Paraugu sagatavošana ar ultraskaņu ELISA analīzēm

Tādas analīzes kā ELISA plaši izmanto in vitro diagnostikā, ar slimībām saistītu olbaltumvielu noteikšanā un kvalitātes kontrolē (piemēram, pārtikas alergēnu uzraudzībā). Paraugu sagatavošana ar ultraskaņu ir ātra, uzticama un reproducējama metode šūnu lizēšanai un intracelulāro olbaltumvielu, DNS, RNS un organoīdu izolēšanai. Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus ultraskaņas risinājumus ērtai atsevišķu paraugu, vairāku flakonu, kā arī mikrotitrēšanas plašu un 96 iedobju plašu sagatavošanai.

ELISA – ar enzīmu saistītā imūnsorbcijas analīze

ELISA apzīmē ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas analīzi, un tā ir plaši izmantota bioķīmiskās analīzes metode, kas pieder pie ligandu saistīšanās analīzēm. ELISA analīzē šķidru paraugu pievieno stacionārai cietajai fāzei ar īpašām saistīšanas īpašībām. Parasti stacionāro cieto fāzi uzklāj kā pārklājumu iedobju platei vai ELISA platei. Pēc tam secīgi pievieno dažādus šķidrus reaģentus, inkubē un mazgā, līdz beigās iedobē esošajā šķidrumā rodas optiskas izmaiņas (piemēram, enzīma katalizētas reakcijas produkts rada krāsojumu). Optiskās izmaiņas ļauj izmērīt analīta daudzumu, veicot tā saukto kvantitatīvo „nolasīšanu”. Kvantitatīvai nolasīšanai izmanto spektrofotometru, fluorometru vai luminometru, lai noteiktu un izmērītu cauri izvadītās gaismas intensitāti. Noteikšanas jutību ietekmē signāla pastiprināšana analītisko reakciju laikā. Tā kā enzīmu katalizētās reakcijas ir labi izpētīti un uzticami signāla pastiprināšanas procesi, signāla radīšanai izmanto enzīmus. Enzīmi ir saistīti ar noteikšanas reaģentiem fiksētās proporcijās, lai nodrošinātu precīzu kvantitatīvu noteikšanu, un tas izskaidro arī nosaukumu „ar enzīmu saistītā” imūnsorbcijas analīze.
Tā kā ELISA analīzes veic mikrotitrēšanas platēs / 96 iedobju platēs, tā ir pazīstama kā uz platēm balstīta analīzes metode, un to izmanto, piemēram, klīniskajā in vitro diagnostikā, pētniecībā, zāļu izstrādē utt., lai noteiktu antivielu, peptīdu, olbaltumvielu un hormonu klātbūtni un daudzumu.
ELISA metodi bieži izmanto kā diagnostikas rīku medicīnā, biotehnoloģijā un augu patoloģijā, un tā ir arī svarīga kvalitātes kontroles mērījumu metode vairākās nozarēs.

Paraugu sagatavošana ar ultraskaņu pirms ELISA

Pirms ELISA analīzes veikšanas paraugiem nepieciešami tādi sagatavošanas posmi kā šūnu lizēšana un intracelulāro olbaltumvielu, DNS, RNS utt. ekstrakcija. Šūnu lizēšanas un olbaltumvielu izolēšanas ar ultraskaņu priekšrocības ir augsta efektivitāte, uzticamība un reproducējamība. Visi šie faktori ir svarīgi, lai iegūtu augstas kvalitātes diagnostikas un pētniecības rezultātus

Šūnu lizēšanas ar ultraskaņu protokols pirms ELISA

• Šūnu kultūrām: Pirms šūnu lizēšanas ar ultraskaņu centrifugējiet šūnas mikrocentrifūgā 5 minūtes pie 270 x g. Atsūciet supernatantu un atkārtoti suspendējiet šūnas 30 – 100 μL RIPA buferšķīduma. Pēc tam inkubējiet šūnu nogulsnes uz ledus 30 min.
• Tagad šūnu paraugs ir gatavs lizēšanai ar ultraskaņu:
  Izmantojiet zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīci (piemēram, UP200Ht ar S26d2 zondi) vai ultraskaņas ierīci vairāku paraugu apstrādei (piemēram, VialTweeter līdz 10 flakonu vienlaicīgai apstrādei ar ultraskaņu vai UIP400MPT mikrotitrēšanas platēm / 96 iedobju platēm) atkarībā no sagatavojamo paraugu skaita.
  Lai atsevišķu paraugu apstrādātu ar ultraskaņas zondi, ievietojiet šūnas 1,5 mL mikrocentrifūgas stobriņos.
• Ultraskaņas apstrādes ierīces digitālajā izvēlnē iepriekš iestatiet apstrādes ilgumu, kopējo ievadītās enerģijas daudzumu, ciklu režīmu un/vai temperatūras robežas. Tas nodrošina ļoti uzticamu apstrādi ar ultraskaņu un atkārtojamību.
• Ievietojiet sonotrodi un ieslēdziet ultraskaņas ierīci. Saudzīgi pārvietojiet ultraskaņas zondes mikrouzgali paraugā, lai paraugu vienmērīgi apstrādātu ar ultraskaņu.
  Lielākajai daļai šūnu ultraskaņas līze būs pabeigta pēc 2–4 cikliem, katrā veicot 10 sec ilgu apstrādi ar ultraskaņu.
• Pēc apstrādes ar ultraskaņu izņemiet sonotrodi no parauga. Paraugi jāinkubē uz ledus 5 min. Pēc tam centrifugējiet pie 10 000 x g 20 min, lai nogulsnētu šūnu atliekas. Pārnesiet supernatantus jaunā mikrocentrifūgas mēģenē. Marķējiet analītus un uzglabājiet -20°C temperatūrā.
• Ultraskaņas sonotrodi var tīrīt, rūpīgi noslaukot to ar spirtu vai apstrādājot ar ultraskaņu vārglāzē, kas piepildīta ar spirtu, piemēram, 70% etanolu. Visas no titāna izgatavotās ultraskaņas zondes var autoklavēt.

