Ultraskaņas līze Western Blotting

• Western blot ir analītiska procedūra specifisku olbaltumvielu noteikšanai audu homogenāta vai šūnu ekstrakta paraugā.
• Lai palaistu Western blot vai izmērītu fermentu aktivitāti, daudziem testiem ir nepieciešama piekļuve materiāliem (piemēram, olbaltumvielām, DNS, subcelulārajiem fragmentiem), kas iekļuvuši šūnā.
• Ultraskaņas apstrāde ir uzticama un viegli apstrādājama metode kontrolētiem šūnu darbības traucējumiem un līzei.

Ultraskaņas šūnu darbības traucējumi

Olbaltumvielu ekstrakcija no audiem un kultivētām šūnām ir pirmais solis daudzām bioloģiskām, bioķīmiskām un analītiskām metodēm (PAGE, Western blotting, ELISA, masas spektrometrija utt.) vai olbaltumvielu attīrīšanai. Lai iegūtu augstu olbaltumvielu daudzumu, šūnu materiāls un audi ir efektīvi jāizjauc/ jālizē. Neatkarīgi no tā, vai augu šūnas vai dzīvnieku audi, ultraskaņas apstrāde ir metode, kā viegli un ātri sagatavot šūnu lizātu.

Ultraskaņas apstrādes priekšrocības

• Ātri & Efektīvu
• Vienkārša darbība
• augsts olbaltumvielu daudzums
• reproducējams/ atkārtojams
• precīzi kontrolēts
• Mērogojams

Imūnprecipitācijas protokols Rietumu imunoblotingam

A. Reaģenti

Šķīdumu pagatavošanai izmantojiet attīrītu ūdeni, piemēram, Milli-Q.

• 1X fosfātu buferšķīdums (PBS)
• 1X šūnu līzes buferšķīdums: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM nātrija pirofosfāts, 1 mM β-glicerofosfāts, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptīns
  Svarīgi: pievienojiet 1 mM PMSF tieši pirms lietošanas.
• 15 μl proteīna A+15 μl proteīna G pietiek IP, bet tas var būt atkarīgs no jūsu primārās antivielas un parauga tilpuma. Varat arī izmantot iepriekš sajauktu proteīnu A/ G agarozi (piemēram, A proteīns trušam, IgG pull down un Protein G pelei IgG pull down)
• 3X SDS parauga buferšķīdums: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 pie 25 ° C), 6% w / V SDS, 30% glicerīns, 150 mM DTT, 0.03% w / v bromfenola zils

B. Šūnu lizātu sagatavošana

• Novāc šūnas. Lai ievāktu šūnas nedenaturējošos apstākļos, noņemiet vidi un vienu reizi izskalojiet šūnas ar ledusaukstu PBS.
• Izņem fosfātu buferšķīdumu (PBS), katrai platei (10 cm) pievieno 0,5 ml ledusauksta 1X šūnu līzes buferšķīduma un 5 minūtes inkubē plates uz ledus.
• Nokasa šūnas no platēm un pārnes uz mikrocentrifūgas mēģenēm. Turieties uz ledus.
• Sonicate divas reizes 10 sekundes ledusaukstā imūnprecipitācijas buferšķīdumā (IP buferšķīdums: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 un proteāzes inhibitoru maisījums). Attiecībā uz ultraskaņu, VialTweeter vai zondes ultrasonikators, piemēram, UP100H vai UP200Ht ir vispiemērotākie.
• Lizātus centrifugē 15 000 g 10 minūtes 4 °C temperatūrā.
• Pārnes centrifugātu uz jaunu mēģeni. (Ja nepieciešams, lizātu var uzglabāt –80°C temperatūrā.)
• Centrifugātam pievieno primāro antivielu. Centrifugātu ar primāro antivielu inkubē 1 stundu 4°C temperatūrā, viegli kratot. Primārās antivielas parasti tiek pievienotas 10x koncentrētākā daudzumā, nekā tiek izmantots rietumu blotēšanai. (Jūs varat sākt ar 1μg uz 100μL.)
• Pēc tam centrifugātu vēl 1 stundu inkubē ar vienādu daudzumu proteīna A-agarozes (invitrogēna) un proteīna G agarozes maisījumu.
• Mazgājiet agarozes granulas trīs reizes ar IP buferšķīdumu. Pēc tam saistītos proteīnus ekstrahē ar SDS-PAGE ielādes buferšķīdumu, 5 minūtes karsējot 95 °C temperatūrā.

