Ultraskaņas paraugu sagatavošana ELISA testiem
Tādus testus kā ELISA tests plaši izmanto in vitro diagnostikā, ar slimību saistītu proteīnu noteikšanā un kvalitātes kontrolē (piemēram, pārtikas alergēnu uzraudzībai). Ultraskaņas paraugu sagatavošana ir ātra, uzticama un reproducējama metode, lai lizētu šūnas un izolētu intracelulāros proteīnus, DNS, RNS un organellus. Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus ultraskaņas risinājumus, lai ērti sagatavotu atsevišķus paraugus, vairākus flakonus, kā arī mikrotitrēšanas plāksnes un 96 urbumu plāksnes.
ELISA – Enzīmu imūnsorbcijas tests
ELISA apzīmē ar fermentiem saistītu imūnsorbcijas testu un ir plaši izmantota ligandu saistošo testu kategorijas bioķīmiskās analīzes metode. ELISA pētījumā šķidro paraugu pievieno stacionārai cietai fāzei ar īpašām saistošām īpašībām. Parasti stacionāro cieto fāzi uzklāj kā pārklājumu uz akas plates vai ELISA plāksnes. Pēc tam secīgi pievieno, inkubē un mazgā dažādus šķidrus reaģentus, lai beidzot gala šķidrumā urbumā notiktu optiskas izmaiņas (piemēram, krāsas attīstība, ko izraisa fermentatīvas reakcijas produkts). Optiskās izmaiņas ļauj izmērīt analizējamās vielas daudzumu ar tā saukto kvantitatīvo “lasīšana". Kvantitatīvajam nolasījumam izmanto spektrofotometru, fluorometru vai luminometru, lai noteiktu un izmērītu pārraidītās gaismas intensitāti. Noteikšanas jutīgumu ietekmē signāla pastiprināšana analītisko reakciju laikā. Tā kā fermentu reakcijas ir labi izpētītas un uzticami pastiprināšanas procesi, signāla radīšanai tiek izmantoti fermenti. Fermenti ir saistīti ar noteikšanas reaģentiem fiksētās proporcijās, lai nodrošinātu precīzu kvantitatīvu noteikšanu, kas izskaidro arī nosaukumu "ar fermentiem saistīts" imūnsorbcijas tests.
Tā kā ELISA testi tiek veikti mikrotitrēšanas platēs / 96 iedobju platēs, to sauc par plātņu noteikšanas metodi un izmanto, piemēram, klīniskajā in vitro diagnostikā, pētniecībā, zāļu izstrādē utt., Lai noteiktu un kvantificētu antivielas, peptīdus, olbaltumvielas un hormonus.
ELISA metodi bieži izmanto kā diagnostikas līdzekli medicīnā, biotehnoloģijās, augu patoloģijās, un tā ir arī svarīgs kvalitātes kontroles mērījums vairākās nozarēs.
Ultraskaņas paraugu sagatavošanas vienība VialTweeter izmanto šūnu līzei un olbaltumvielu ekstrakcijai pirms ELISA testiem,
Ultraskaņas paraugu sagatavošana pirms ELISA
Pirms ELISA testa veikšanas paraugiem ir nepieciešami sagatavošanas posmi, piemēram, šūnu līze un intracelulāro proteīnu, DNS, RNS u.c. ekstrakcija. Ultraskaņas šūnu līzes un olbaltumvielu izolācijas priekšrocība ir tā augstā efektivitāte, uzticamība un reproducējamība. Visi šie faktori ir svarīgi, lai iegūtu augstas kvalitātes diagnostikas un pētījumu rezultātus
- Homogēna paraugu apstrāde
- Pilnīga līze
- Pilnīga olbaltumvielu ekstrakcija (piemēram, antivielas, DNS)
- Optimāla pielāgošanās šūnu tipam
- Jebkuram parauga lielumam
- Atkārtojamam
- kontrolēta temperatūra
- Automātiska datu protokolēšana SD kartē
Protokols pre-ELISA ultraskaņas šūnu līzei
- Šūnu kultūrām: Pirms ultraskaņas šūnu līzes centrifūgas šūnas centrifugē 5 minūtes pie 270 x g mikrocentrifūgā. Aspirācijas ceļā atdala centrifugātu un atkārtoti suspendē šūnas 30 – 100 μL RIPA buferšķīduma. Pēc tam šūnu granulas inkubē uz ledus 30 min.
- Tagad šūnu paraugs ir gatavs ultraskaņas līzei:
Izmantojiet zondes tipa ultrasonikatoru (piemēram, UP200Ht ar S26d2 zondi) vai ultraskaņas vairāku paraugu ierīce (piemēram, VialTweeter vienlaicīgai ultraskaņas apstrādei līdz 10 flakoniem vai UIP400MPT mikrotitrēšanas platēm / 96 iedobju plāksnēm) atkarībā no paraugu daudzuma, kas jums jāsagatavo.
