Ultraskaņas paraugu sagatavošana ELISA testiem
Tādus testus kā ELISA testus plaši izmanto in vitro diagnostikai, ar slimību saistītai olbaltumvielu noteikšanai un kvalitātes kontrolei (piemēram, pārtikas alergēnu uzraudzībai). Ultraskaņas paraugu sagatavošana ir ātra, uzticama un reproducējama metode, lai kārtētu šūnas un izolētu starpšūnu proteīnus, DNS, RNS un organeles. Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus ultraskaņas risinājumus ērtai atsevišķu paraugu, vairāku flakonu, kā arī mikrotitru plākšņu un 96 ied well plates sagatavošanai.
Elisa – Enzīmu imūnsorbatora tests
ELISA apzīmē ar enzīmiem saistītu imūnsorbētāja testu, un tā ir plaši izmantota liganda saistīšanas testu kategorijas bioķīmiskās analīzes metode. ELISA testā šķidru paraugu pievieno stacionārai cietai fāzei ar īpašām saistīšanas īpašībām. Parasti stacionāro cieto fāzi uzklāj kā pārklājumu uz ai plāksnes vai ELISA plāksnes. Pēc tam secīgi pievieno dažādus šķidros reaģentus, inkubē un mazgā tā, lai beidzot būtu optiskās izmaiņas (piemēram, fermentatīvas reakcijas produkta krāsu attīstība) gala šķidrumā iedobē. Optiskās izmaiņas ļauj izmērīt analizējamās vielas daudzumu ar tā saukto kvantitatīvo “lasījumā". Kvantitatīvai nolasījumam izmanto spektrofotometru, fluormetru vai luminiometru, lai noteiktu un izmērītu caurplūdes gaismas intensitāti. Noteikšanas jutīgumu ietekmē signāla pastiprināšana analītisko reakciju laikā. Tā kā enzīmu reakcijas ir labi izpētītas un uzticami pastiprināšanas procesi, signāla iemiesošanā tiek izmantoti fermenti. Fermenti ir saistīti ar noteikšanas reaģentiem noteiktās proporcijās, lai varētu precīzi noteikt kvantitatīvo noteikšanu, kas izskaidro arī nosaukumu "ar fermentu saistīta" imūnsorbatorpreses noteikšana.
Tā kā ELISA testus veic mikrotitrēšanas platēs/ 96 iedu platēs, to sauc par uz plates bāzes pārbaudes tehniku, un to izmanto, piemēram, klīniskajā in vitro diagnostikā, izpētē, zāļu izstrādē utt.
ELISA metodi bieži izmanto kā diagnostikas instrumentu medicīnā, biotehnoloģijā, augu patoloģijā, un tā ir arī svarīgs kvalitātes kontroles mērījums vairākās nozarēs.
Ultraskaņas paraugu sagatavošanas vienība VialTweeter izmanto šūnu līzei un olbaltumvielu ekstrakcijai pirms ELISA testiem
Ultraskaņas paraugu sagatavošana pirms ELISA
Pirms ELISA testa veikšanas paraugiem ir jāveic šādas šūnu sabrukšanas un intracelulāro proteīnu, DNS, RNS u.c. ekstrakcijas posmi. Ultraskaņas šūnu līzes un olbaltumvielu izolācijas priekšrocība ir tās augstā efektivitāte, uzticamība un reproducējamība. Visi šie faktori ir svarīgi, lai iegūtu augstas kvalitātes diagnostiku un pētījumu rezultātus
- Homogēna paraugu apstrāde
- Pilnīga analīze
- Pilnīga olbaltumvielu ekstrakcija (piemēram, antivielas, DNS)
- Optimāla pielāgošana šūnu tipam
- Jebkuram parauga lielumam
- Atkārtojamam
- Temperatūras kontrolēts
- Automātiska datu protokoluēšana SD kartē
Protokols iepriekš ELISA ultraskaņas šūnu analīzei
- Šūnu kultūrām: Pirms ultraskaņas šūnu analīzes centrifugējiet šūnas 5 min. pie 270 x g mikrocentrifūgā. Centrifugātu izņemot ar aspirāciju un atkārtoti apturot šūnas 30–100 μl RIPA buferšķīduma. Pēc tam inkubē šūnu granulu uz ledus 30 minūtes.
- Tagad šūnu paraugs ir gatavs ultraskaņas analīzei:
Izmantojiet zondes tipa ultrasonatoru (piemēram, UP200Ht ar S26d2 zondi) vai ultraskaņas daudzgarauga ierīce (piemēram, VialTweeter vienlaicīgai apstrādei ar ultraskaņu līdz 10 flakoniem vai UIP400MPT mikrotitrēšanas plāksnēm / 96-urbuma plāksnes) atkarībā no paraugu daudzuma, kas jums jāsagatavo.