• Noskalojiet audus ar ledusaukstu PBS (0,01M, pH=7,4), lai rūpīgi noņemtu liekās hemolizētās asinis.
• Nosveriet audus (nieres, sirdi, plaušas, liesu utt.) un sasmalciniet tos mazos gabaliņos, kurus homogenizē PBS. Nepieciešamais PBS tilpums ir atkarīgs no audu masas. Aptuveni rēķinot, 1g audu nepieciešami apmēram 9mL PBS. PBS ieteicams pievienot nedaudz proteāžu inhibitora. (Kā alternatīvu var izmantot RIPA vai hipotonisku līzes buferšķīdumu, kas satur proteāžu un fosfatāžu inhibitoru maisījumu.)
• Atkarībā no audu izmēra to priekšapstrādei var noderēt īslaicīga apstrāde virpuļmaisītājā (aptuveni 1–2 min. ar 15 sec. impulsiem).
• Piestipriniet ultraskaņas ierīcei mikrouzgali, piemēram, S26d2. Ievietojiet parauga mēģeni ar audiem ledus vannā.
• Apstrādājiet paraugu ar ultraskaņas ierīci, piemēram, UP200St (80% amplitūda), 1 min. impulsa režīmā (15sec darbība, 15sec pauze). Turiet paraugu ledus vannā.
• Pēc tam homogenātus centrifugē, lai iegūtu noteiktas frakcijas (citosolisko, kodolu, mitohondriālo vai lizosomālo) un tādējādi palielinātu olbaltumvielu koncentrāciju analīzei. Centrifugējot paraugu 5 minūtes pie 5000×g, iegūst supernatantu.

Uzticama temperatūras kontrole apstrādes laikā ar ultraskaņu

Temperatūra ir būtisks procesu ietekmējošs faktors, kas ir īpaši svarīgs bioloģisko paraugu apstrādē, piemēram, lai novērstu olbaltumvielu termisko noārdīšanos. Tāpat kā visas mehāniskās paraugu sagatavošanas metodes, arī apstrāde ar ultraskaņu rada siltumu. Tomēr, izmantojot Hielscher Ultrasonics ierīces, paraugu temperatūru var labi kontrolēt. Piedāvājam dažādas iespējas uzraudzīt un kontrolēt paraugu temperatūru, sagatavojot tos pirms analīzes ar zondes tipa ultraskaņas ierīci vai VialTweeter.

1. Parauga temperatūras uzraudzība: visi Hielscher digitālie ultraskaņas procesori ir aprīkoti ar viedu programmatūru un pievienojamu temperatūras sensoru. Pievienojiet temperatūras sensoru ultraskaņas ierīcei (piemēram, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, daudziedobīšu plašu ultraskaņas ierīcei UIP400MTP) un ievietojiet temperatūras sensora galu vienā no paraugu mēģenēm. Izmantojot digitālo krāsu skārienekrānu, ultraskaņas procesora izvēlnē varat iestatīt konkrētu temperatūras diapazonu parauga apstrādei ar ultraskaņu. Ultraskaņas ierīce automātiski apstāsies, sasniedzot maksimālo temperatūru, un ieturēs pauzi, līdz parauga temperatūra pazemināsies līdz iestatītās temperatūras ∆ apakšējai vērtībai. Pēc tam apstrāde ar ultraskaņu automātiski atsāksies. Šī viedā funkcija novērš siltuma izraisītu noārdīšanos.
2. Vairāku paraugu ultraskaņas ierīces VialTweeter titāna bloku, kurā ievieto paraugu mēģenes, var iepriekš atdzesēt. Ievietojiet VialTweeter bloku (tikai sonotrodi bez pārveidotāja!) ledusskapī vai saldētavā, lai iepriekš atdzesētu titāna bloku un tādējādi aizkavētu temperatūras paaugstināšanos paraugā. Ja iespējams, arī pašu paraugu var iepriekš atdzesēt.
3. Dzesēšanai apstrādes ar ultraskaņu laikā izmantojiet ledus vannu vai sauso ledu. Apstrādes ar ultraskaņu laikā ievietojiet parauga mēģeni vai mēģenes ledus vannā. Izmantojot VialTweeter, piepildiet seklu paplāti ar sauso ledu un novietojiet VialTweeter uz sausā ledus, lai siltums varētu ātri izkliedēties.

Klienti visā pasaulē izmanto Hielscher zondes tipa ultraskaņas ierīces, kā arī vairāku paraugu apstrādei ar ultraskaņu paredzētās ierīces VialTweeter un UIP400MTP ikdienas paraugu sagatavošanas darbā bioloģiskajās, bioķīmiskajās, medicīniskajās un klīniskajās laboratorijās. Hielscher procesoru viedā programmatūra un temperatūras kontroles funkcija nodrošina uzticamu temperatūras kontroli un novērš karstuma izraisītu paraugu degradāciju. Paraugu sagatavošana ar Hielscher ultraskaņas risinājumiem nodrošina ļoti uzticamus un reproducējamus rezultātus!
Lasiet vairāk par apstrādi ar ultraskaņu ar augstu paraugu apstrādes ražību, izmantojot analīzēm paredzēto daudziedobju plašu ultraskaņas ierīci UIP400MTP!