Ultraskaņas līze Western blotēšanai

• Western blotēšana ir analītiska procedūra specifisku olbaltumvielu noteikšanai audu homogenāta vai šūnu ekstrakta paraugā.
• Lai veiktu Western blotēšanu vai mērītu enzīmu aktivitāti, daudzās analīzēs ir nepieciešama piekļuve šūnā ietvertajām vielām un struktūrām (piemēram, olbaltumvielām, DNS, subcelulāriem fragmentiem).
• Apstrāde ar ultraskaņu ir uzticama un viegli izmantojama metode kontrolētai šūnu sagraušanai un līzei.

Šūnu sagraušana ar ultraskaņu

Olbaltumvielu ekstrakcija no audiem un kultivētām šūnām ir pirmais solis daudzās bioloģiskās, bioķīmiskās un analītiskās metodēs (PAGE, Western blotēšana, ELISA, masspektrometrija utt.) vai olbaltumvielu attīrīšanā. Lai iegūtu lielu olbaltumvielu iznākumu, šūnu materiāls un audi ir efektīvi jāsagrauj / jālizē. Neatkarīgi no tā, vai tās ir augu šūnas vai dzīvnieku audi, apstrāde ar ultraskaņu ļauj viegli un ātri sagatavot šūnu lizātu.

Apstrādes ar ultraskaņu priekšrocības

• ātra un efektīva
• vienkārša lietošana
• liels olbaltumvielu iznākums
• reproducējama / atkārtojama
• precīzi kontrolējama
• mērogojama

Imūnprecipitācijas protokols Western imūnblotēšanai

A. Reaģenti

Šķīdumu pagatavošanai izmantojiet attīrītu ūdeni, piemēram, Milli-Q.

• 1X fosfātu buferēts fizioloģiskais šķīdums (PBS)
• 1X šūnu līzes buferšķīdums: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM nātrija pirofosfāts, 1 mM β-glicerofosfāts, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leipeptīns
  Svarīgi: pievienojiet 1 mM PMSF tieši pirms lietošanas.
• Imūnprecipitācijai (IP) pietiek ar 15 μl proteīna A+15 μl proteīna G, taču tas var būt atkarīgs no primārās antivielas un parauga tilpuma. Varat izmantot arī iepriekš sajauktu proteīna A/ G agarozi (piemēram, proteīnu A truša IgG izgulsnēšanai un proteīnu G peles IgG izgulsnēšanai)
• 3X SDS parauga buferšķīdums: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pie 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerīns, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromfenolzilais

B. Šūnu lizātu sagatavošana

• Savāciet šūnas. Lai savāktu šūnas nedenaturējošos apstākļos, noņemiet barotni un vienu reizi noskalojiet šūnas ar ledusaukstu PBS.
• Noņemiet PBS, katrā platē (10 cm) pievienojiet 0,5 ml ledusauksta 1X šūnu līzes buferšķīduma un inkubējiet plates uz ledus 5 minūtes.
• Noskrāpējiet šūnas no platēm un pārnesiet tās mikrocentrifūgas mēģenēs. Turiet uz ledus.
• Apstrādājiet ar ultraskaņu divas reizes pa 10 sekundēm ledusaukstā imūnprecipitācijas buferšķīdumā (IP buferšķīdums: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 un proteāžu inhibitoru maisījums). Apstrādei ar ultraskaņu VialTweeter vai zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīces, piemēram, UP100H vai UP200Ht, ir vispiemērotākās.
• Centrifugējiet lizātus pie 15 000 g 10 minūtes 4°C temperatūrā.
• Pārnesiet supernatantu jaunā mēģenē. (Ja nepieciešams, lizātu var uzglabāt –80°C temperatūrā.)
• Pievienojiet supernatantam primāro antivielu. Supernatantu ar primāro antivielu inkubē 1 h 4°C temperatūrā, viegli maisot. Primāro antivielu parasti pievieno 10x lielākā koncentrācijā nekā Western blotēšanai. (Varat sākt ar 1μg uz 100μL.)
• Pēc tam supernatantu vēl 1 h inkubē ar vienādu daudzumu proteīna A agarozes (Invitrogen) un proteīna G agarozes maisījumu.
• Trīs reizes mazgājiet agarozes nogulsnes ar IP buferšķīdumu. Pēc tam ekstrahējiet saistītās olbaltumvielas ar SDS-PAGE paraugu uznešanas buferšķīdumu, karsējot 95°C temperatūrā 5 minūtes.