Viena parauga zondes tipa ultra sonication 1,5 ml mikrocentrifūgas caurulēs iesēj šūnas. - Iepriekš iestatiet ultraskaņas ilgumu, kopējo enerģijas ievadi, cikla režīmu un / vai temperatūras ierobežojumus ultrasonatora digitālajā izvēlnē. Tas nodrošina ļoti uzticamu ultraskaņu un atkārtojamību.
- Ieiet sonotrodu un ieslēdziet ultraskaņas ierīci. Uzmanīgi pārvietojiet ultraskaņas zondes mikrogalu caur paraugu, lai paraugu vienmērīgi apstrādātu ar ultraskaņu.
Lielākajai daļai šūnu ultraskaņas līze tiks pabeigta pēc 2 -4 cikliem ar 10 sek. - Pēc ultraskaņas apstrādes izņemiet sonotrodu no parauga. Paraugi 5 minūtes jāinkubē uz ledus. Tad centrifugē 10 000 x g 20 min, lai granulu gružus. Virspusējus pārnes jaunā mikrocentrifūgas caurulē. Uzmarķējiet analizējamās vielas un uzglabājiet temperatūrā -20°C.
- Ultraskaņas sonotrodu var tīrīt, noslaukot to pareizi ar spirtu vai ar ultraskaņu vārglāzē, kas piepildīta ar spirtu, piemēram, 70% etanolu. Visas ultraskaņas zondes, kas izgatavotas no titāna, ir autoklavējamas.
Olbaltumvielu ekstrakcija no E.coli šūnām ar ultraskaņas zonde UP200St
- Izskalot audus ar ledus aukstu PBS (0.01M, pH =7.4), lai rūpīgi noņemtu lieko hemolīzes asiņu daudzumu.
- Nosver audus (nieres, sirds, plaušas, liesa uc) un macerate to mazos gabaliņos, kas ir homogenizēti PBS. Nepieciešamais PBS tilpums ir saistīts ar audu svaru. Parasti 1 g audu nepieciešams apm. PbS ieteicams pievienot kādu proteāzes inhibitoru. (ALTERNATĪVI VAR izmantot pipA vai hipotonalīzes buferšķīdumu, kas satur proteāzes un fosfatāzes inhibitoru kokteili.)
- Atkarībā no audu lieluma, īsa virpuļplūsmas ārstēšana (apm. 1-2 min. 15 sek.
- Uzstādiet mikrogalu, piemēram, S26d2, savam ultrasonatoram. Parauga mēģeni iemaida ar audiem ledus vannā.
- Sonicējiet paraugu ar savu ultrasonatoru, piemēram, UP200St (80% amplitūda) 1 min. impulsa režīmā (15sec on, 15sec pause). Paraugu glabā ledus vannā.
- Pēc tam homogenātus centrifugē, lai iegūtu īpašus baseinus (citozolus, kodolu, mitohondrijus vai lysosomālus), lai bagātinātu olbaltumvielas analīzei. Centrifugējot paraugu 5 minūtes ar 5000× g, iegūst centrifugātu.
Sonotrode MTP-24-8-96 ir astoņas ultraskaņas zondes mikrotitrēšanas plākšņu akmeņu apstrādei.
Uzticama temperatūras kontrole ultraskaņas apstrādes laikā
Temperatūra ir būtisks procesu ietekmējošais faktors, kas ir īpaši svarīgs bioloģisko paraugu apstrādei, piemēram, lai novērstu olbaltumvielu termisko noārdīšanos. Tā kā visas mehāniskās paraugu sagatavošanas metodes, ultraskaņas apstrāde rada siltumu. Tomēr paraugu temperatūru var labi kontrolēt, izmantojot Hielscher Ultrasonics ierīces. Mēs piedāvājam jums dažādas iespējas, kā kontrolēt un kontrolēt savu paraugu temperatūru, sagatavojot tos ar zondes tipa ultrasonatoru vai VialTweeter iepriekš analītiski.