Viena parauga zondes tipa apstrādei ar ultraskaņu šūnas ievieto 1,5 ml mikrocentrifūgas mēģenēs. - Iepriekš iestatiet ultraskaņas ilgumu, kopējo enerģijas ievadi, cikla režīmu un / vai temperatūras ierobežojumus ultrasonicator digitālajā izvēlnē. Tas nodrošina ļoti uzticamu ultraskaņu un atkārtojamību.
- Ievietojiet sonotrode un ieslēdziet ultraskaņas ierīci. Viegli pārvietojiet ultraskaņas zondes mikro-galu caur paraugu, lai paraugs vienmērīgi apstrādātu ar ultraskaņu.
Lielākajai daļai šūnu ultraskaņas līze tiks pabeigta pēc 2-4 cikliem ar 10 sek ultraskaņu. - Pēc ultraskaņas apstrādes noņemiet sonotrodu no parauga. Paraugus inkubē uz ledus 5 minūtes. Pēc tam centrifugē ar 10 000 x g 20 minūtes, lai granulētu gružus. Centrifugātus pārnes uz jaunu mikrocentrifūgas mēģeni. Marķējiet analizējamās vielas un uzglabājiet -20°C temperatūrā.
- Ultraskaņas sonotrode var notīrīt, pareizi noslaukot to ar spirtu vai ultraskaņu vārglāzē, kas piepildīta ar spirtu, piemēram, 70% etanolu. Visas ultraskaņas zondes, kas izgatavotas no titāna, ir autoklavējamas.
Olbaltumvielu ekstrakcija no E.coli šūnām ar ultraskaņas zonde UP200St
- Izskalojiet audus ar ledusaukstu PBS (0,01M, pH=7,4), lai rūpīgi noņemtu liekās hemolīzes asinis.
- Nosver audus (nieres, sirdi, plaušas, liesu u.c.) un macerē tos mazos gabaliņos, ko homogenizē fosfāta buferšķīdumā. Nepieciešamais PBS tilpums ir saistīts ar audu svaru. Parasti 1g audu nepieciešams aptuveni 9ml PBS. PBS ieteicams pievienot kādu proteāzes inhibitoru. (Alternatīvi var izmantot RIPA vai hipotoniskās līzes buferšķīdumu, kas satur proteāzi un fosfatāzes inhibitoru kokteili.)
- Atkarībā no audu izmēra audu pirmapstrādei var būt noderīga īsa virpuļveida apstrāde (aptuveni 1-2 min. 15 sek. impulsos).
- Uzstādiet mikro-galu, piemēram, S26d2, uz savu ultrasonikatoru. Paraugu ņemšanas mēģeni ar audiem ievieto ledus vannā.
- Sonicate paraugu ar savu ultrasonicator, piemēram, UP200St (80% amplitūda) 1 min. impulsa režīmā (15sec ieslēgts, 15sec pauze). Paraugu glabā ledus vannā.
- Pēc tam homogenātus centrifugē, lai iegūtu specifiskas grupas (citozolskābes, kodolskābes, mitohondriju vai lizosomu), lai bagātinātu proteīnu analīzei. Centrifugējot paraugu 5 minūtes ar centrifugēšanu 5000×g g, centrifugātu iegūst.
Sonotrode MTP-24-8-96 ir astoņas ultraskaņas zondes mikrotitru plākšņu aku apstrādei ar ultraskaņu.
Uzticama temperatūras kontrole ultraskaņas apstrādes laikā
Temperatūra ir būtisks procesu ietekmējošs faktors, kas ir īpaši svarīgs bioloģisko paraugu apstrādei, piemēram, lai novērstu proteīnu termisko noārdīšanos. Tāpat kā visas mehāniskās paraugu sagatavošanas metodes, ultraskaņas apstrāde rada siltumu. Tomēr, lietojot Hielscher Ultrasonics ierīces, paraugu temperatūru var labi kontrolēt. Mēs piedāvājam jums dažādas iespējas, kā uzraudzīt un kontrolēt jūsu paraugu temperatūru, vienlaikus sagatavojot tos ar zondes tipa ultrasonikatoru vai VialTweeter pirms analīzes.