C. Imūnprecipitācija

• Ņem 200 μl šūnu lizāta un pievieno primāro antivielu. Inkubē, maigi šūpojot nakti 4°C temperatūrā.
• Pievieno vai nu olbaltumvielu Agarozes, vai G agarozes lodītes (20 μl 50% pērlīšu vircas). Inkubē ar maigu šūpošanu 1–3 stundas 4°C temperatūrā.
• Mikrocentrifugē 30 sekundes 4°C temperatūrā. Piecas reizes mazgā granulveida nogulšņu ar 500 μl 1X šūnu līzes buferšķīduma. Mazgāšanas laikā turiet uz ledus.
• Atkārtoti suspendēt lodīti ar 20 μl 3X SDS parauga buferšķīdumu. Virpulis, pēc tam mikrocentrifugē 30 sekundes.
• Paraugu karsē līdz 95–100°C 2–5 minūtes un mikrocentrifugē 1 minūti pie 14 000 x g.
• Ievietojiet paraugu (15–30 μl) uz SDS-PAGE gela (12–15%).
• Analizējiet paraugu ar Western blotting.

Western Blot analīze ar Sonicator UP50H

Pēc protokola, izmantojot zondes tipa sonikatoru UP50H, tika izmantots Kriebisch et al. (2011) pētījumā:
Kopējais proteīns tika izolēts no MC3T3-E1 šūnām, kas apstrādātas ar 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) vai transportlīdzekli. Šūnas tika lizētas ar buferšķīdumu, kas satur 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fišera zinātniskais); 0,1% nātrija dodecilsulfāts (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) un 0,5% nātrija dezoksiholāts (Merck). Šūnu lizāts tika apstrādāts ar ultraskaņu 2 × 10 s 1. ciklā un amplitūdā 80 ar UP50H ultraskaņas procesors (Hielscher, ultraskaņas tehnoloģija, Teltova, Vācija). Pēc tam materiāls tika centrifugēts 10 minūtes pie 14 000 apgr./min, un centrifugāts tika izmantots Western blotting. Divdesmit pieci μg olbaltumvielu tika vārīti parauga buferšķīdumā un reducētājā (Invitrogen) un pēc tam atdalīti ar SDS-PAGE, izmantojot 4–12% poliakrilamīda gēlus (Invitrogen), un pārnesti uz nitrocelulozes membrānu (GE veselības aprūpe). Membrāna tika bloķēta uz 1 h ar TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), kas satur 1% kazeīna (Sigma-Aldrich) un 1% Tris (1 M). Pēc bloķēšanas membrāna tika inkubēta ar nelielu uzbudinājumu nakti 4 ° C temperatūrā ar primāro antivielu (trušu anti-cilvēka CBS 1/500, izstrādāts prof. R. Banerjee laboratorijā, Ann Arbor, MI, ASV). Inkubācija ar mārrutku peroksidāzes (HPR)-konjugēto sekundāro antivielu (Dako) tika veikta 1 h istabas temperatūrā. Visi plankumi tika izstrādāti ar pastiprinātu hemiluminiscenci (Perkin Elmer).
 

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk par labāko praksi ultraskaņas šūnu līzei un ekstrakcijai, lizāta sagatavošanai un ieteikumiem procesa uzlabojumiem!
 
Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu laboratorijas lieluma ultrasonikatoru aptuveno apstrādes jaudu:

Literatūra / Atsauces