iegūtu vairāk informācijas par katru ultraskaņas homogenizatoru. Mūsu labi apmācītais un ilggadējais tehniskais personāls ar prieku palīdzēs jums izvēlēties vispiemērotāko ultrasonikatoru parauga sagatavošanai!
| Partijas apjoms | Plūsmas ātrums | Ieteicamās ierīces |
|---|---|---|
| līdz 10 flakoniem vai mēģenēm | n.p. | VialTweeter |
| Multiwell / Microtiter plāksnes | n.p. | UIP400MTP |
| vairākas caurules / trauki | n.p. | Cuphorn |
| 1 līdz 500 ml | 10 līdz 200 ml/min | UP100H |
| 10 līdz 1000 ml | 20 līdz 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 līdz 2000 ml | 20 līdz 400 ml/min | UP400St |
Atkarībā no jūsu lietojumprogrammas, materiāla un parauga apjoma mēs ieteiksim vispiemērotāko iestatījumu parauga sagatavošanai. Sazinieties ar mums jau šodien!
Sazinieties ar mums! / Jautājiet mums!
Hielscher digitālajiem ultrasonikatoriem ir pārlūkprogrammas tālvadības pults un automātiska datu protokolēšana integrētā SD kartē.
VialTweeter netiešai apstrādei ar ultraskaņu.
Fakti, kurus ir vērts zināt
Proteomika
Proteomika ir pētniecības joma, kas pēta proteīnus un proteomu. Olbaltumvielas organismā pilda plašu vitāli svarīgu funkciju klāstu. Proteoms ir viss proteīnu kopums, ko noteiktā laikā izsaka genoms, šūna, audi vai organisms. Proteoms mainās ar laiku un atšķirīgām prasībām jeb stresiem, kas tiek pakļauti šūnai vai organismam. Konkrētāk, tas ir izteiktu proteīnu kopums noteiktā šūnu vai organisma tipā noteiktā laikā, noteiktos apstākļos. Termins ir proteīnu un genoma maisījums. Proteomika ir proteoma izpēte.
olbaltumvielas
Olbaltumvielas ir lielas biomolekulas, tā sauktās makromolekulas – kas sastāv no vienas vai vairākām garām aminoskābju atlikumu ķēdēm. Olbaltumvielas ir sastopamas visos gan augu, gan dzīvnieku izcelsmes organismos, un tās ir būtiskas lielākajai daļai bioloģisko funkciju. Tā kā olbaltumvielas satur daudz bioloģiskās informācijas, tās iegūst analītiskiem mērķiem, piemēram, proteomikas pētījumiem. Svarīgākā funkcija, ko veic olbaltumvielas, ietver vielmaiņas reakciju katalīzi, DNS replikāciju, reakciju uz stimuliem un molekulu transportēšanu no vienas vietas uz otru. Olbaltumvielas atšķiras viena no otras galvenokārt ar aminoskābju secību, ko nosaka to gēnu nukleotīdu secība un kas parasti izraisa olbaltumvielu salocīšanos īpašā trīsdimensiju struktūrā, kas nosaka tā aktivitāti. Olbaltumvielas ir – Bez peptīdiem – viena no galvenajām pārtikas sastāvdaļām. Tāpēc proteomika ir spēcīgs instruments pārtikas zinātnē, lai optimizētu procesus, pārtikas nekaitīgumu un uztura novērtēšanu.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction ir pirmsanalīzes procedūra analizējamo vielu atdalīšanai un pirms koncetrāta. Kombinācijā ar ultrasonication, mākoņu punktu ieguvi var pastiprināt, padarot procesu efektīvāku, ātrāku un videi draudzīgāku. Ar ultrasonication, mākoņu punkta ekstrakcija ir ievērojami efektīvāka analīta sagatavošanas metode. Lasiet vairāk par ultrasoniski atbalstītu mākoņu punktu ieguvi!Gēla elektroforēze
Gēla elektroforēze ir galvenā metode makromolekulu, piemēram, DNS, RNS un proteīnu, kā arī to fragmentu atdalīšanai un analīzei, pamatojoties uz to lielumu un lādiņu. To izmanto klīniskajā ķīmijā, lai atdalītu proteīnus pēc lādiņa un/vai lieluma (IEF agaroze, būtībā neatkarīga no lieluma), un bioķīmijā, molekulārajā bioloģijā un proteomikā, lai atdalītu jauktu DNS un RNS fragmentu populāciju pēc garuma, lai novērtētu DNS un RNS fragmentu lielumu vai atdalītu proteīnus ar lādiņu.
šūnu kultūras
Šūnu kultūra ir kontrolēts augšanas process, kurā šūnas tiek kultivētas kontrolētos apstākļos. Šūnu kultūras apstākļi katram šūnu tipam ir atšķirīgi. Parasti šūnu kultūras vide sastāv no piemērota trauka (piemēram, Petri trauka) ar substrātu vai barotni, kas piegādā būtiskās uzturvielas (aminoskābes, ogļhidrātus, vitamīnus, minerālvielas), augšanas faktorus, hormonus un gāzes (CO2, O2), un regulē fizioķīmisko vidi (pH buferis, osmotiskais spiediens, temperatūra). Lielākajai daļai šūnu ir vajadzīga virsma vai mākslīgs substrāts, bet citas šūnu kultūras var kultivēt brīvi peldošā barotnē (suspensijas kultūra, šūnu suspensija).