- Parauga temperatūras uzraudzība: Visi Hielscher digitālie ultraskaņas procesori ir aprīkoti ar inteliģentu programmatūru un iespraudamu temperatūras sensoru. Iespraudiet temperatūras sensoru ultraskaņas ierīcē (piemēram, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) un ievietojiet temperatūras sensora galu vienā no parauga caurulēm. Izmantojot digitālu krāsu skārienatstādu, ultraskaņas procesora izvēlnē varat iestatīt konkrētu temperatūras diapazonu jūsu parauga ultraskaņas apstrādei. Ultrasonicator automātiski apstāsies, kad maksimālā temperatūra ir sasniegta, un pauze, līdz parauga temperatūra ir uz leju līdz iestatītās temperatūras zemāko vērtību, kas ∆. Tad ultraskaņas apstrāde atkal sākas automātiski. Šī viedā funkcija novērš karstuma izraisītu noārdīšanos.
- Attiecībā uz ultraskaņas vairāku paraugu vienību VialTweeter, titāna bloku, kas tur parauga mēģenes, var iepriekš atdzesēt. Ievietojiet VialTweeter bloku (tikai sonotrodu bez zondi!) ledusskapī vai saldētavā, lai iepriekš atdzesētu titāna bloku, palīdz atlikt temperatūras paaugstināšanos paraugā. Ja iespējams, paraugu var iepriekš atdzesēt too.
- Izmantojiet ledus vannā vai sausā ledus atdzist laikā ultraskaņu. Ievietojiet paraugu cauruli(-es) ultraskaņas apstrādes laikā ledus vannā. VialTweeter izmantojiet seklu paplāti, kas piepildīta ar sausu ledu, un novietojiet VialTweeter uz sausā ledus, lai karstums varētu ātri izkliedēties.
Klienti visā pasaulē izmanto Hielscher zondes ultrasonatorus, kā arī daudzzīmīkla ultraskaņas vienības VialTweeter un UIP400MTP ikdienas paraugu sagatavošanas darbam bioloģiskās, bioķīmiskās, medicīnas un klīniskās laboratorijās. Hielscher procesoru inteliģentā programmatūra un temperatūras kontrole, temperatūra tiek droši kontrolēta un izvairīties no karstuma izraisītas paraugu degradācijas. Ultraskaņas paraugu sagatavošana ar Hielscher ultraskaņas šķīdumiem nodrošina ļoti uzticamus un reproducējamus rezultātus!
Sazinies ar mums! / Uzdot mums!
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus lietojumprogrammu sajaukšanai, dispersijai, emuulģēšanai un ekstrakcijai laboratorijā, pilotā un rūpnieciskajā mērogā.
Literatūra/atsauces
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Fakti ir vērts zināt
ELISA testu veidi
Ir vairāki ELISA veidi, kas atšķiras pēc to darbības principa. Tos sauc par tiešu ELISA, netiešo ELISA, sviestmaižu ELISA, konkurējošā ELISA un reversā ELISA. Zemāk mēs piedāvājam jums pārskatu par dažādiem ELISA veidiem un to galvenajām īpašībām un atšķirībām.
ELISA testu var veikt kvalitatīvā vai kvantitatīvā formātā. Kvalitatīvie rezultāti nodrošina vienkāršu pozitīvu vai negatīvu rezultātu, bet kvantitatīvajā ELISA testā parauga optisko blīvumu (OD) salīdzina ar standarta līkni, kas parasti ir mērķa molekulas zināmas koncentrācijas šķīduma sērijveida atšķaidījums.
Tiešais ELISA
Tiešais ELISA tests ir visvienkāršākā Elisa testa forma, kurā izmanto tikai ar enzīmiem marķētas primārās antivielas un sekundārās antivielas nav nepieciešamas. Primārā antiviela, kas apzīmēta ar enzīmu, tieši saistās ar mērķa, t.i., antigēnu. Buferētu antigēna šķīdumu pievieno katrai mikrotitrēšanas plates iedegai (parasti 96 iedu plāksnēm, ELISA plāksnēm), kur ar lāpīšanas mijiedarbību pielīp plastmasas virsmai. Ja enzīms, kas saistīts ar primāro antivielu, reaģē ar tā substrātu, tas rada redzamu signālu, ko var izmērīt ar spektrofotometru, fluormetru vai luminiometru.
Netiešais ELISA tests
Netiešajam ELISA testam ir nepieciešama gan primārā antiviela, gan sekundārā antiviela. Tomēr, pretēji tiešajam ELISA testam, nevis primārā antiviela, bet sekundārā antiviela ir apzīmēta ar fermentu. Antigēns ir imobilizēts līdz urbu plāksnei un saistīts ar primāro antivielu. Pēc tam ar enzīmu apzīmētā sekundārā antiviela saistās ar primāro antivielu. Visbeidzot, ferments, kas saistīts ar sekundāro antivielu reaģē ar tā substrātu, lai radītu redzamu signālu, ko var atklāt.
