Ultraskaņas līze Western blotting

• Rietumu blot ir analītiska procedūra noteiktu olbaltumvielu noteikšanai audu homogenizēšanas vai šūnu ekstrakta paraugā.
• Lai palaistu Western blot vai izmērīt fermentu aktivitāti, daudzi testos ir nepieciešama piekļuve materiāliem (piemēram, proteīni, DNS, subcelulārās daļiņas), kas iesprūst šūnā.
• Ultraskaņas apstrāde ir uzticama un viegli lietojama metode kontrolēto šūnu traucējumu un līzes gadījumā.

Ultraskaņas šūnu dezorganizācija

Olbaltumvielu ieguve no audiem un kultivētām šūnām ir pirmais solis daudzu bioloģisko, bioķīmisko un analītisko metožu (PAGE, Western blotting, ELISA, masspektrometrijas u.c.) vai proteīna attīrīšanas jomā. Lai iegūtu augstu olbaltumvielu daudzumu, šūnu materiāls un Audi ir efektīvi jāizskalo/jānoārdo. Vai augu šūnu vai dzīvnieku Audi, ultraskaņu ir metode, lai sagatavotu savu šūnu lizate viegli un ātri.

Priekšrocības Sonication

• Ātri & Efektīvu
• Viegla ekspluatācija
• augsts olbaltumvielu ienesīgums
• reproducjami/atkārtojami
• precīzi kontrolēts
• Mērogojams

Imunoprecisirdsklauves protokols rietumu Imunoblotting

A. reaģenti

Šķīdumu sagatavošanai jāizmanto attīrīts ūdens, piemēram, Milli-Q.

• 1X fosfāta buferšķīdums (PBS)
• 1X šūnu līzes buferšķīdums: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM nātrija pirofosfāts, 1 mM β-glicerofosfāts, 1 mM Na3VO4 μg/ml Leupeptin
  Svarīgi: pievienojiet 1 mM PMSF tieši pirms lietošanas.
• 15 μl proteīns A + 15 μl proteīns G ir pietiekams IP, bet tas var būt atkarīgs no jūsu primārās antivielas un parauga tilpuma. Jūs varat izmantot arī iepriekš sajauktus A/G agpiecēlās (piemēram, A proteīna A trušu IgG, pavelciet uz leju un olbaltumvielu G peļu IgG novelk uz leju)
• 3X SDS parauga buferšķīdums: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pie 25 ° c), 6% w/v SDS, 30% glicerīna, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromfenola zilā

B. Cell Lysates sagatavošana

• Raža šūnas. Lai ievāktu šūnas ar nedenaturēšanas nosacījumiem, vienreiz noņemiet datu nesēju un skalojiet šūnas ar ledus aukstā PBS.
• Noņem PBS un pievieno 0,5 ml ledus auksta šūnu sabrukšanas buferšķīduma katrai plātnei (10 cm) un 5 minūtes inkubē uz ledus.
• Nokasa šūnas no plāksnēm un pārnes uz mikrocentrifūgas caurulēm. Turēt uz ledus.
• Sonicate divreiz 10 sekundes ledus aukstā imūnoprecipšanas buferšķīdumā (IP buferšķīdums: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 un proteāzes inhibitoru maisījums). Apstrādei ar ultraskaņu, VialTweeter vai zondes ultrasonikatoru, piemēram, UP100H vai UP200Ht ir vispiemērotākās.
• Centrifugē lysates pie 15 000 g 10 minūtes 4 ° c temperatūrā.
• Pārnes centrifugātu uz jaunu cauruli. (Ja nepieciešams, lizātu var uzglabāt – 80 ° c temperatūrā.)
• Pievienot primāro antivielu pret centrifugātu. Centrifugātu ar primāro antivielu inkubē 1 stundu 4 ° c temperatūrā, viegli sakratot. Primary antivielu parasti pievieno summu 10x vairāk koncentrētas nekā tiek izmantots rietumu blotting. (Jūs varat sākt ar 1 ģg/100 μL.)
• Pēc tam centrifugātu inkubē tālāk ar vienādu daudzumu olbaltumvielu A-agcēlās (Invitrogen) un Proteīng agarozes maisījumu vēl 1 stundu.
• Nomazgāt agarozes granulas trīs reizes ar IP buferi. Pēc tam ekstrahē saistošās olbaltumvielas ar SDS-lapas ielādes buferšķīdumu, karsējot 95 ° c temperatūrā 5 minūtes.

C. Imunoprecisirdsklauves

• Lietojiet 200 μl šūnu lizāta un pievienojiet primāro antivielu. Inkubē, viegli šūpojot nakti pie 4 ° c.
• Pievieno vai nu A, vai G agarozes lodītes (20 μl 50% lodveida vircas). Izturēt viegli šūpojot 1 – 3 stundas 4 ° c temperatūrā.
• Mikrocentrifūgas 30 sekundes 4 ° c temperatūrā. Nomazgāt ekstrakta koncentrātu piecas reizes ar 500 μl 1X šūnu līzes buferšķīduma. Turēt uz ledus laikā mazgāšana.
• Atkārtoti suspendē ekstrakta koncentri ar 20 μl 3X SD parauga buferšķīdumu. Vortex, tad mikrocentrifūgas uz 30 sekundēm.
• Paraugu uzkarsē līdz 95 – 100 ° c 2 – 5 minūtes un mikrocentrifūgas 1 minūti pie 14 000 X g.
• Paraugu (15 – 30 μl) ielādē SDS-PAGE Gel (12 – 15%).
• Analizējiet paraugu ar Western blotting.

Western blot analīze ar ultraskaņotājs UP50H

Pēc protokola tika izmantots pētījumā Kriebisch et al. (2011):
Kopējais proteīns tika izolēts no MC3T3-E1 šūnām, ko ārstēja ar 1,25 (OH)₂D₃ (10 līdz^{− 8} M) vai transportlīdzekli. Šūnas ar buferšķīdumu, kas satur 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fišera zinātniskā); 0,1% nātrija dodecilsulfāts (SDS) (Fišera zinātniskā); 1% igepal CA-630 (Sigma-Aldrich) un 0,5% nātrija deoksiholātu (Merck). Šūnu lizāts bija apstrādāt ultraskaņu 2 × 10 s ciklā 1 un amplitūda 80 ar UP50H ultraskaņas procesors (Hielscher, ultraskaņas tehnoloģija, Teltow, Vācija). Pēc tam materiāls tika centrifugēts 10 min pie 14 000 rpm un centrifugātu izmantoja Western blotting. Parauga buferšķīdumā un reducējošā reaģentā (Invitrogen) izvārīja divdesmit piecus μg proteīnu, kas pēc tam tika atdalīti ar SDS-lapu, izmantojot 4 – 12% poliakrilamīda gelu (Invitrogen) un pārnesti uz nitrocelulozes membrānu (GE veselības aprūpe). Membrānu nobloķēja 1 h ar TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), kas satur 1% kazeīna (Sigma-Aldrich) un 1% tris (1 M). Pēc bloķēšanas membrāna tika inkubēta ar vieglu uzbudinājumu pa nakti 4 ° c temperatūrā ar primāro antivielu (trušu pretcilvēka CBS 1/500, kas izstrādāts laboratorijā Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ASV). Inkubācijas ar mārrutku peroksidāzes (HPR_PROBL) konjugētu sekundāro antivielu (Dako) veica 1 stundu istabas temperatūrā. Visi blot fotogrāfijas tika izstrādāti ar pastiprinātu hemiluminescence (Perkin Elmer).

Literatūra/atsauces