Dzīvnieku šūnu līniju masveida kultūras tiek izmantotas vīrusu vakcīnu un citu biotehnoloģiski iegūtu produktu rūpnieciskajā ražošanā. Cilvēka cilmes šūnas tiek kultivētas, lai paplašinātu šūnu skaitu un transplantācijas nolūkos diferencētu šūnas dažādos somatisko šūnu tipos.
Audu paraugi
Termins audi raksturo šūnu starpproduktu, kur šūnas materiāls atrodas organizatoriskā līmenī starp šūnām un veselu orgānu. Audos tiek montētas līdzīgas šūnas no vienas izcelsmes, kas kopā veic īpašu funkciju. Ar vairāku audu funkcionālo grupēšanu veidojas sarežģītas orgānu struktūras.
Audu paraugus ņem bioloģijas, histoloģijas/histopatoloģijas, parazitoloģijas, bioķīmijas, imūnhistoķīmijas pētījumiem, kā arī DNS kultivēšanai un ekstrakcijai. To var atšķirt starp dzīvnieku (apakšnodaļa: zīdītāju audi) un augu audiem. Dzīvnieku audi ir sagrupēti četros saistaudu, muskuļu, nervu un epitēlija audu pamatveidos. Augu audi ir sadalīti šādās trīs audu sistēmās: epidermā, zemes audos un asinsvadu audos.
Audu paraugus var pagatavot no dzīvnieku vai augu daļām, piemēram, kaula, muskuļa, lapām utt.
Ķermeņa šķidrumi
Asinis, serums, plazma, cerebrospinālais šķidrums, siekalas un sinoviālais šķidrums ir ķermeņa šķidrumi, kas piedāvā lielisku diagnostikas būtiskas informācijas avotu. Tāpēc ir svarīga sarežģīta ķermeņa šķidruma paraugu sagatavošana analīzei. Pirmās grūtības ir saistītas ar plašo dinamisko komponentu klāstu, kas atrodas ķermeņa šķidrumos.
Olbaltumvielu koncentrācijas noteikšana
Bredforda tests, Lowry tests un bicinhonīnskābes (BCA) tests ir izplatīti testi, lai noteiktu proteīnu koncentrāciju. Liellopu seruma albumīns (ĶVL) ir viens no visbiežāk izmantotajiem olbaltumvielu standartiem.
līzes buferšķīdums
Līzes buferšķīdums jāizvēlas atbilstoši šūnu materiālam vai audiem (audu kultūrai, augiem, baktērijām, sēnītēm utt.) un tam, vai šūnas ir struktūrā un struktūras tipam. Plašs līzes buferu klāsts proteīnu, membrānu un organellu ekstrakcijai ir veidots ar vienu vai vairākiem mazgāšanas līdzekļiem. Mazgāšanas līdzekli parasti izvēlas, veicot izmēģinājumu un kļūdu testus vai – ja pieejams – saskaņā ar esošo olbaltumvielu ekstrakcijas protokolu. Mazgāšanas līdzeklim jābūt saderīgam ar audu avotu un olbaltumvielām. Kopumā maigākais mazgāšanas līdzeklis, kas darbojas konkrētiem audiem / olbaltumvielām, tiek izvēlēts, lai saglabātu ekstrakta maksimālo funkcionalitāti. Turklāt membrānu un organellu ekstrakcijas gadījumā maigs mazgāšanas līdzeklis saglabā membrānu neskartu. Parasti izmantotie mazgāšanas līdzekļi līzes buferos galvenokārt ir nejonu vai zwitterionic, piemēram, CHAPS, dezoksiholāts, Triton™ X-100, NP40 un Tween 20.
Piemēram, tādus audus kā smadzenes, aknas, zarnas, nieres, liesa u.c. var vienkārši buferēt ar RIPA – tomēr jāiekļauj proteāzes inhibitori un DTT (piemēram, gēla elektroforēzei).
Līzes buferšķīdums skeleta muskuļu audiem (ledus aukstums): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (m/V) glicerīns, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitols, kas papildināts ar proteāzes un fosfatāzes inhibitoru kokteili
Kopējo buferu tabula un to pH diapazons. Parasti šos buferšķīdumus parasti izmanto koncentrācijā 20-50 mM.
| Buferis | pH diapazons |
|---|---|
| Citronskābe – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Nātrija citrāts – Citronskābe | 3.0 – 6.2 |
| Nātrija acetāts – etiķskābe | 3.6 – 5.6 |
| Kakodilskābes nātrija sāls – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| TES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Nātrija dihidrogēnfosfāts – dinātrija hidrogēnfosfāts | 5.8 – 8.0 |
| imidazols – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolamīna hidrohlorīds – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Nātrija tetraborāts – borskābe | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glicīns – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Lielākajai daļai buferu ir pH atkarība no temperatūras. Tas jo īpaši attiecas uz Tris buferiem. pKa mainās no 8,06 pie 25°C uz 8,85 pie 0°C.
(buferšķīduma pH un pKa: pH mēra ūdeņraža jonu koncentrāciju ūdens šķīdumā. pKa (= skābes disociācijas konstante) ir saistīts, bet specifiskāks pasākums, jo tas palīdz paredzēt, kā molekula darbosies pie noteiktas pH vērtības.)
TRIzol
TRIzol ir ķīmisks šķīdums, ko izmanto, lai iegūtu RNS/DNS/proteīnu guanidīnija tiocianāta-fenola-hloroforma ekstrakcijas laikā. Ultrasoniski atbalstītas TRIzol ekstrakcijas izmantošana rada augstu DNS, RNS un olbaltumvielu ražu no tā paša parauga un tādējādi izceļas ar citām ekstrakcijas metodēm.
Literatūra/Atsauces
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.