Sendvičs ELISA
Lai gan tiešajos un netiešajās ELISA testos antigēns tiek imobilizēts un pārklāts ar aku plāksnes virsmu, tad ELISA sendviča ELISA antiviela ir imobilizēta uz ELISA plāksnes plastmasas virsmas. Imobilizētās antivielas sviestmaižu ELISA testā sauc par uztveršanas antivielām. Papildus uztveršanas antivielām, sendviča ELISA gadījumā ir nepieciešamas arī tā sauktās noteikšanas antivielas. Noteikšanas antivielas ietver nemarķētu primāro noteikšanas antivielu un ar enzīmiem iezīmētu sekundāro noteikšanas antivielu.
Pakāpeniski interesējošo antigēnu saista ar sasalšanas antivielu, kas ir imobilizēta ar plati. Tad primārā noteikšanas antiviela saistās ar antigēnu. Pēc tam sekundārā noteikšanas antiviela saistās ar primāro noteikšanas antivielu. Pēdējā reakcijas posmā ferments reaģē ar tā substrātu, lai radītu redzamu signālu, ko var noteikt optiski.
Konkurētspējīgs ELISA tests
Konkurētspējīgs ELISA, kas pazīstams arī kā inhibīcijas ELISA, ir vissarežģītākais ELISA tips, jo tas ietver inhibitora antigēna lietošanu. Katru no trim tiešajiem, netiešajiem un sviestmaižu ELISA testiem var pielāgot konkurējošā ELISA formātam. Konkurējošā ELISA testā inhibitora antigēns un interešu antigēns konkurē par saistīšanos ar primāro antivielu.
Konkurētspējīgam ELISA testam nemarķētas antivielas inkubē tā antigēna klātbūtnē, t. i., paraugā. Šos saistītos antivielu/antigēnu kompleksus pēc tam pievieno labi pārklātam antigēnam.
Plāksni mazgā tā, lai tiek noņemtas nesaistītās antivielas. Konkurētspējīgam ELISA testam ir nosaukums, jo paraugā ir vairāk antigēna, veidojas vairāk antigēnu antivielu kompleksu. Tas nozīmē, ka ir pieejams mazāk nesaistītu antivielu, kas varētu piesaistīties antigēnam akojā, un antigēniem jākonkurē par pieejamām antivielām. Pievieno sekundāru antivielu, kas atbilst primārajai antivielai. Šī otrā antiviela ir saistīta ar enzīmu. Pievienojot substrātu, atlikušie fermenti rada hromogēnu vai fluorescējošu signālu.
Šajā brīdī reakcija tiek pārtraukta, lai izvairītos no signāla iespējamās piesātinājuma.
Daži konkurējoši ELISA komplekti ietver ar enzīmiem saistītu antigēnu, nevis ar enzīmu saistītu antivielu. Marķētais antigēns konkurē par primārās antivielu saistīšanas vietām ar parauga antigēnu (bez etiķetes). Jo mazāk antigēna paraugā, jo vairāk marķēts antigēns tiek saglabāts iedozē un jo spēcīgāks signāls.
Reversais ELISA tests
Reversais ELISA neizmanto urbumu plāksnes, bet atstāj testa šķidrumā suspendētos antigēnus. Reversais ELISA tests mēra saistītās antivielas daudzumu ar antigēnu. Tā tika īpaši izstrādāta, lai noteiktu un izpētītu Rietumnīlas vīrusa apvalka proteīnu un to, kā tā spēj atrast vīrusu specifiskas antivielas.
Fermentatīvo marķieri, ko izmanto ELISA
Turpmāk sniegtajā sarakstā ir sniegti visbiežāk sastopamie fermentatīvo marķieru marķieri, ko izmanto ELISA testos, kas ļauj izmērīt pārbaudes rezultātus pēc tā pabeigšanas.
- OPD (o-fenilēndiamīna dihidrohlorīds) kļūst dzintara, lai noteiktu HRP (Mārrutku peroksidāzi), ko bieži izmanto kā konjugētu proteīnu.
- TMB (3,3 TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidīns) kļūst zils, nosakot HRP, un kļūst dzeltens pēc sērskābes vai fosforskābes pievienošanas.
- Abts (2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiazolīn-6-sulfonskābe]-diamonija sāls) kļūst zaļš, nosakot HRP.
- PNPP (p-nitrofenilfosfāts, dinātrija sāls) kļūst dzeltens, nosakot sārmainās fosfatāzes.