C. Imūnprecipitācija

• Ņemiet 200 μl šūnu lizāta un pievienojiet primāro antivielu. Inkubējiet pa nakti 4°C temperatūrā, saudzīgi šūpojot.
• Pievienojiet proteīna A vai G agarozes lodītes (20 μl 50% lodīšu suspensijas). Inkubējiet 1–3 stundas 4°C temperatūrā, saudzīgi šūpojot.
• Centrifugējiet mikrocentrifūgā 30 sekundes 4°C temperatūrā. Piecas reizes mazgājiet nogulsnes ar 500 µl 1X šūnu līzes buferšķīduma. Mazgāšanas laikā turiet uz ledus.
• Resuspendējiet nogulsnes 20 μl 3X SDS parauga buferšķīduma. Samaisiet vorteksa maisītājā, pēc tam centrifugējiet mikrocentrifūgā 30 sekundes.
• Karsējiet paraugu līdz 95–100°C 2–5 minūtes un centrifugējiet mikrocentrifūgā 1 minūti pie 14 000 X g.
• Uznesiet paraugu (15–30 μl) uz SDS-PAGE gela (12–15%).
• Analizējiet paraugu ar Western blotēšanu.

Western blotēšanas analīze ar ultraskaņas apstrādes ierīci UP50H

Kriebisch un līdzautoru (2011) pētījumā tika izmantots šāds protokols ar zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīci UP50H:
Kopējās olbaltumvielas tika izolētas no MC3T3-E1 šūnām, kas apstrādātas ar 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) vai nesējvielu. Šūnas tika lizētas ar buferšķīdumu, kas saturēja 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% nātrija dodecilsulfāta (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) un 0,5% nātrija deoksiholāta (Merck). Šūnu lizāts tika apstrādāts ar ultraskaņu 2 × 10 s ar cikla iestatījumu 1 un amplitūdu 80, izmantojot UP50H ultraskaņas procesoru (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltova, Vācija). Pēc tam materiāls tika centrifugēts 10 min pie 14 000 rpm, un supernatants tika izmantots Western blotēšanai. Divdesmit pieci μg olbaltumvielu tika vārīti parauga buferšķīdumā ar reducētāju (Invitrogen), pēc tam atdalīti ar SDS-PAGE, izmantojot 4–12% poliakrilamīda gelus (Invitrogen), un pārnesti uz nitrocelulozes membrānu (GE health care). Membrāna tika bloķēta 1 h ar TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), kas saturēja 1% kazeīna (Sigma-Aldrich) un 1% Tris (1 M). Pēc bloķēšanas membrāna tika inkubēta pa nakti 4°C temperatūrā, viegli maisot, ar primāro antivielu (truša antiviela pret cilvēka CBS, 1/500, izstrādāta prof. R. Banerjee laboratorijā Annārborā, MI, ASV). Inkubācija ar sekundāro antivielu, kas konjugēta ar mārrutku peroksidāzi (HPR) (Dako), tika veikta 1 h istabas temperatūrā. Visi bloti tika vizualizēti ar pastiprinātu hemiluminiscenci (Perkin Elmer).
 

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk par labāko praksi šūnu līzē un ekstrakcijā ar ultraskaņu, lizātu sagatavošanu un ieteikumiem procesa uzlabošanai!
 
Tālāk redzamā tabula sniedz priekšstatu par mūsu laboratorijas ultraskaņas apstrādes ierīču aptuveno apstrādes jaudu:

Literatūra / Atsauces

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.