- Parauga temperatūras uzraudzība: Visi Hielscher digitālie ultraskaņas procesori ir aprīkoti ar inteliģentu programmatūru un pievienojamu temperatūras sensoru. Pievienojiet temperatūras sensoru ultraskaņas ierīcei (piemēram, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Multi-well plāksnes ultraskaņas UIP400MTP) un ievieto temperatūras sensora galu vienā no paraugu ņemšanas mēģenēm. Izmantojot digitālo krāsaino skārienekrānu, ultraskaņas procesora izvēlnē varat iestatīt noteiktu temperatūras diapazonu jūsu ultraskaņas apstrādes paraugam. Ultrasonicator automātiski apstāsies, kad tiks sasniegta maksimālā temperatūra, un pauze, līdz parauga temperatūra ir pazemināta līdz iestatītās temperatūras zemākajai vērtībai ∆. Tad ultraskaņas apstrāde atkal sākas automātiski. Šī viedā funkcija novērš siltuma izraisītu degradāciju.
- Attiecībā uz ultraskaņas vairāku paraugu vienību VialTweeter, titāna bloku, kas tur paraugu caurules, var iepriekš atdzesēt. Ievietojiet VialTweeter bloku (tikai sonotrode bez devēja!) ledusskapī vai saldētavā, lai iepriekš atdzesētu titāna bloku, kas palīdz atlikt temperatūras paaugstināšanos paraugā. Ja iespējams, arī pašu paraugu var iepriekš atdzesēt.
- Izmantojiet ledus vannu vai sausu ledu, lai atdzesētu ultraskaņas apstrādes laikā. Ievietojiet parauga mēģeni (-es) ultraskaņas apstrādes laikā ledus vannā. VialTweeter izmantojiet seklu paplāti, kas piepildīta ar sausu ledu, un novietojiet VialTweeter uz sausā ledus, lai siltums varētu ātri izkliedēties.
Klienti visā pasaulē izmanto Hielscher zondes tipa ultrasonatorus, kā arī vairāku paraugu ultraskaņas vienības VialTweeter un UIP400MTP ikdienas paraugu sagatavošanas darbam bioloģiskajās, bioķīmiskajās, medicīniskajās un klīniskajās laboratorijās. Hielscher procesoru inteliģentā programmatūra un temperatūras kontrole, temperatūra tiek droši kontrolēta un tiek novērsta siltuma izraisīta paraugu degradācija. Ultraskaņas paraugu sagatavošana ar Hielscher ultraskaņas risinājumiem nodrošina ļoti ticamus un reproducējamus rezultātus!
Lasiet vairāk par augstas caurlaidspējas ultraskaņu, izmantojot vairāku urbumu plāksnes sonikatoru UIP400MTP testiem!
Sazinieties ar mums! / Jautājiet mums!
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus sajaukšanas lietojumiem, dispersijai, emulgācijai un ekstrakcijai laboratorijā, izmēģinājuma un rūpnieciskā mērogā.
Literatūra / Atsauces
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Fakti, kurus ir vērts zināt
Kādi ELISA veidi pastāv?
Ir vairāki ELISA veidi, kas atšķiras ar to darbības principu. Tie ir pazīstami kā tiešais ELISA, netiešais ELISA, sviestmaižu ELISA, konkurējošais ELISA un reversais ELISA. Zemāk mēs piedāvājam jums pārskatu par dažādiem ELISA veidiem un to galvenajām īpašībām un atšķirībām.
ELISA testu var veikt kvalitatīvā vai kvantitatīvā formātā. Kvalitatīvie rezultāti sniedz vienkāršu pozitīvu vai negatīvu rezultātu, bet kvantitatīvā ELISA testā parauga optisko blīvumu (OB) salīdzina ar standarta līkni, kas parasti ir mērķa molekulas zināmas koncentrācijas šķīduma sērijveida atšķaidījums.
Tiešais ELISA tests
Tiešais ELISA ir visvienkāršākais Elisa testa veids, kur tiek izmantota tikai ar fermentu marķēta primārā antiviela un sekundārās antivielas nav nepieciešamas. Ar fermentu marķētā primārā antiviela tieši saistās ar mērķi, t.i., antigēnu. Buferēto antigēna šķīdumu pievieno katrai mikrotitrēšanas plates iedobei (parasti 96 iedobju plates, ELISA plates), kur lādiņa mijiedarbības rezultātā pielīp pie plastmasas virsmas. Kad ar primāro antivielu saistītais enzīms reaģē ar tā substrātu, tas rada redzamu signālu, ko var izmērīt ar spektrofotometru, fluorometru vai luminometru.
Netiešs ELISA tests
Netiešajam ELISA testam ir vajadzīga gan primārā antiviela, gan sekundārā antiviela. Tomēr, pretēji tiešajam ELISA, nevis primārā antiviela, bet sekundārā antiviela ir marķēta ar fermentu. Antigēns tiek imobilizēts uz urbuma plates un saistīts ar primāro antivielu. Pēc tam fermentu marķētā sekundārā antiviela saistās ar primāro antivielu. Visbeidzot, enzīms, kas saistīts ar sekundāro antivielu, reaģē ar tā substrātu, lai radītu redzamu signālu, ko var noteikt.
Sviestmaize ELISA
Lai gan tiešajos un netiešajos ELISA testos antigēns tiek imobilizēts un pārklāts ar urbuma plāksnes virsmu, sviestmaižu ELISA testā antiviela tiek imobilizēta pret ELISA plāksnes plastmasas virsmu. Imobilizētās antivielas sviestmaižu ELISA ir pazīstamas kā uztveršanas antivielas. Papildus uztveršanas antivielām sviestmaižu ELISA ir nepieciešamas arī tā saucamās noteikšanas antivielas. Noteikšanas antivielas ietver nemarķētu primārās noteikšanas antivielu un ar fermentu marķētu sekundārās noteikšanas antivielu.
Pakāpeniski interesējošais antigēns saistās ar uztveršanas antivielu, kas imobilizēta uz plates. Tad primārā noteikšanas antiviela saistās ar antigēnu. Pēc tam sekundārā detektēšanas antiviela saistās ar primāro noteikšanas antivielu. Pēdējā reakcijas posmā enzīms reaģē ar savu substrātu, lai radītu redzamu signālu, ko var noteikt optiski.
Konkurētspējīgs ELISA tests
Konkurējošais ELISA tests, kas pazīstams arī kā ELISA inhibīcija, ir vissarežģītākais ELISA testa veids, jo tas ietver inhibitora antigēna lietošanu. Katru no trim formātiem, tiešo, netiešo un sviestmaižu ELISA, var pielāgot konkurējošajam ELISA formātam. Konkurējošā ELISA gadījumā inhibitora antigēns un interesējošais antigēns sacenšas par saistīšanos ar primāro antivielu.
Konkurējošam ELISA testam nemarķētu antivielu inkubē tā antigēna, t.i., parauga, klātbūtnē. Pēc tam šos saistītos antivielu/antigēnu kompleksus pievieno ar antigēnu pārklātai iedobei.
Plāksni mazgā, lai noņemtu nesaistītās antivielas. Konkurētspējīgam ELISA ir savs nosaukums, jo jo vairāk antigēna ir paraugā, jo vairāk veidojas antigēna-antivielu kompleksi. Tas nozīmē, ka iedobē ir mazāk nesaistītu antivielu, kas saistās ar antigēnu, un antigēniem ir jākonkurē par pieejamo antivielu. Pievieno sekundāro antivielu, kas atbilst primārajai antivielai. Šī otrā antiviela ir saistīta ar fermentu. Pievienojot substrātu, atlikušie fermenti rada hromogēnu vai fluorescējošu signālu.
Šajā brīdī reakcija tiek pārtraukta, lai izvairītos no signāla iespējamā piesātinājuma.
Dažos konkurējošos ELISA testa komplektos ir ar fermentu saistīts antigēns, nevis ar fermentu saistīta antiviela. Marķētais antigēns konkurē par primārajām antivielu saistīšanās vietām ar parauga antigēnu (nemarķēts). Jo mazāk antigēna paraugā, jo vairāk marķēts antigēns tiek saglabāts iedobē un jo spēcīgāks ir signāls.
Reversais ELISA tests
Reversajā ELISA testā neizmanto iedobju plates, bet antigēnus suspendē testa šķidrumā. Ar reverso ELISA testu mēra saistītās antivielas daudzumu, izmantojot antigēnu. Tas tika izstrādāts īpaši, lai atklātu un izpētītu Rietumnīlas vīrusa apvalka proteīnu un to, kā tas spēj atrast vīrusam specifiskas antivielas.
Kādus fermentatīvos marķierus izmanto ELISA?
Turpmāk sniegtajā sarakstā ir norādīti visbiežāk ELISA testos izmantotie fermentatīvie marķieri, kas ļauj pēc pabeigšanas izmērīt testa rezultātus.
- OPD (o-fenilēndiamīna dihidrohlorīds) pārvērš dzintaru, lai noteiktu HRP (mārrutku peroksidāzi), ko bieži izmanto kā konjugētu proteīnu.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidīns) kļūst zils, nosakot HRP, un kļūst dzeltens pēc sērskābes vai fosforskābes pievienošanas.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiazolīn-6-sulfoskābe]-diamonija sāls) nosakot HRP, kļūst zaļš.
- PNPP (p-nitrofenilfosfāts, dinātrija sāls) kļūst dzeltens, nosakot sārmaino fosfatāzi.